小说诱导蛋白生产系统和新霉素抗性选择标记甲烷八叠球菌属mazei

文摘

甲烷八叠球菌属mazei是一个生物模型的产甲烷秩序Methanosarcinales新陈代谢详细研究。然而,遗传工具箱仍然是有限的。本研究旨在扩大的范围在这群生物可利用的方法。(我)蛋白质特定的产甲烷菌通常很难产生大肠杆菌。然而,产甲烷菌的蛋白质生产系统不可用。这里我们提出一个诱导系统产生Strep-tagged蛋白质mazei女士。启动子p1687,指导主要脱甲基甲基转移酶的转录,克隆到质粒pWM321及其活动是由监控β葡萄糖醛酸酶的生产。启动子是不活跃的增长中甲醇,但迅速激活当三甲胺添加到培养基中。该基因编码的β葡萄糖醛酸酶从大肠杆菌是融合Strep-tag和克隆p1687启动子的下游。蛋白质过度繁殖mazei女士和被亲和色谱法纯化一个活跃的形式。(2)嘌呤霉素抗生素作为目前唯一可选择的标记mazei女士及其亲属。我们建立了耐新霉素作为第二选择标记设计授予新霉素抗性的质粒mazei女士。

1。介绍

产甲烷古菌是严格厌氧微生物,在全球碳循环中发挥关键作用。在厌氧食物链他们负责的醋酸,甲基化胺,H₂。产甲烷微生物的新陈代谢也已经有了很广泛的研究在过去几十年。甲烷生成的过程依赖于一些不寻常的代数余子式专门用于这个途径。此外,许多蛋白质在产甲烷古菌具有不同寻常的假肢组有限域的一些成员古生菌(如醛的钨代数余子式:铁氧还蛋白氧化还原酶),这还不全面。知识有限的原因之一是无法产生这种酶大肠杆菌。大肠杆菌对于产甲烷的生产是非常有用的酶缺乏假肢组。然而,酶,具有属性中没有大肠杆菌甚至在细菌域,困难或不可能产生在这个良好的和广泛使用的细菌蛋白生产主机。因此,需要在产甲烷菌同源蛋白生产系统的生产和净化一些产甲烷的酶。最简单的方法是生产蛋白质融合一个亲和标签,允许通过亲和层析纯化。一个潜在的生产过剩主机甲烷八叠球菌属(女士)mazei这是一个家庭成员Methanosarcinaceae。不像大多数的产甲烷菌对H的增长有限₂+有限公司₂这个家庭的成员是众所周知的代谢多样性。大多数成员可以生长在H₂+有限公司₂、甲基胺、甲醇和醋酸,有些甚至可以长在有限公司这个代谢多样性是反映在相对较大的基因组的大小mazei女士(4.2产甲烷,1])及其亲属。如此大规模的基因组的丰富来源基因编码酶同源生产过剩的潜在目标mazei女士。

遗传的工具mazei女士不断开发和改进。家族成员Methanosarcinaceae由脂质转染(可变形的2,3)和合适的稳定的质粒mazei女士及其亲属存在(3]。此外,它可以产生染色体缺失突变体使用选择标记(4)或清洁删除系统(5,6]。然而,有一些限制:只有嘌呤霉素可以作为一个可选的标记,没有蛋白质生产系统允许重组酶的亲和纯化。因此,本研究旨在扩大了遗传的工具的范围mazei女士。第二个抗生素选择标记,以及蛋白质的生产系统,首次允许生产和纯化的蛋白质mazei女士。

2。材料和方法

2.1。菌株和文化条件

克隆pASK-IBA3和衍生品大肠杆菌DH5α是使用。uidA从基因组DNA的放大大肠杆菌k - 12。修改的产甲烷穿梭载体pWM321 [3)一个大肠杆菌λpir使用应变,pir基因引入到基因组的使用λ噬菌体(7]。复制pWM321取决于ori R6K,质粒的拷贝数大幅度增加如果应变窝藏π的基因编码蛋白质。这两个大肠杆菌菌株在溶原性肉汤培养包含100(磅)μ克毫升⁻¹氨苄青霉素的质粒的维护。甲烷八叠球菌属mazeiGo1 (DSM 7222)是生长在DSM中包含150毫米120甲醇。由脂质转染质粒被引入(2)和文化来自单一的殖民地被用于后续的实验。根据电阻盒,质粒的维护是保证的5μ克毫升⁻¹嘌呤霉素或20μ克毫升⁻¹新霉素。

