文摘
基因组序列的可用性和日益复杂的遗传工具,Haloferax volcanii正在成为一个模型对古生菌和嗜盐菌。为了让h . volcanii地位相当于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌,或酿酒酵母、基因敲除收集需要构建以识别热点重要基因设置并启用系统表型屏幕。流线型的基因删除协议适用于潜在的自动化实现,用于生成22h . volcanii删除菌株和识别几个潜在的重要基因。这些基因缺失突变体,产生在这和之前的研究,然后分析了高通量的方式来衡量不同媒体的增长速度和温度条件。我们得出这样的结论:这些高通量方法是适合的快速调查h . volcanii突变体库的基础,建议他们应该形成一个更大的全基因组实验。
1。介绍
自识别演义范式在30年前(1古细菌生物),寻求模型,代表每个主要的组,一直持续。到目前为止,可耕种的古生菌,硫化叶菌sp.保持在最强烈的调查,已经成为现代基因组实验技术[的主题2,3),但在活的有机体内这些生物的研究滞后,健壮的遗传方法缺乏(虽然这是目前解决(4,5])。嗜热微生物的能力,等Thermococcus kodakaraensis和Pyroccocus furiosus在超过95,茁壮成长˚C是极大的兴趣(尤其是工业)。然而,虽然t . kodakaraensis有一个成熟的基因系统,最优增长加上高温厌氧需求把这些生物的非专业人士的实验室(6- - - - - -8]。收到的产甲烷菌的早期领导第一个可用的古细菌基因组序列,产甲烷球菌属jannaschii(9),描述了遗传操作技术密切相关产甲烷球菌属maripaludis(10,11]。然而,正如严格厌氧菌,操纵也仍然局限于专家。
由于日益增长的社区调查人员的努力(见http://www.haloferax.org/),Haloferax volcanii是填充模型archeaon和模型数据的作用。< 4小时的时间相对较短的一代(12,13),易于生长在实验室条件下,基因组序列的可用性(14),和发展的遗传工具(15- - - - - -17)(包括航天飞机、表达式和自杀向量使用营养缺陷型,和antibiotic-based选择)允许基因缺失与相对容易实现。这种壮举的结合使得在嗜盐菌的研究方面取得了快速进展,已成功地实施密切相关的生物芯片和蛋白质组学实验Halobacterium salinarum(18- - - - - -21]。因此,h . salinarum/h . volcanii两人可以被认为是最先进的生物模型在古生菌。
全基因组基因删除库的建设的主要成就之一基因组时代。最初,这种集合使用随机诱变方法,生成和使用转座子插入strain-sets已经描述了大肠杆菌(22),棒状杆菌属glutamicum(23),流感嗜血杆菌(24),而铜绿假单胞菌(25,26)等等。然而,潜在的极地插入对下游基因的影响和利用的不确定性使转座子库远非理想。由于这些原因,有针对性的基因删除库已经成为选择的方法,尽管高成本和劳动力的需求。这种突变体集合已经建了多个生物模型(27- - - - - -29日和大大帮助基因功能研究30.- - - - - -32]。可用的遗传工具现在存活的后勤一起以前的全基因组基因删除库中获取知识,使系统分析是首次应用热点。系统,和潜在的自动化,分析基因删除集合将使快速鉴定菌株表型和假想的蛋白质的注释应该援助。
朝这一目标作为一个概念验证的案例研究,确定合适的方法研究这样一个图书馆,我们分析了22个基因缺失突变产生在我们的实验室使用容易可伸缩的高通量的方法。在这里,我们报告统计这个奋进号和现在的成功的技术用于建立加速基因h . volcanii。此外,我们使用高通量制成的表现型方法,与潜在的可伸缩性和自动化,帮助这些突变体的研究和证明h . volcanii是完全服从这些技术(假设预测的4209个基因,突变体分析在这里代表大约0.6%的所有可能的基因缺失)。我们提出的方法在这里形成的高通量表现型分析的基础h . volcanii。
2。材料和方法
2.1。菌株、质粒、媒体和转换程序
