大肠杆菌生长在标准条件下( 31日]。 m . acetivorans菌株,列在表 1是生长在高盐培养基(描述 32]。甲醇(125毫米)或三甲胺(50毫米)作为经济增长的能源。固体培养基含有1.5% (w / v) Bacto琼脂(BD,海德堡)。选择的嘌呤霉素转乙酰酶基因( pac圣地亚哥)嘌呤霉素(CalBiochem CA)从无菌添加,厌氧股票的最终浓度2 μ克毫升⁻¹。嘌呤模拟8-aza-2 6-diaminopurine(σ,圣路易斯,密苏里州)从无菌添加,厌氧股票的最终浓度20 μ克毫升⁻¹选择对次黄嘌呤phosphoribosyl转移酶基因( 成)。Tc或强力霉素(阿霉素)从无菌添加,厌氧股市在200年最终的浓度 μ当tc-RS-dependent M(或显示) bla翻译评估。的增长 m . acetivorans光度计的监测在578 nm (OD_578年)。

标准的分子方法被用于操纵的质粒DNA 大肠杆菌( 33]。使用的所有质粒,除了pWM321,当时 m . acetivorans和表中列出 1。自主复制(pWM321),或集成的染色体 m . acetivorans,被选为嘌呤霉素。的质粒pMR56插入 成轨迹的 m . acetivorans(通过截短等位基因同源重组)是由取代生成的 bla盒(用于选择氨苄青霉素的耐药性 大肠杆菌)从pET28a pAMG48卡那霉素抗性的磁带(+)(Novagen)。的 bla基因 大肠杆菌编码在pBR322放大了PCR没有信号肽序列,克隆pMR56,导致pBlaN。在那里, bla基因的控制下 mcrB _P( 34]。一个变种 bla之前是公认的信号肽编码序列的假定的吗 m . acetivorans鞭毛蛋白MA3061也构造和指定pBlaNFSP。质粒pMG3由取代 mcrB _P在pBlaNFSP会于长滩举行一个kb的序列前 mtaC1(MA0456)编码的corrinoid蛋白质methanol-specific甲基转移酶MT1 [ 35, 36]。获得质粒pP0145NFSP, mcrB _P在pBlaNFSP取代会于长滩举行一个kb的序列前 mtmC1(MA0145)编码的corrinoid蛋白质monomethylamine-specific甲基转移酶MT1 [ 35]。pBlaN-prom被删除了 mcrB _p获得一个向量 β内酰胺酶表达作为一种消极的控制。启动子缺失,pBlaN消化BglII心好,钝化和religated。

三个tc-RS编码质粒pBlaN_tc-RS1、pBlaN_tc-RS3 pBlaN_tc-RS5通过交叉PCR过程(构造 39]。在第一步中,两个不对称但重叠PCR片段生成。pBlaN被用作模板片段1编码 mcrB _p没有核糖体结合位点(苏格兰皇家银行)和5′tc-RS结束。pSP64-tc-minimer [ 28)编码tc-aptamer用于一代的片段2包含tc-RS苏格兰皇家银行。在第二步中,片段退火的重叠区域,放大了PCR作为一个单独的片段,使用的引物PCR(底漆pBlaN_fwd,要么tc1_RBS_rev、tc2_RBS_rev或tc3_RBS_rev,看到网上的补充材料 http://dx.doi.org/10.1155/2014/725610)。通过BglII片段被克隆,pBlaN心好。其他tc-RS编码质粒也通过交叉PCR构建过程。两个重叠的PCR片段生成序列两侧BglII,心好编码 mcrB _P- - - - - - tc- - - - - - RS- - - - - - 苏格兰皇家银行融合产生的前体构建(tc-RS2从tc-RS1 tc-RS4a从tc-RS3和tc-RS4/4b tc-RS4a),从而引入所需的核苷酸交流使用的引物(补充表S1)。

基因组DNA从 m . acetivorans是孤立的使用修改后的鲸蜡trimethylammonium bromide-NaCl方法( 40]。没有标记的染色体中插入 m . acetivorans经杂交(南部 41使用探针杂交的] bla基因。所有获得的DNA序列PCR(补充表S1)列出了引物测序证实了在阶跃恢复二极管(坏的小礼帽,德国)使用BigDye终结者循环测序协议(美国应用生物系统公司,培养)。 大肠杆菌被电穿孔转化( 42]。Liposome-mediated转变 m . acetivorans进行了描述( 38)、修改( 43]markerless记者结构插入 m . acetivorans基因组( 12]。