3所示。代的质粒

限制内切酶、T4 DNA连接酶TaqDNA聚合酶,PCR试剂购自Fermentas(圣Leon-Rot,德国)。Phusion DNA聚合酶购买来自新英格兰生物学实验室(法兰克福,德国)。寡核苷酸合成了欧陆坊(Ebersberg,德国)。常规分子生物学技术是根据Sambrook et al。8]。

生产过剩的质粒pSM01-uidA-Strep建于一个三步的过程。首先,引入子p1687产甲烷穿梭载体pWM321 [3]。因此,启动子p1687被放大和染色体DNA聚合酶链反应mazei女士使用引物5′-TCTCGCGGCCGCTATGGGGTCCTAACCTCTTT-3′, 5′-AATTCATATGATTCTCCTTTTGCCTTTTCAAC-3′介绍不我和濒死经历我限制网站(下划线)。PCR片段与这些酶消化而pWM321消化了不我和新人道我导致结束之间的兼容新人道我和濒死经历我限制消化。两个片段都结扎。由此产生的殖民地被菌落PCR检查的正确插入p1687使用引物5′-TCTCGCGGCCGCTATGGGGTCCTAACCTCTTT-3′, 5′-TGTGGAATTGTGAGCGGATA-3′和测序(StarSEQ,美因茨,德国)。在下一步中,记者基因uidA融合的编码序列应该克隆成pSM01喉炎的标签。的uidA扩大了基因PCR引物5′- ATGGTAGGTCTCAAATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCAA-3′, 5′-ATGGTAGGTCTCAGCGCTTTGTTTGCCTCCCTGCTGCGG-3′插入Bsa我限制性位点(识别网站强调)的基因组DNA大肠杆菌k - 12作为模板。这种基因被克隆到pASK-IBA3 (IBA、哥廷根、德国)使用Bsa我融合基因的编码序列喉炎的标记,将连接到重组蛋白的糖基。成功克隆被殖民地监控使用引物PCR pASK-for和pASK-rev (5′-CGCAGTAGCGGTAAACG-3′, 5′-CGCCGCTACAGGGCGCGTGG-3′)和测序(StarSEQ,美因茨,德国)。正确的克隆uidA-Strep片段被切除Xba我和美国国家工程院我和结扎pSM01被切断新人道我和生态房车。新人道我和Xba我生成兼容而结束美国国家工程院我和生态房车削减钝结束。正确的克隆是监控通过菌落PCR引物5′-CCTGGCTTCCCACCCTGAC-3′和pASK-rev。作为一个消极的控制,uidA也被克隆到pWM321没有p1687启动子克隆使用相同的策略。

的克隆耐新霉素磁带,apHiib基因放大由质粒PCR pBBR-MCS1 [9使用引物5′)塔塔ACCAGGTTCAGAAGAACTCGTCAAG-3′, 5′-TTAAAGGACCCGATGAGGATCGTTTCGCATG-3′。这些引物引入了一个PpuMI的网站和一个性人工智能网站到放大的片段被切断的(强调)PpuMI和性人工智能。性人工智能是被扩张型心肌病甲基化发生在克隆菌株的快速消化变体(Fermentas、圣Leon-Rot、德国)没有被扩张型心肌病甲基化是用于质粒pWM321的限制。质粒是进一步消化秩二世和在一起这两种限制性内切酶切除嘌呤霉素抵抗盒(pac)。碎片都结扎使用T4 DNA连接酶和由此产生的殖民地被菌落PCR筛选使用的引物5′-TTAAAGGACCCGATGAGGATCGTTTCGCATG-3′, 5′-CGCCGCATACAGTATTCTCA-3′。的正确插入新霉素抗性磁带被测序检查(StarSEQ,美因茨,德国)。质粒被任命为pWM321-neo。

4所示。启动子强度的量化

相关启动子的优势promoter-reporter融合结构mazei女士进行了测量的β葡萄糖醛酸酶活性(米勒单位)基本上如[10]。mazei女士文化(50 mL)窝藏pSM01-uidA-Strep或pWM321-uidA-Strep种植30 mM甲醇光学密度在600 nm的0.15。然后引起的蛋白质生产的50 mM三甲胺。在不同的时间点,1毫升的文化是收获(8000×g), resuspended在100年μL磷酸钾缓冲(40毫米,pH值7.0)导致的直接裂解细胞。免费细胞溶解产物被用于确定β葡萄糖醛酸酶通过监控生产活动p硝基酚从p-nitrophenylβ葡糖苷酸在415海里。

