文摘

目的。胃炎症是很常见的,通常严重患者2型糖尿病(T2DM)病人体内。证据表明protease-activated受体(PARs)炎症和胃肠功能障碍之间的联系。鉴于镁(毫克^{2 +})缺乏症是一种高度普遍条件在2型糖尿病患者中,我们评估了Mg的治疗作用^{2 +}在胃炎症因素在2型糖尿病。方法。2型糖尿病胃病的老鼠模型建立了使用长期高脂肪饮食+低剂量链脲菌素。24老鼠分为控制,2型糖尿病,2型糖尿病+胰岛素(积极的控制),和2型糖尿病+毫克^{2 +}组。最后两个月的治疗,胃trypsin-1的表达的变化,PAR1, PAR2, PAR3, PI3K / Akt, cox - 2蛋白免疫印迹测定。苏木精和伊红和马森的三色的染色是用来检测胃粘膜损伤和纤维化。结果。trypsin-1的表达,PAR1、PAR2 PAR3, cox - 2增加糖尿病、毫克^{2 +}/胰岛素治疗强烈降低他们的表情。PI3K / p-Akt显著降低2型糖尿病,治疗Mg^{2 +}/ PI3K改善2型糖尿病大鼠胰岛素。染色的胃窦组织胰岛素/毫克^{2 +}治疗2型糖尿病小鼠表现出明显最少的粘膜和纤维损伤的老鼠与2型糖尿病组。结论。毫克^{2 +}补充,类似于胰岛素,通过减少部分表达,减轻cox - 2的活动,和减少胶原蛋白沉积可以施加的强大gastroprotective效应对炎症、溃疡,2型糖尿病患者的纤维化的发展。

1。介绍

长期糖尿病导致各种胃病等胃肠道(GI)障碍(1- - - - - -3]。镁(毫克^{2 +})是第二普遍的细胞内的阳离子,其缺陷被发现患代谢综合症的风险与2型糖尿病(T2DM)病人体内4]。糖尿病胃病的特点是大量的胃神经肌肉障碍等异常胃语气,myoelectrical活动,和收缩性1],毫克^{2 +}已被证明是必不可少的正常肌肉和神经功能(5]。此外,两毫克^{2 +}不足(6,7和糖尿病胃病1,8- - - - - -12)与增加炎症反应和自由基的生产。此外,毫克^{2 +}补充发现降低炎症反应,改善代谢状况在许多糖尿病的临床试验(13,14]。这些数据表明,毫克^{2 +}通过针对炎症可能会改善糖尿病胃病的管理途径。

分子靶点,protease-activated受体的参与(PARs)在慢性炎症性疾病的发展被大量记载(15,16]。帕尔斯属于G-protein-coupled受体家族,包括四种类型PAR1、PAR2, PAR3、标准杆4杆。PARs胃肠道中丰富和激活多种内源性丝氨酸蛋白酶包括胰蛋白酶,肥大细胞β类胰蛋白酶,matriptase,几个激肽释放酶,药物合成化合物[10]。具体来说,PAR1和PAR2直接调解一些炎症反应,导致疾病的发病机理17]。最近,PARs激活报道在糖尿病加重疾病进展。例如,杆激活已被证明加强糖尿病肾病(18]。同时,三井等人报道,PAR1和PAR2合作有助于糖尿病肾病的发病机制和建议双重抑制PAR1和PAR2可能会提供一个有前途的新颖的治疗方法治疗糖尿病肾病患者(19]。