在这项研究中使用的所有菌株和质粒详细补充表1和2中可用http://dx.doi.org/10.1155/2010/426239。h . volcaniiH26用作亲本菌株。大肠杆菌通常生长在LB-Lennox(磅)(费舍尔)或磅琼脂(费舍尔)37°C,在需要时补充与氨苄青霉素(Amp;100年μ克毫升−1),异丙基β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG;0.2毫米)和bromo-chloro-indolyl-galactopyranoside(半乳糖苷;40μ克毫升−1)。在需要时,新生霉素是添加到最终浓度为0.3μ克毫升−1。h . volcanii细胞通常生长在Hv-YPC 44°C(除非指定),HvCA或清洁发展机制。h . volcanii媒体根据提供的食谱HaloHandbook [12]。转换的化学主管大肠杆菌由制造商的方向进行描述(表达载体,CA)。的变换h . volcanii执行所述HaloHandbook使用“标准PEG-mediated Haloarchaea转型”协议。简而言之,原生质球是由增加100μl 0.5 EDTA (pH值8.0)为1毫升集中在室温下细胞和孵化了10分钟。2μ克的质粒DNA被添加到100μl球形体和孵化为5分钟。100年μl 60% (v / v)挂钩600年添加和混合。混合物在室温下孕育了30分钟。通过添加复苏细胞恢复解决方案,按照HaloHandbook,孵化4小时44˚镀金前C到适当的媒介。
2.2。基因缺失菌株建设
质粒删除h . volcanii基因构造如下。地区约600个基点的上游和下游基因被删除被聚合酶链反应(PCR)扩增使用Phusion热态启动聚合酶(Finnzymes,埃斯波,芬兰)净化h . volcanii基因组DNA(准备中描述17])补充表3中列出的引物。引物设计等,它们含有18 - 20基地的同源染色体DNA。上游的反向引物片段和下游的正向引物片段也包含了一个链接器15个基地启用加入两个片段的重组(在下面描述)。链接器的目的是将小说15英国石油公司之间的间隔,和下游包含独特的碎片濒死经历我和反光镜锁定我把网站(图1)。上游的正向引物片段和下游的反向引物片段也包含pTA131(图15基地的同源性1)。pTA131被切割和线性化Xho我和生态RI。后两个片段和线性化向量gel-purified (QiaQuick试剂盒),他们被组合在一个5:5:1(上游片段:下游片段:线性化pTA131;参见图1)摩尔比率(包括纠正100 ng线性向量)和使用在融合重组由制造商(Clontech, CA)。反应是孵化15分钟37岁˚C 50岁15分钟紧随其后˚孵化后,0.2μl变成了全球细胞(表达载体,CA)根据制造商的指示和细胞镀上磅+ Amp, IPTG,半乳糖苷。克隆筛选通过使用M13通用引物PCR(退火的MCS pTA131)使用5′Taq大师混合(埃普多夫)按照制造商的指示。克隆被Sanger测序验证使用超滤测序设施。每个基因删除构造特定的引物用于生成详细补充表3。
一旦获得,确认删除通道通过质粒大坝−紧张的大肠杆菌(Inv110;CA)表达载体,转化成h . volcaniiH26(或衍生品)如上所述。删除目标轨迹的选择在一个两步过程中如前所述的阿勒斯et al。16]。短暂的,删除的重组质粒染色体由单个交叉事件被选中的增长HvCA(即。,没有尿嘧啶)。随后切除的综合第二次重组质粒和目标基因事件被镀上选择与尿嘧啶(10 HvCA补充μ克毫升−1)和5-fluoroorotic酸(5-FOA;50μ克毫升−1)。基因缺失的候选人筛选使用pcr方法如下。正向引物设计退火5′下游的片段,和反向引物设计在上游片段退火。一对引物(用后缀_ext_Fwd和_ext_Rev)被设计在侧翼退火区域的基因被删除和扩增子的大小相对于野生型和预测大小。确认损失的基因,第二对引物(_int_Fwd和_int_Rev作为后缀)旨在退火在目标基因被删除确认损失从染色体的基因。
2.3。其他质粒结构