5。蛋白质生物化学方法

蛋白质纯化,1 Lmazei女士窝藏pSM01-uidA-Strep生长的光密度在600 nm 30毫米0.15甲醇。然后引起的蛋白质生产的50 mM三甲胺。经过30 h的感应文化收获(8000×g, 15分钟)和5毫升resuspended缓冲W(150毫米三,pH值8.0,100毫米氯化钠)导致细胞的裂解。亲和色谱法进行描述的制造商(IBA、哥廷根、德国)。蛋白质是由布拉德福德量化分析(11),和酶活性测量进行上述promoter-reporter融合的类比。酶活性的计算12毫米的摩尔消光系数⁻¹厘米⁻¹为p硝基酚在415 nm。蛋白质sds - page后被可视化通过银染色(12)或通过免疫印迹和抗体检测。sds - page完成12.5% (w / v)板凝胶如Laemmli所述135% (w / v)聚丙烯酰胺凝胶堆放。样本稀释样本加载缓冲区(2% (w / v) SDS, 5% (v / v)β巯基乙醇,50% (v / v)甘油,20% (v / v)收集缓冲pH值6.8和0.001% (w / v)溴酚蓝)和应用程序之前煮5分钟。分子质量计算相比,分子质量标准(Fermentas,圣Leon-Rot,德国)。免疫印迹和抗体检测,蛋白质被涂抹到硝化纤维膜用半干的吸水装置(Biozym, Hessisch Oldendorf,德国)。膜被阻塞在PBS(140毫米氯化钠,氯化钾2.7毫米,4.3毫米Na₂HPO₄,1.5毫米KH₂阿宝₄,pH值7.3)包含5%的奶粉1 h在室温下。然后,膜被与PBS(3×5分钟)和抗体应用。抗体针对喉炎的标签(IBA、哥廷根)记者直接融合蛋白辣根过氧化物酶或抗体针对β葡萄糖醛酸酶(兔子anti-GUSB, Sigma-Aldrich,慕尼黑,德国)与二次抗体检测(鼠标anti-rabbit)连接到使用辣根过氧化物酶。抗体结合后,膜又洗了(3×5分钟在PBS)和200年20毫升PBS包含执行检测μL (4-chloro-1-naphthol 3% (w / v)和20μL H₂O₂(30%)。

6。结果

6.1。诱导基因表达的蛋白质纯化标记mazei女士

属的成员甲烷八叠球菌属可以增长不同的基质包括醋酸、甲醇、甲基胺,和H₂/公司₂。这种灵活性体现在重大变化的转录组和蛋白质组改变生长衬底(14- - - - - -16]。甲基胺的分解期间一系列的甲基转移酶和corrinoid蛋白质成为活跃的基因表达下调增长期间其他基质17]。的三甲胺进行逐步分解每个脱甲基步骤是由一个不同的催化甲基转移酶(17- - - - - -23]。基因编码甲基转移酶负责脱甲基三甲胺、二甲胺编码在一起,一个操纵子(毫米1687 -毫米1694)和高度活跃在三甲胺的存在(17]。相比之下,甲醇的分解是独立的基因产物毫米1687 -毫米1694年和操纵子的转录时完全被压抑的甲醇作为生长基质。因此,控制基因表达的启动子毫米1687 -毫米1694年似乎是一个合适的工具来建立regulatable基因表达系统mazei女士基于生长基质。贼鸥et al。24)确定转录的开始毫米1687 414个基点上游的启动密码子。因此,875个基点的5′非翻译的操纵子毫米1687 -毫米1694年被选为PCR扩增包含启动子和潜在的调控序列,可以位于上游的启动子区域。这个片段称为p1687,用于随后的克隆。

启动子p1687克隆到两个潜在表达向量,pWM321 pWM321导数的地方pac由新霉素抗性盒式磁带取代(下面进一步描述)。向量pWM321穿梭载体,在这两方面都可以复制大肠杆菌(用于克隆目的)甲烷八叠球菌属物种(3]。它来源于自然发生的acetivorans女士质粒pC2A和大肠杆菌克隆载体pBluescript。的R6K ori pi-dependent复制大肠杆菌来源于矢量pGP704 [7]。然而,pWM321向量不包含启动子诱导基因表达系统甲烷八叠球菌属物种。