几项研究已经表明,帕尔斯和cyclooxygenase-2 (cox - 2)信号通路可能是相互关联的20.,21],票面激活和cox - 2的增加都与糖尿病患者的不良预后相关(22- - - - - -25]。cox - 2是一种炎症通路的主要中介,增加水平已被证明在一些胃肠道疾病,如胃炎和胃肿瘤(26]。cox - 2已建议对胃粘膜的完整性的维护是必要的(27),其选择性抑制剂已发现延迟愈合的溃疡和侵蚀在啮齿动物28,29日]。cox - 2也发现有助于glucagon-induced胃排空延迟,建议参与糖尿病胃轻瘫(25]。激活′磷脂酰肌醇3激酶(PI3K) / Akt报道需要upregulation cox - 2的表达(30.]。进一步的研究提出,PI3K / Akt信号通路的激活是主要机制的抗炎影响毫克^{2 +}(31日]。此外,PI3K / Akt信号通路的异常报告与2型糖尿病(32]。然而,是否毫克^{2 +}有益的影响和可能的机制在糖尿病胃病尚不清楚。本研究旨在考察的影响长期口服毫克^{2 +}补充的改进diabetes-induced促炎反应通过评估胃胰蛋白酶的感应,帕尔斯,PI3K / Akt, cox - 2。

2。材料和方法

24雄性Wistar鼠(180 - 250 g)被安置在伊斯法罕大学医学院的医学科学。实验生产者按照美国国家卫生研究所(NIH, 1985)指导并批准的动物保健和这所大学的伦理委员会(没有批准:IR.MUI.RESEARCH.REC.1398.832, 2020年3月12日)。所有的动物都有一个标准的住房笼与随意水和食物温度控制(22±2°C)和12:12明暗周期期间与50±5%湿度实验。2型糖尿病大鼠模型是根据我们之前的研究(33]。

2.1。实验程序

稳定了一个星期后,老鼠被随机分为两组:对照组正常喂丸饮食和2型糖尿病大鼠模型用高脂肪饮食(HFD) 8周后跟一个注射35毫克/公斤链脲霉素(STZ)(西格玛奥德里奇,德国)。HFD的内容(1公斤)由NPD粉(365克)、猪油(310克),酪蛋白(250克)、胆固醇(10克),维生素和矿物质混合(60克),DL-methionine (3 g), Yee-sac粉(1 g)和氯化钠(1 g)。空腹血糖(FBG)测定糖尿病诱导后3天,和老鼠有超过或等于250毫克/公斤血糖被认为是2型糖尿病大鼠模型。然后,糖尿病大鼠随机分为三个不同的组:2型糖尿病老鼠,2型糖尿病大鼠治疗2.5 U /公斤一天两次的胰岛素(2型糖尿病+ Ins)和2型糖尿病大鼠治疗10 g / MgSO点燃₄(2型糖尿病+毫克^{2 +})通常由自来水通过饮用水和HFD 2个月。胰岛素治疗是作为一个积极的控制,因为它通常是2型糖尿病治疗的一个重要组成部分。所有组的血糖水平是评估每星期。在图1,我们的时间线显示示意图描述实验过程。

2.2。生物化学分析

毕竟阐明过程,通宵禁食大鼠被公司实施安乐死₂收集血液样本。胃是分离和冲洗寒冷磷酸盐(PBS) (pH = 7.4),并立即存放在−80°C。光纤光栅测量的血清水平自动分析仪使用酶方法(Pars Azmun、伊朗)。

2.3。免疫印迹分析

调查trypsin-1的表达变化,PAR1, 2和3,cox - 2, PI3K, Akt, p-Akt蛋白质,大鼠胃窦组织被切割完成后120天2型糖尿病+治疗过程(n为每个组)= 6。切割腔部分与冷PBS和储存在冲洗−80°C,供以后使用。蛋白质提取与冷裂解缓冲,蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂鸡尾酒。蛋白质被孤立在8%或10% SDS-polyacrylamide凝胶,然后从凝胶转移到聚乙二烯二氟化物膜(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。5%脱脂牛奶的膜被封锁tris-buffered盐水与渐变(TBST)和孵化主要抗体trypsin-1, PAR1, 2和3,cox - 2, PI3K,磷酸化Akt (p-Akt),β肌动蛋白(美国圣克鲁斯生物技术)和Akt在4°C(美国Elabscience)一夜之间,然后用适当的HRP-conjugated二级抗体室温1小时。使用增强化学发光免疫印迹检测执行,并进行了分析与两个重复。乐队的蛋白质被测密度术使用量化图像J软件(美国国家卫生研究院,马里兰州贝塞斯达)。蛋白表达的规范化β肌动蛋白和对照组。