目标基因被从纯化PCR扩增h . volcanii基因组DNA使用Phusion热态启动聚合酶(Finnzymes,埃斯波,芬兰),使用引物补充表3中列出。扩增子之间的插入濒死经历我和Blp我的网站pJAM202c [33]。
2.4。h . volcaniitRNA提取和分析
大部分tRNA准备、水解和分析了液体chromatography-tandem质谱(质/ MS)如前所述34]。所有的tRNA方法进行了净化和独立分析至少两次。
2.5。高通量表型分析
液体或固体分析增长的媒体,菌株是从为了上经常有Hv-YPC固体培养基和培养48小时44°C。三个管包含5毫升Hv-YPC接种独立单一的殖民地和增长44°C 48小时。
的监控h . volcanii生长曲线,2μl文化规范化OD600年(1)被用来接种300μl Hv-YPC或300μ清洁发展机制。250年μl(接种中被转移到一个100孔板。增长曲线在Bioscreen-C自动化监控生长曲线分析系统(美国增长曲线,MA) 44°C和持续的震动。读数记录每45分钟(5读数清晰只有一个数字所示3 (d)和3 (e))。这里的实验期间,没有特别的措施是必要的,以防止蒸发/盐沉淀Bioscreen板。
为分析经济增长的坚实的媒体,野生型和突变株生长在一系列温度和盐浓度。100年μl Hv-YPC每种文化发展的规范化OD600年为1。这种文化是连续稀释,10μl的10−4稀释是镀到96孔板。每个包含100μl Hv-YPC琼脂包含不同的盐浓度。除了标准的最终盐水的浓度为18%,显示在[12),30%的盐水股票用来制造标准Hv-YPC稀释达到最终浓度为12%,14%,23%和25%。每个媒介复制这6盐浓度占领12井(相当于96孔板上的行)。每个盘子都重复5次,每个孵化26°C, 30°C, 37°C, 44°C和50°C,从而产生一个矩阵的温度和盐浓度。取决于温度,盘子被孵化2到7天。每个板的上面一行是用于野生型控制,和各种突变体被添加到后续行。
3所示。结果与讨论
3.1。加速基因删除结构h . volcanii
删除大量的基因h . volcanii基因组需要获得一个快速方法删除的发展结构。建设h . volcanii基因缺失可分为两个阶段:(1)代删除构建包括建立大肠杆菌基于分子生物学,和(2)的介绍和选择正确的候选基因缺失的原生生物。第一阶段是受到需要放大通过聚合酶链反应(PCR)及克隆多个GC含量高(平均65%的DNA片段(14])。第二阶段是耗费时间内在技术和生物;两个独立的复合事件必须选择在一个相对增长缓慢的有机体。目前,描述方法需要克隆——和下游地区侧翼基因一起被删除(使两个片段之间的三方结扎反应和线性化向量相对效率低下),连续克隆(耗时),或使用专有topoisomerase-based技术可以昂贵当应用于大型基因集16,17]。因此,所有现有技术可能需要多次克隆和同样是劳动密集型的,昂贵的,都是理想的创建大量的基因缺失。加快突变体的一代,我们探索的可能性recombineering删除构造而不是采用传统的建立分子生物学技术使用在融合(Clontech CA;(35])。这种技术的详细方法包含在材料和方法和示意图见图1。利用该系统启用删除构造在24小时收到必要的合成寡核苷酸(使用前面描述的方法相比,2 - 4周)和验证基因缺失h . volcanii实现在3 - 4周。此外,由于明显的技术的高精度,减少deletion-construct候选人介绍之前需要检查h . volcanii减少时间和成本(一般三个候选人质粒筛选使用pcr方法,其中三个是几乎总是正确的)。虽然在一个月仍远远超出其他王国的生物模型所需的时间,这段时间是不可避免的由于有机体的相对增长缓慢和两个复合事件隐含在删除协议。然而,采用这种方法使建设大量的基因删除结构在一个现实的时间表。此外,同样的技术可以在原则上适用于快速生成插入基因组质粒结构操纵,比如在坐标系染色体蛋白质融合标签虽然这目前的能力还有待观察。