向量pWM321-neo携带p1687启动子序列称为pSM02(图1 (c)),而pWM321包含p1687被称为pSM01(图1(一))。pSM01和pSM02都用于进一步诱导基因表达的分析mazei女士。报告基因uidA从大肠杆菌一起Strep-tag编码序列的3′末端引入了启动子的下游p1687 pSM01。由此产生的质粒被称为pSM01-uidA-Strep和发现的活动β葡萄糖醛酸酶的转录直接成正比uidA这是现在的p1687启动子的控制下。的mazei女士文化窝藏pSM01-uidA-Strep质粒被种植在30 mM甲醇在600纳米光学密度为0.15。的活动β葡萄糖醛酸酶本质上是没有这些增长条件下(数据没有显示)。然后uidA基因表达是由50 mM三甲胺和诱导β感应(图后葡萄糖醛酸酶活动迅速增加2)。米勒175年9 h(感应单元测量和米勒略微增加到220单位的30小时后,归纳。控制文化包含pWM321-uidA缺乏p1687启动子的质粒。样本取自感应导致之前这种文化β-glucuronidas活动米勒的单位和30 h后归纳米勒的单位。因此,增长衬底从甲醇三甲胺的变化没有影响β葡萄糖醛酸酶生产文化窝藏promoterless pWM321-uidA质粒。

在下一步测试是否净化记者蛋白质的亲和色谱法是可能的。亲和标记蛋白质纯化的使用是建立在许多生产过剩的系统。从mazei女士然而,标记蛋白质从来没有同源生产和纯化。Strep-tag系统(IBA、哥廷根、德国)被选为亲和标签,因为它允许净化高纯度和反对的内容相当的抵抗力甲烷八叠球菌属介质(例如,减少代理)。的mazei女士文化窝藏质粒pSM01-uidA-Strep生长在相同条件下的启动子强度调查和收获后30 h,关联到最高β葡萄糖醛酸酶活动产生重组蛋白的最大数量。溶解后mazei女士细胞的蛋白质纯化根据制造商的指示。的纯度β葡萄糖醛酸酶分析是运用sds - page及免疫印迹和抗体针对Strep-tagβ葡萄糖醛酸酶(图3)。之间没有区别可以观察到蛋白质中产生大肠杆菌从质粒pASK-IBA3-uidA和蛋白质生产和纯化mazei女士。此外,酶活性在两种制剂是等价的(U毫克⁻¹)。纯化酶的总量mazei女士大约是0.2毫克每升的文化。

6.2。一个新颖的抵抗的标志mazei女士

使用archaeon质粒mazei女士只有一个抗生素的使用是有限的选择,嘌呤霉素。大多数的抗生素用于细菌不工作古生菌的细胞壁成分的差异和信息处理。此外,并不是所有的抵抗磁带都适合使用在古生物体。我们发现抗生素新霉素成功抑制增长mazei女士在一个集中的20倍μ克毫升⁻¹在中(图2)。新霉素是一种氨基糖苷类,块翻译和有效地阻止增长mazei女士当添加到培养基中。探讨抗生素的抑制作用是否可以绕过抵抗的表达盒,引入新霉素抗性磁带大肠杆菌- - - - - -mazei女士穿梭载体pWM321。嘌呤霉素抵抗盒(pac)pWM321取代磷酸转移酶基因aph-IIb从铜绿假单胞菌(25从矢量pBBR-MCS1]放大。这个向量通常是选择卡那霉素,因为对卡那霉素、新霉素磷酸转移酶所带来的阻力。它催化ATP-dependent磷酸化卡那霉素、新霉素[26,27),从而使抗生素失去活性的影响(28]。被任命为pWM321-neo(图对应的向量1 (b))。文化窝藏这个质粒的浓度,防止增长对新霉素抗性亲本菌株没有窝藏pWM321-neo质粒(图4)。的工作浓度20μ克毫升⁻¹有效地抑制增长的文化没有窝藏pWM321-neo质粒而文化包含pWM321-neo质粒增长通常新霉素50浓度μ克毫升⁻¹。

嘌呤霉素和新霉素都翻译抑制剂,所以测试相应的电阻磁带是否会提供重叠的抵抗其他抗生素。在测试条件下(DSM中120年,增长在三甲胺或甲醇,5μ克毫升⁻¹嘌呤霉素或20μ克毫升⁻¹新霉素)重叠所以没有被观察到抗生素可以一起使用,以选择两个不同的质粒。这些结果表明,新霉素抗性选择标记可以作为一本小说mazei女士与克隆已经带有一个兼容的质粒或染色体缺失pac电阻盒。