对于定性检测 β内酰胺酶(Bla)活动文化,细胞溶解产物,或文化上层清液,nitrocefin(美国圣地亚哥CalBiochem)从厌氧无菌添加1毫米原液(准备根据制造商的指令)20 μ在室温下M和孵化为10 ~ 30分钟。文化文化的上层清液是由离心20分钟1500×g和上层清液的转移到新的厌氧管。细胞沉淀溶解在去离子水(1/20的原始文化卷)10分钟和溶菌产物被带到原始文化与高盐介质的体积保持相同的蛋白质浓度在原始文化。Bla-dependent颜色开发/殖民地在琼脂板、nitrocefin股票从喷鼻剂容器分散到殖民地后板上 m . acetivorans了(nitrocefin不稳定超过2 - 3 h HS中)。细胞没有宽松的可行性的治疗,因为殖民地可以多尝试。Bla量化的 m . acetivorans在OD,细胞被离心收获_578年0.4 - -0.5和osmotically细胞溶解,添加分析缓冲区(100毫米磷酸钾缓冲,1毫米EDTA, pH值7.0)包含0.1 μ克毫升⁻¹DNaseI。在冰上30分钟孵化后,溶解产物被re-centrifugation清除。50 μL的清除溶解产物是添加到850年 μL分析缓冲区和平衡5分钟前在室温下测定是100年开始增加 μL 100年 μM nitrocefin解决方案。nitrocefin水解的初始速率为300秒记录在486 nm和特定Bla活动计算nitrocefin摩尔消光系数( ε 486年 = 20500⁻¹厘米⁻¹)。被纠正的值减去那些获得应变 上海步浪没有启动子(pBlaN-prom),生长在相同条件下tc-RS-carrying菌株。蛋白质浓度测定方法的布拉德福德( 44)使用牛血清白蛋白作为标准。

建立在 m . acetivorans显色记者颜色发展系统不需要氧气 bla基因 大肠杆菌被选中,是因为一个显色底物 βnitrocefin内酰胺酶,是商用。的乳沟 β内酰胺环,它经历了一个独特的颜色从黄色( 我 马克斯 ⁡ = 390年 在pH值为7.0 nm)红色( 我 马克斯 ⁡ = 486年 在pH值为7.0 nm)。此外,Bla周质的蛋白质 大肠杆菌允许其潜在分泌细胞,促进其检测。为了避免干扰plasmid-borne选择标记用于克隆 大肠杆菌与氨苄青霉素抗性分析盒式首次取代了卡那霉素抗性录音带。因此,矢量骨干不需要集成到后从染色体中删除 m . acetivorans染色体。使用这个向量(pMR56) bla基因,缺乏其自然信号肽编码序列,提出了本构methanoarchaeal强的控制 mcrB _P并放置到 m . acetivorans染色体(图 1(一))。作为外生的乳沟生色Bla基质,因此,颜色开发,需要细胞溶菌作用或Bla排泄 bla变体编码的蛋白转位信号肽(从MA3061 pBlaNFSP)也被创建并放置到 m . acetivorans染色体(图 1(一))。两个菌株合成活性Bla就是明证nitrocefin乳沟细胞溶解产物化验时(图 1 (b),“E”)。在应变合成Bla没有信号肽(pBlaN) nitrocefin乳沟是文化或文化上层清液,观察颜色在未经处理的开发文化和花中当Bla包含一个热点公认的信号肽(pBlaNFSP)。在一起,这些数据表明,(我)Bla活动 m . acetivorans是足够稳定的高盐中允许视觉检测,(ii)的氨基酸序列使用((M) WNTFSKDEKGFTG)是一种功能性蛋白出口信号 m . acetivorans,(iii) Bla 大肠杆菌是改变了 m . acetivorans细胞质膜的函数形式。颜色发展成为可见的孵化后10 ~ 30分钟。然而,长时间的潜伏期(> 3 h)导致平原温和的颜色开发中表示无生命的乳沟 β内酰胺的nitrocefin(数据未显示),这可能是由于高度降低的条件中。此外,隔夜孵化导致完全丧失任何颜色表明nitrocefin水解在这漫长的孵化。因此,nitrocefin不能包括在中期间增长的有机体。