2.4。组织组织病理学指标

组织病理学评估,样品的胃腔,与冰冷的生理盐水冲洗(4°C),然后固定在缓冲福尔马林溶液(10%甲醛)。石蜡包埋的胃窦组织(5μ米厚的)准备和苏木精和伊红染色())。此外,胃纤维化改变被马森的三色的染色评估。每个微观评价是由病理学家,他是个盲人群体。

3所示。统计分析

结果报告为均值±S.E.米, 这被认为是显著的。组之间的差异是由单向方差分析与评估图基事后测试。蛋白表达分析评价相对量化的对照组。

4所示。结果

4.1。更改后在2型糖尿病大鼠空腹血糖长期注射胰岛素或毫克^{2 +}补充

图2表明光纤光栅在第一天(前2型糖尿病感应),第三天(后2型糖尿病感应),60天的治疗。光纤光栅是明显( )在2型糖尿病大鼠高于在控制老鼠的实验。长期胰岛素治疗或毫克^{2 +}补充显著降低糖尿病大鼠的光纤光栅( )与2型糖尿病大鼠相比。

4.2。体重的变化在2型糖尿病大鼠长期注射胰岛素或毫克^{2 +}补充

动物的体重测量后每周诱导糖尿病。统计结果表明,动物的体重接受胰岛素和Mg^{2 +}未经治疗的糖尿病组相比显著增加,而最大的体重增加与非糖尿病患者控制动物组织(图3)( )。

4.3。表达的变化Trypsin-1、帕尔斯和cox - 2蛋白在2型糖尿病大鼠胃窦后长期注射胰岛素或毫克^{2 +}补充

如图4cox - 2水平明显增加(大约2折, )在2型糖尿病大鼠的胃腔。在糖尿病大鼠来,cox - 2表达水平表示与对照组相比并没有显著变化。有趣的是,cox - 2表达毫克^{2 +}治疗糖尿病大鼠相比大幅减少控制和糖尿病组( 和 ,分别)。

PARs蛋白质的表达水平(PAR-1、杆、三杆)在正常和糖尿病患者胃窦组织被西方免疫印迹检测。我们发现PAR-1、杆、三杆糖尿病腔组织的表达水平显著高于正常窦组织( ,数据5(一)-5(d))。糖尿病大鼠相比,胰岛素治疗或毫克^{2 +}有效地减少PARs蛋白质的表达在糖尿病腔组织(PAR-1: ,杆: 和三杆: )。有趣的是,PAR-1和毫克三杆水平明显下降^{2 +}治疗糖尿病大鼠与对照组( 和 ,分别)。

如图5(d), trypsin-1显示明显高于表达式(1.6倍, )在糖尿病大鼠的胃腔与控制( )。数据分析表明,长期胰岛素治疗或毫克^{2 +}有效减少的表达trypsin-1腔的2型糖尿病大鼠( 和 ,分别)。

4.4。PI3K / Akt通路蛋白的表达变化在2型糖尿病大鼠胃窦后长期注射胰岛素或毫克^{2 +}补充

如前所述,PI3K / Akt信号是必不可少的细胞生存和新陈代谢;因此,我们评估的三个关键蛋白质的表达这个PI3K信号通路,Akt, p-Akt。免疫印迹显示在PI3K和p-Akt表达明显降低2型糖尿病大鼠胃窦,相比没有任何Akt蛋白的变化,控制老鼠(数字6(一)-6(c), 和 ,分别)。目标蛋白质显示不同的治疗组的变化。PI3K蛋白显示明显高于表达胰岛素或毫克^{2 +}治疗2型糖尿病大鼠相比,参与2型糖尿病大鼠( )。水平无显著变化的一种蛋白激酶和p-Akt观察治疗2型糖尿病的老鼠相比,参与2型糖尿病老鼠,而治疗糖尿病大鼠显示显著减少p-Akt蛋白质的水平相比,控制大鼠( )。