传统上,h . volcanii社区优先删除验证了南部杂交方法。在这里,大量的假定的突变体筛选,我们采用2倍pcr突变用于验证过程h . volcanii通过El Yacoubi et al。17]。除了至少敏感南部杂交过程,PCR很容易扩展。两个引物设计退火外受影响的基因,和两个内。这两个与这些引物PCR反应进行确认变更的基因组区域,验证与预测扩增子的大小相比,和基因的引物着陆绝对证实其缺乏与野生亲本菌株相比积极控制。通常,36个候选人筛选突变体的病例,通常产生了几个删除。变异生成理论50%解决部分二倍体很少实现,可能由于重组限制造成局部的二级结构。如果不能识别基因缺失,进一步筛选100名候选人,如果没有突变体还展出,整个过程至少重复一次。
使用这个协议,21个基因被成功删除30(表未遂1),以及一个包含两个基因缺失(Δ应变了HVO_1105ΔHVO_2008)。为了演示我们的协议的有效性,我们进一步分析了特定突变体的表型。HVO_1594以前预测负责tRNA修改m的形成5C同源性的基础上p . abyssi蛋白质PAB1947 [36),修改显示出现在几乎所有h . volcaniitRNA物种(37]。HVO_1594被删除使用上面描述的方法,从染色体和散装tRNA从野生型和Δ吗HVO_1594细胞生长在Hv-YPC媒体分析质/女士(图2)。如图2,相对应的峰值m5C是缺席的tRNA提取突变。对应的峰值的身份证实了从野生型tRNA串联质量碎片。因此,质/ MS分析符合HVO_1594参与m的形成5在tRNA C。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(一)
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HVO_1717和HVO_1716各自的同系物细菌吗queE和queC参与preQ的合成0的前体Queuosine修改中发现细菌tRNA [38,39]。preQ0也是一个生物合成的前体Archaeosine (G+)[40),D-loop发现在几乎所有的tRNA修改热点tRNA物种测序日期(41]。这两个修改共享相同的前身,一个可能的假设是HVO_1717和HVO_1716参与G+生物合成。为了验证这一点,建立了相应的基因缺失突变体在材料和方法,所述preQ避免潜在的污染0从富媒体40),生长在媒体(CDM)定义的。大部分tRNA提取这些突变株,纯化,消化核糖核苷(图2)。质/ MS的分析表明,峰值对应于G+没有这两个突变株,但出现在野生型。的身份证实了野生型样品的峰值串联质碎片(图2)。这些结果证实,HVO_1717(queE),HVO_1716(queC)参与G+生物合成。
3.2。发现重要的基因h . volcanii
使用我们的技术,我们删除30个基因(表1)。22株被成功构建(表1);然而,尽管多次尝试,不能删除(表8个基因1)提高的可能性,他们是至关重要的。确定这些善意的必需基因,因此形成的基础h . volcanii基本沿着这样的基因cct1,hdaI,皮塔饼(42- - - - - -44),每个8基因克隆到一个大肠杆菌/h . volcanii穿梭载体pJAM202。克隆变成了h . volcaniiH26衍生品,其相应的基因缺失染色体进行验证集成构建(见部分2)。高水平表达的特定基因在反式再次试图删除相应的染色体基因复制。删除中描述的基因在这种情况下检查材料和方法,除了内部引物不习惯,因为他们会放大产品无论成功删除。使用这种方法,我们成功地实现了删除的染色体拷贝HVO_0339,HVO_0253,HVO_2747表明这些基因(图真的是非常重要的3(一个)- - - - - -3 (c))。测试剩下的五个重要基因的候选人正在进行。
预计两个这三个基因的重要性。HVO_0339, COG1517家族的一员,最近被显示在体外负责修改的胞嘧啶核苷agmatidine摆动位置(45,46]。Agmatidine允许修改解码AUA异亮氨酸密码子而不是8月甲硫氨酸密码子(45,46]。细菌的功能类似的修改,lysidine,是至关重要的47]。HVO_0253 YrdC / Sua5家族的成员参与N的形成6-threonylcarbamoyl腺苷(t6),一个普遍的修改在37的图示位置码解码安(48]。中相应的基因家族是至关重要的细菌,酵母同系物和删除(YGL169W)是可行的,但是会导致严重生长表型(48]。HVO_0253表明的重要性关于t的角色6生物合成的酶,古生菌的细菌比更接近真核生物。最后,HVO_2747功能,COG1491成员仍然未知,但其保护在大多数古生菌,结合重要性表型,使其研究的最高目标。我们的基因结果强烈建议上述三个基因但未来调查使用前面描述的至关重要启动子(44)将确认这个重要性表型以及确定可行性所需表达的水平。