实现增长substrate-dependent记者合成 m . acetivorans,强劲的本构 mcrB _P前 bla交换了 mtaC1 _P(pMG3),从而导致高表达的基因控制在甲醇的存在( 19), mtmC1 _P(p0145NFSP),这将导致methylamine-dependent表达的基因控制的。质粒被集成到 m . acetivoransC2A Bla合成染色体检查和由此产生的菌株。甲醇(或methylamine-dependent合成和分泌Bla的确可以观察到液体文化两株(图 2(一个))。当菌株都有在琼脂板包含的生长基质,只有殖民地的应变窝藏p0145NFSP明显规范 bla表达式(图 2 (b))。应变窝藏pMG3发达的颜色在这两种条件下(图 2 (b)),这是由于在琼脂,一些能源存在,通过甲醇利用代谢途径( 19导致甲醇利用机械的感应而生长在methylamine-containing琼脂板上。增长的电镀过程 m . acetivoransagar-free表面,其中包括在硝化纤维过滤器和过滤的细胞孵化media-soaked滤纸上,已经建立( 19),必须使用与pMG3获得殖民地不事生产Bla没有甲醇。目前,五 反式行为因素,同行,MsrB MsrC,排列,MsrE,已知的规范表达基因编码三个methanol-specific MT1亚型MtaCB1, MtaCB2, MtaCB3转录起始的水平( 45]。监管的methanol-specific MT1亚型也在转录后的级别( 46),但所涉及的因素(s)是未知的。转录组分析证明substrate-dependent mono的监管,di和trimethylamine-specific MT1亚型 m . mazeiGo1, Methanococcoides burtonii, m . acetivorans,Mtm ( 47- - - - - - 49),但因素也并不清楚。因此,本文提供融合结构将合适的工具来识别影响因素甲醇——随机功能丧失和methylamine-dependent监管的诱变 34]。因为 mtaC1 _P- - - - - - fsp- - - - - - bla融合(pMG3)表达在琼脂缺乏甲醇,其使用(至少在这些条件下)将被限制在确定突变体不表达 bla已经失去了的,突变体(一)转录激活因子(s) mtaC1 _P端依赖表达式。至于methylamine-dependent监管,正面和负面的效应物 mtmC1 _P表达式可以使用的寻求 mtmC1 _P- - - - - - fsp- - - - - - bla琼脂媒体融合(p0145NFsP)和标准。这样的努力正在进行中在我们的实验室报告,并将在别处。

古生菌和细菌一样采用两种途径蛋白质易位,Sec和乙(双精氨酸主题)通路( 50]。在前基板的展开过程中,后者把(至少部分)成熟的蛋白质。因为Bla 大肠杆菌通过证交会是周质蛋白和分泌通路,我们标记从一个公认的鞭毛蛋白的氨基端信号肽编码在吗 m . acetivorans基因组(MA3061),假设它将进行相应的途径,尽管有机体是不动的 51]。在 产甲烷球菌属物种,preflagellins的氨基端信号肽被分离的IV型prepilin肽酶则在膜易位( 52, 53]。因此,任何蛋白质容易受到Sec途径可以产生和分泌 m . acetivorans(没有信号肽),这将极大地促进净化方面付出的努力。古生菌,这样一个系统蛋白质生产过剩加上分泌迄今为止只在hyperthermophilic建立 Thermococcus kodakarensis( 54]。