4.5。组织病理学评价

)控制染色样品显示正常胃粘膜层黏膜下层,休息与正常胃小凹,定期mucin-secreting上皮。胃腺是统一的和常规的方式与柱状细胞包含基底核和细胞质均匀(图7(一)他走时,40 x)。马森的染色(图7 (b)40 x),粘蛋白材料在胃小凹的蓝色,和坑壁的细胞在一个常规行,和胞浆中看到蓝色。黏液分泌物也正常。

在长期的2型糖尿病组,观察到的变化,预计将在粘膜层包括胃溃疡的易感性。如图7(一),这组的变化是显而易见的。增色的细胞核,细胞质在某些领域已经消失了,和胃上皮也有所下降,破坏,容易损坏。糖尿病的影响细胞的形状和大小和核观察(图7(一)他走时,40 x)。粘蛋白在糖尿病大鼠相比,也减少了控制。少粘蛋白使胃部溃疡。

显著变化的观察2型糖尿病+胰岛素组与2型糖尿病组。坑和细胞质定期。没有观察到变化的粘液与对照组相比。马森染色显示较低的粘蛋白相比,对照组(图7 (b)40 x)。此外,数量没有变化,厚度,形状的覆盖胃腺体细胞与对照组相比。这些变化显示改善胃粘膜层的糖尿病组用胰岛素治疗。

在2型糖尿病+毫克^{2 +}组,几乎所有的治疗已经观察到的影响。腺体细胞是正常和普通,尽管与对照组相比,有点不规则的核和粘蛋白减少。从腔黏液细胞的回归也见过在这组(图7 (b)40 x)。

此外,马森的三色的染色样品显示发生纤维化的胃壁层(图8;10倍和40 x)。马森的三色的染色,胶原纤维染色蓝在黏膜下层和粘膜肌层和外层。胶原纤维是罕见的对照组。2型糖尿病组,胶原纤维在粘膜肌层明显增加,黏膜下层、肌层外层(图840 x)。用胰岛素治疗,胶原纤维在所有层略有下降。在2型糖尿病+毫克^{2 +}组,胶原纤维分散;只是粘膜肌层胶原染色是一个小蓝(图840 x)。

5。讨论

在最近的研究中,我们评估了Mg的治疗效果^{2 +}补充和胰岛素T2DM-induced炎症反应和组织损伤大鼠胃窦通过评估trypsin-1改变,受体,PI3K / Akt / p-Akt和cox - 2蛋白水平和组织病理学指标。

胃病是一种严重的并发症,糖尿病患者,但其病因尚不清楚。帕尔斯扮演主要角色在内皮细胞之间的相互作用,血小板的凝血蛋白酶和血管壁平滑肌细胞控制止血,血管张力和屏障功能,细胞粘附和炎症反应15,34]。细胞表达的部分是在每一个区域的胃肠道(35,36]。分开以前的研究已经表明PAR的表达1,2,3受体在胃里(37- - - - - -39]。与研究一致,正常的免疫印迹分析准备透露PAR1的发生,2和3蛋白在大鼠胃腔。虽然帕尔斯的表现已经证明在胃肠道,支护结构生物学意义尚不完全了解。过度的帕尔斯(基因/蛋白)已被证明在不同组织的糖尿病患者和动物模型。例如,诱导糖尿病与增强的PARs主动脉(40,41),肾脏的不同部分(19,42,在人类血管平滑肌细胞(17,43]。这些研究表明,增加部分激活可能参与糖尿病并发症的病理生理学和炎症在糖尿病肾病,视网膜病,心血管疾病。因此,PARs抑制剂或基因删除部分已被证明改善diabetic-induced组织损伤(19,44- - - - - -46]。三井等人表明,抑制PAR1和PAR2分析改善肾小球硬化症和炎症在糖尿病肾病小鼠(19]。他们也证明了PAR1和PAR2激活受体激动剂有助于血管炎症在糖尿病。另一项研究表明,诱导的糖尿病小鼠缺乏PAR2 (PAR2−−)不影响主动脉内皮功能的部分与非糖尿病患者相比PAR2−−老鼠,和PAR2受体激动剂诱导内皮功能障碍在正常小鼠的主动脉,但不是在PAR2−−/老鼠(44]。缺乏PAR2提高水平的提高还发现纤维化或proinflammatory-related标记在糖尿病小鼠秋田犬45]。此外,增加4杆的表达已经证明在人类和小鼠糖尿病血管,而糖尿病小鼠缺乏4杆从过度保护船改造(46]。这些变化是符合目前的结果获得了胰岛素治疗糖尿病大鼠和特别是毫克^{2 +}补充。我们的研究结果显示,治疗降低支护结构水平升高和糖尿病大鼠粘膜破坏和纤维化,特别是,Mg^{2 +}在差别造成大幅对这些标准1和3的表达。帕尔斯的表情后两个毫克^{2 +}和胰岛素治疗在目前的研究可能会改善diabetes-induced胃损伤。在我们的研究中,提高标准水平与炎性介质的水平增加cox - 2的胃窦diabetic-treated组。以前的研究也表明,炎症介质调节PAR2和标准杆4杆的表达15,47]。这些数据提出一个标准活动和炎症介质之间的互反关系。我们提出了支护结构的水平和cox - 2的变化类似于使用选择性受体拮抗剂的研究结果和炎症基因缺失或糖尿病状态。PAR1和PAR2由已知选择性受体激动剂激活增强细胞因子和炎症介质的释放。这表明帕尔斯的封锁可能改善diabetes-induced胃肠道功能障碍,在某种程度上,通过减少炎症反应影响cox - 2的表达。