3.3。高吞吐量增长率的分析h . volcanii突变体
在删除一个相对大量的基因,本研究的第二个主要目标是制定和实施高通量表现型和生理学的一个方法h . volcanii。虽然这些方法已经应用于分析h . salinarum(49),类似的方法没有被执行h . volcanii。基于数组的表现型方法(用于推导出“现象学”)曾在其他生物模型成功([50- - - - - -52和最近了53])。应该一个h . volcanii基因缺失图书馆被建在不久的将来,类似的方法将必要的大量的突变体的功能评估。因此,我们发起的一项调查中,增长研究野生型和突变株的构建在我们实验室在过去几年比较在各种条件和媒体类型。我们的方法是设计来生成一个大的定量数据集同时维护一个可控,且容易可伸缩、劳动负荷。我们研究了两种方法菌株表型出现。第一种方法执行增长曲线在100格式,第二是测定菌株生长在固体介质的健身96 -格式。增长曲线,野生型和21突变株生长在富有(Hv-YPC)和媒体(CDM)定义的。其次,坚实的媒体,这些菌株生长在各种温度和盐浓度。每个实验包含至少两个独立的生物复制。使用这些技术,我们发现了多个异常的表型与一个研究员(2周总结表1,数据3和4和补充表4)。
(一)
(b)
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Bioscreen C装置来获得所有菌株的生长参数丰富媒介(Hv-YPC)和组合培养基(CDM)来确定是否有基因缺失在调查中是不利于经济增长。许多菌株保持增长率与野生型所用,然而7突变体表现出严重缺陷(表增长1和数字3 (d)和3 (e))。正如所预期的那样,更多的突变体表现出表型在定义(CDM)中(表1)。ΔHVO_0390,ΔHVO_0916,ΔHVO_2888显示缺陷最严重的增长在发达介质(数字3 (d)和3 (e))。ΔHVO_0916,ΔHVO_0390,ΔHVO_2478显示三个增长最严重的缺陷定义中(图3)。所有菌株的完整计算增长率媒体类型归纳如表1。尽管增长速率常数相应翻倍~ 20小时低于此前报道(12,13),这似乎是一个使用Bioscreen C装置的人工制品,文化风潮,因此曝气,明显低于大型文化在一个常规颤抖的孵化器。作为对照,H26生长在同一个Hv-YPC媒体在常规培养瓶和决心倍增时间~ 4.5小时,强烈建议差异仅使用100 -好格式的结果。HVO_0390 COG2016成员。Tma20酵母同族体,被认定为ribosome-associated蛋白(54]。损失显著增加引起的Tma20赭石和蛋白石密码子阅读在酵母(54]。相应的基因物理集群与核糖体蛋白基因在许多古细菌基因组([55),看看Tma20种子数据库子系统http://theseed.uchicago.edu/FIG/SubsysEditor.cgi?page=ShowSpreadsheet&subsystem=DOE_COG2016)。因此,尽管它目前的能力还有待观察,一个角色HVO_0390保持翻译富达古生菌可能出现,和在这种情况下,相应的缺失突变体的增长率并不奇怪。HVO_0916是同源Diphtine合成酶(Dph5) diphtamide甲基转移酶的生物合成途径。Diphtamide转译文章修改中发现延长因子2 (EF2)在古细菌和真核生物和白喉毒素的目标(56- - - - - -58]。尽管这一修改的确切功能尚不可知,但删除这个途径导致生长表型和基因的翻译缺陷酵母(59在哺乳动物中严重受损的发展60,61年]。我们的分析表明,生长缺陷由于古生菌缺乏diphtamide也观察到,但这还有待验证,确认没有修改EF2由于删除HVO_0916。这些结果表明,高通量的方式获得生长曲线分析研究是一种可行的方法h . volcanii基因功能和生理机能。