7所示。讨论

7.1。诱导基因表达mazei女士

诱导表达系统有一个好处,那就是增长阶段和蛋白质可以分开生产阶段。这通常是非常有用的,因为蛋白的生产可能会减缓或停止增长,仅有少量的细胞生物量和重组蛋白可以获得。在大肠杆菌和许多其他细菌诱导蛋白生产系统已经成熟,而且经常使用。在古菌,然而,很多系统用于细菌不是功能由于新陈代谢的差异和两个域之间的基因调控。一个系统可以用于产甲烷菌属甲烷八叠球菌属是连的pmcr / TetR系统et al。29日]。作者使用了启动子的基因编码methanogeneses的关键酶,甲基CoM还原酶,并融合细菌四环素操作符,允许阻遏TetR-mediated诱导基因表达的四环素。这个系统被用来诱导补充缺失突变体,但从来没有用于生产蛋白质纯化。这同样适用于诱导基因表达系统被洛特et al。30.],用于条件删除诱变的生长基质。该研究还利用启动子的反应底物的可用性,使用的启动子甲基转移酶参与甲醇退化(mtaC1)甲烷八叠球菌属acetivorans。与报告基因启动子融合uidA结果相似β葡萄糖醛酸酶活动在midexponential增长阶段这一研究获得的。然而,洛特et al。30.]没有测量基因表达的诱导细胞生长基质的开关但只测量β葡萄糖醛酸酶活动的文化在同一衬底生长一段时间与多个文化传递。相比之下,我们的结果表明,诱导产生一种标记的蛋白质可能在单一文化的培养2 - 3天,可以避免耗时的文化传递。

按照深度测序的结果mazei女士转录组(24]875个基点的5′端非翻译区毫米1687 -毫米1694操纵子被选为假定的启动子。这个序列被认为包含启动子序列以及潜在的调控蛋白结合位点。活动测量细胞中提取的结果表明文化窝藏uidA基因融合这875个基点序列显示相当大β葡萄糖醛酸酶诱导后活动。β葡萄糖醛酸酶活性没有甲醇在增长但迅速增加在三甲胺。这意味着875个基点的片段,称为p1687确实直接转录的uidA基因对三甲胺的可用性。因此,启动子和监管蛋白结合的图案毫米1687 -毫米1694年操纵子出现在这875个基点的DNA片段。此外,启动子的规定非常严格,因为β葡萄糖醛酸酶活性不能测量前的文化与三甲胺诱导。

Strep-tagged的净化β葡萄糖醛酸酶从mazei女士细胞提取纯酶制剂,表现出相似的酶活性的酶的准备大肠杆菌细胞中提取。Strep-tag已被证明是一个合适的厌氧生产重组蛋白的亲和标签mazei女士。

收益率的重组蛋白纯化mazei女士文化很低为0.2毫克β葡萄糖醛酸酶每升体积和文化可能会更低的生产蛋白质包含复杂的假肢组。然而,体积要小得多mazei女士文化需要获得足够数量的重组蛋白进行进一步分析与经典方法相比的蛋白质纯化。此外,净化是很简单的,因为只有一个色谱步骤是必要的,而不是多个色谱柱通常使用的经典方法。这是一个很好的优势特别是oxygen-sensitive蛋白质中经常发生mazei女士。

7.2。新霉素抗性选择标记的小说mazei女士

大多数抗生素对细菌不是功能,古生菌的细胞结构和新陈代谢的差异。此外,据估计,只有几个古细菌与人类生活和疾病(31日)所以几乎没有一个制药或商业利益建立抗生素对古生菌。然而,某些抗生素对细菌作用或用于细胞培养的真核细胞有可能影响古生物体。此外,抵抗磁带,也可能功能或可能存在优化用于古生菌。新霉素是一个自1949年以来已知的抗生素抑制细菌生长(32]。它结合核糖体RNA的网站细菌核糖体和促进codon-anticodon绑定不当,导致遗传编码的误读和停止易位的核糖体(33,34]。例如,对于一些较低的真核生物酿酒酵母和四膜虫sp,据闻新霉素有同样的效果35,36]。在域细菌新霉素抗性作为选择性标记在真核生物四膜虫thermophila(37)和archaeon产甲烷球菌属maripaludis(38]。古细菌热原体属acidophilum和Thermococcus速”也容易受到新霉素[39]。然而,并没有报道中新霉素抗性选择标记的使用这些生物。预计新霉素不抑制嗜盐古生菌的增长由于新霉素不抑制增长通常使用浓度(< 500μ米)在高盐浓度下,至少在细菌(40]。然而,新霉素抗性选择标记的就业m . maripaludis现在mazei女士表明它可以用于其他古生菌,可能扩大遗传的工具箱在各种各样的生物。秩序的成员Methanosarcinales可能尤其容易生长抑制新霉素和质粒pWM321-neo这里介绍可以用来授予新霉素抵抗这些生物。

确认

作者感谢伊丽莎白·施瓦布技术援助和保罗Schweiger批判阅读的论文。这项工作是支持的德意志Forschungsgemeinschaft (DE488/10-1)。

引用

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