在最近的研究中,我们也评估trypsin-1的表达,作为PAR-activating蛋白酶。胰蛋白酶或trypsin-like酶被发现在一些正常组织和肿瘤细胞(48- - - - - -50]。我们发现trypsin-1表达在正常大鼠胃腔。糖尿病大鼠显示trypsin-1的表达增加,导致部分的激活。除了trypsin-1,一些研究报道,血浆凝血酶水平和活动,主要的丝氨酸蛋白酶,在糖尿病增加,这可能是另一个强大的PAR受体激活。PAR-1和杆也发现引起的分泌胃蛋白酶原,丝氨酸蛋白酶,在胃里51,52]。这种分泌影响的确切机制尚未阐明,尽管杆的表达主要细胞提出刺激效应PARs胃蛋白酶原分泌可能是直接的51,52]。因此,慢性糖尿病条件下,丝氨酸蛋白酶,帕尔斯,以一种积极的加强和炎症介质循环,导致组织损伤。因此,这一途径可能是治疗目标为减少胃组织损伤引起糖尿病。考虑胰岛素的抗炎效果,Hyun等人表明,胰岛素治疗降低了PAR2-mediated炎症在insulin-deficient 1型糖尿病小鼠模型(50]。此外,治疗Mg的有力影响^{2 +}炎症反应的抑制endotoxin-induced upregulation已经被证明在先前的研究14,53,54]。临床研究也表明,血糖控制的改善可以减少炎症反应(55,56]。Rezazadeh等人证明了毫克^{2 +}通过增加IRS1的表达,一种蛋白激酶,GLUT4基因有助于改善胰岛素抵抗和高脂肪饮食中血糖控制糖尿病大鼠(33]。我们的数据也证实,毫克^{2 +}积极补充和胰岛素治疗改善糖尿病大鼠的血糖。血糖控制的改善可能直接贡献部分和gastroprotective Mg的角色^{2 +}或胰岛素。综上所述,我们的研究结果显示trypsin-1的表达,增加PAR1, 2, 3,和cox - 2在糖尿病和胰岛素治疗,尤其毫克^{2 +}显著抑制cox - 2的表达,胰蛋白酶protease-1,帕尔斯在糖尿病大鼠。