3.4。高吞吐量的表现型h . volcanii突变体
嗜盐菌的分析的一个关键问题,古生菌,是理解能力看似荒凉的环境中茁壮成长。开始解决这个问题,和长期的意图识别潜在的遗传和分子基础能力,亲本菌株和突变体受到增长在一系列温度(26˚50˚C)和盐浓度(12% - -25%)。一个有趣的观察显示,同时通过比较大量的盘子h . volcanii盐宽容似乎是依赖于温度。在相对较低的温度下(26˚C-37˚C),有明显的偏好相对较高的盐浓度,而在较高温度(50˚C)、盐耐受性降低,高盐浓度会抑制的增长(图4(一))。的增长比较野生型突变株在不同盐浓度和温度显示几株表现出冷敏感性。这些包括删除HVO_0916 HVO_1631, HVO_2001(图4 (b)表4和补充)。相反,压力轴承的删除HVO_2477展览增加了耐低温。
翻译时经常看到删除组件的设备(62年,63年),删除HVO_0916, HVO_1631,HVO_2001引发了人们对冷敏感的表型。正如上面所讨论的,HVO_0916是同源diphthamide生物合成蛋白质Dph5 HVO_1631 Dph2同源,途径的第一个酶(64年]。HVO_2001编码一个tRNA-guanine-transglycosylase (TGT) [17]。TGT是Archaeosine的合成的关键酶(G+),修改tRNA发现特别是在古生菌。G+发现的手肘D-arm和T-arm几乎所有热点的位置15 tRNA轴承一个鸟嘌呤的位置。我们之前表明ΔHVO_2001是可行的和缺乏G+在tRNA [17]。结果显示第一Archaeon缺乏Archaeosine生长表型,寒冷的敏感性。在真核生物和细菌tRNA,位置15毫克的一部分2 +结合位点(65年,66年]。毫克2 +离子诱导折叠和维护tRNA三级结构(16日,43岁,48岁和52)。同时,奥利瓦等人发现在网上、镁2 +和G+发挥可互换的作用在稳定G15-C48反向的沃森克里克几何(67年]。综合来看,这些研究都表明,G+可能发挥作用在诱导折叠和维护tRNA的结构完整性。因此,G的缺失+修改可能会带来更多的刚性tRNA,扰乱折叠在低温下解释寒冷敏感的表型。独立确认96孔板检测,我们复制ΔHVO_2001在100毫米培养皿(图表型4 (c))和补充的寒冷敏感表型表达HVO_2001在反式。HVO_2001、HVO_1717 HVO_1716形式相同的通路的一部分G+生物合成,同样的寒冷敏感表型也可以预期的压力轴承删除HVO_1717和HVO_1716。然而,我们没有观察到一个寒冷敏感这两个基因的表型。解释这个观察是preQ的可能性0这些表型屏幕上打捞从富媒体(进行)。因此,在这些菌株G+仍然是。这个假设可以通过重复这些化验测试中定义,在PreQ的救助0基本不会发生。
总之,我们使用了现代recombineering-based方法来快速生成基因删除结构,最终导致建设22株。八个基因包括在我们的管道不能删除这些方法;我们的基因提供可能的重要性的证据证明3。此外,使用基于数组的表现型的方法,我们能够识别多种生长表型的突变体分析使用的方法可以很容易地扩展以包含更大的基因删除集合。这里介绍的工作为一个潜在的道路系统的创建和分析全球h . volcanii基因删除库,支持过多的假设的遗传分析和注释基因古生菌。
作者的贡献
IKB和VdC-L设计&执行研究和写的手稿。GP, CEB公斤和省长帮助与应变建设。GP, CEB和省长帮助设计的表型分析。
确认
这项工作是由美国国家科学基金会。诉de Crecy-Lagard mcb - 05169448h . volcanii、H26 pJAM202c j . Maupin-Furlow的礼物。索菲·阿尔瓦雷斯质/ MS实验研究,作者感谢亨利Grosjean不断的建议和支持。
补充材料
菌株、质粒和寡核苷酸在这项研究中使用详细的辅料表中1、2和3分别。盐和温度公差每个突变株野生型表型和辅料表4所示。