监管的信使核糖核酸的翻译为古生菌天然riboswitches尚未报道。tc-RS,融合到一个群龙无首记者mRNA的嗜盐的archaeon Haloferax volcanii,完全抑制翻译即使在tc的缺席,这是作为证据,也形成了一个稳定的高盐细胞质的结构,生物( 55]。测试是否可以使用tc-RS methanoarchaea作为一种手段来控制基因的表达 独联体(图 3(一个)),其编码序列插入 mcrB _P的 mcrB _P- - - - - - 上海步浪融合(pBlaN),立即上游的苏格兰皇家银行(图 3 (b),tc-RS1),构造上 m . acetivorans染色体。Bla活动现在可以被用作衡量tc-dependent翻译的 bla信使rna(表 2)。控制相比没有tc-RS (pBlaN), bla信使核糖核酸的翻译没有tc增加了2.5倍,这并不少见,可能由于mRNA的增加稳定在一个结构化元素RNA 5′末端的细菌信使RNA ( 56]。在tc的存在,Bla活动降低了2.6倍,表明tc-bound适体干扰的翻译 bla信使rna, sterical障碍可能的苏格兰皇家银行的认可。这类似于规定观察pre-mRNA拼接同样riboswitch [ 30.]。那里,旁边的适配子是插入5′拼接的网站。监管的拼接是强烈依赖于距离的适体拼接站点和关闭阀杆的稳定性。的最佳监管pre-mRNA拼接接头时获得的网站是完全集成在关闭阀杆( 30.促使我们先后将苏格兰皇家银行前 bla的关闭阀杆tc-RS,导致构造tc-RS2 tc-RS5 2, 3, 4,分别包括和6个核苷酸(图 3 (b))。相应的配对碱基改变(图 3 (b),在紫)。包括苏格兰皇家银行的关闭阀杆1,2,3核苷酸(tc-RS1、tc-RS2 tc-RS3)先后降低Bla活动( 104年 ± 2 , 71年 ± 2 和 43 ± 5 μ毫克⁻¹、职责;见表 2)表明一般稍微降低了访问的核糖体结合位点。确凿的这个概念是苏格兰皇家银行的观察使用tc-RS5感动六核苷酸tc-RS的关闭阀杆,这几乎完全废除Bla活动(表 2)。显然,核糖体RNA元素完全封锁了从这个结构。此外,构造tc-RS2和tc-RS3 tc-RS1相比并没有显示出一种改进的监管(1.8——2.7倍)。构建tc-RS4四核苷酸关闭阀杆内的苏格兰皇家银行是特殊的,因为它导致Bla活动相比增长了10倍 mcrB _p(pBlaN)。这可能解释这个变异缺乏两个相邻CG碱基对P1出现在其他中心的关闭阀杆的结构导致不稳定( Δ G (P1 =−4.4千卡/摩尔,表 2)。尽管高Bla活动没有配体,存在tc显著降低Bla活动水平相比其他构造导致调节基因表达,“碳足迹”超过11倍。

基于tc-RS4,两个进一步的结构设计。tc-RS4a tc-RS4b,关闭阀杆被另一个细长的碱基对(tc-RS4a: GC, tc-RS4b: AU)。然而,伴随着减少额外的碱基对Bla活动不论其稳定性( 21 ± 2 和 14 ± 2 μ毫克⁻¹tc-RS4a和tc-RS4b职责)。监管在tc为2.6和2.0倍,分别构造tc-RS1-tc-RS3的范围。进一步稳定增加茎的长度9个碱基对导致进一步减少Bla合成和完全丧失tc-dependent监管(数据没有显示)。

所有tc-RS变体融合 mcrB _P这里调查6导致tc-dependent表达 bla。此外,Bla活动缺乏tc和tc-dependent监管动态范围的不同结构对所有参数测试(茎长度和稳定,苏格兰皇家银行对阀杆的位置,表 2)。的数据表明,较低的稳定关闭阀杆(没有邻近的GC碱基对)和苏格兰皇家银行的部分包含到茎Bla来说都是有益的活动和监管。这里的变异测试tc-RS4显然具有最优特征导致的监管(近12倍),这是自然发生的范围之内riboswitches控制信使核糖核酸的翻译。

作为 在活的有机体内监管tc-RS4变体是最高的配体的特异性和动态监管进一步评估。tc-RS高度特定的tc和缺乏羟基位置R₆ β,导致阿霉素,减少适配子绑定两个数量级以上(0.8 nM tc和强力霉素118 nM) ( 28]。解决特异性细胞窝藏tc-RS4构造是生长在没有或200年的存在 μ米阿霉素Bla活动之前评估。虽然存在tc在中导致ca。十二倍减少Bla活动,阿霉素没有影响Bla活动;在缺乏抗生素 340年 ± 11 μ毫克⁻¹,在阿霉素的存在 383年 ± 33 μ毫克⁻¹测定。这个观察是完全按照各自的离解常数tc-RS确定 在体外。在使用的浓度(200 μ阿霉素),形成ligand-stabilized适配子不发生由于较低的亲和力,因此 bla翻译不是压抑。很可能观察到的效应是由于低效率的阿霉素的吸收 m . acetivorans因为这种化合物有效地调和 在活的有机体内除抑制的人工 mcrB _P (tetO)/ TetR系统在这种生物 20.]。

调查riboswitch监管的动力学,细胞窝藏tc-RS4融合是生长在之前的存在越来越多的tc Bla活动决心(图 4)。显著减少Bla活动已经可以观察到7点 μM tc。Half-maximal减少 bla翻译是观察到ca。14 μM tc和50之间 μ米和100 μM tc,最大的镇压翻译实现(图 4)。这些数据符合所需的浓度在酵母完成镇压[ 27]。有趣的是,它也在同一范围的tc完全去抑制人工所需浓度 mcrB _P (tetO)/ TetR系统 在活的有机体内70年(ca。 μ米)( 20.]。