越来越多的证据表明,PI3K / Akt信号需要正常的细胞代谢,细胞周期进展,细胞生存,在先天免疫防御机制,协调和细胞凋亡57,58]。此外,这种不平衡在PI3K / Akt信号与肥胖有关,2型糖尿病,及其并发症(32]。在正常情况下,生长因子,如表皮生长因子和胰岛素样生长因子,影响PI3K / Akt信号通过各自的受体(59]。当发生能量摄入过多时,在我们的糖尿病高脂模型,过剩的循环游离脂肪酸和高血糖损害PI3K / Akt信号(32]。张等人的研究开发了一种糖尿病鼠模型来评估糖尿病胃轻瘫的发生的时间(60]。在这项研究中,改变在PI3K和p-Akt水平观察糖尿病胃轻瘫的建立模型,初始增加然后减少6周。减少的水平p-Akt / PI3K / Akt通路蛋白被发现后我们的慢性2型糖尿病模型。在我们的研究中,PI3K和p-Akt蛋白质的表达降低糖尿病诱导的后8周。与我们的结果一致,张等人显示减少的活动PI3K-Akt糖尿病的长期持续时间(60]。此外,还有一些报道表明,胰蛋白酶和PAR2受体激动剂增强的分泌细胞因子和趋化因子通过增殖蛋白激酶(MAPK)或PI3K通路(16,61年]。因此,操纵PI3K / Akt信号,其下游分子可能希望治疗2型糖尿病的治疗目标。

胰岛素可以调节细胞代谢通过影响PI3K / Akt信号通路。此外,先前的研究显示,增加PI3K / Akt活动基础的抗炎影响毫克^{2 +}。在我们的研究中,胰岛素或毫克^{2 +}治疗导致的upregulation PI3K / Akt在p-Akt表达式没有任何重大的改变糖尿病大鼠。因为需要磷酸化最大Akt激活,为了评估两种治疗方法的有效性diabetes-induced胃损伤,必须评估PI3K / Akt通路的下游蛋白质。

证据来自人类和实验模型的2型糖尿病与胃粘膜破坏和纤维化的病理贡献者。纤维化可增加胃刚度和减少合规,导致胃蠕动功能障碍。纤维化的主要成分是胶原纤维过度沉积的组织。我们的组织病理学研究结果也表明,纤维化的强度在2型糖尿病组明显高于对照组。与2型糖尿病组,Mg的胶原纤维明显减少^{2 +}治疗2型糖尿病组。这些结果表明,毫克^{2 +}展品gastroprotective效应通过抑制胃胶原的过度生产,减轻糖尿病大鼠肝纤维化。

减少肌肉与肌肉力量下降和/或功能,是一种慢性并发症的2型糖尿病。已经确定,T2DM-induced胃病在一定程度上是由于损伤和减少腹部肌肉的质量,排除故障的东西。在最近的一项研究中,血糖控制和使用胰岛素明显与二型糖尿病患者增加骨骼肌质量(62年]。

考虑到先前的研究结果强烈表明,Mg^{2 +}补充有能力改善胰岛素抵抗(33,63年),似乎肌肉质量和功能的改善2型糖尿病的改善在一定程度上是由于胰岛素信号通路。符合组织病理学发现,重量在目前的研究结果也证实Mg的改善效果^{2 +}身体的肌肉和胰岛素,包括消化系统的平滑肌(胃)。

在一起,我们的数据表明糖尿病胃病丝氨酸蛋白酶的潜在作用。我们的研究显示出抑制作用的胰岛素或毫克^{2 +}补充对cox - 2的炎症反应可能是由帕尔斯upregulation在糖尿病。因此,增加PI3K / Akt活动和降低cox - 2的激活可能构成强有力的抗炎治疗的影响与胰岛素或毫克^{2 +}在2型糖尿病。因此,在胰岛素抵抗在2型糖尿病的设置,减少胰岛素信号和增强PARs激活可能增加胃组织损伤,由于减少了PI3K / Akt活动和增强的炎症反应。

数据可用性

在这项研究中使用的数据是可用的合理请求到相应的作者。

伦理批准

实验生产遵循美国国家卫生研究所(NIH, 1985年)的指导方针和批准获得动物保健和伊斯法罕医科大学大学的伦理委员会(没有批准:IR.MUI.RESEARCH.REC.1398.832, 2020年3月12日)。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是支持的伊斯法罕大学医学科学(批准号198302)。