III类PI3K/Beclin-1自噬通路参与了mmldl诱导的ET上调_一个小鼠肠系膜动脉中的受体

抽象

最小修饰低密度脂蛋白(mmLDL)是心血管疾病的危险因素之一。本研究探讨了mmLDL对小鼠肠系膜动脉内皮素A型受体的影响在活的有机体内，还有在这个过程中自噬作用。mmLDL经尾静脉注射，和III类PI3K的自噬途径抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）腹膜内注射。该animals were divided into physiological saline (NS), mmLDL, and mmLDL + 3-MA groups. The dose-effect curve of endothelin-1- (ET-1-) induced mesenteric artery contraction was measured using myography, while ET_一个采用实时聚合酶链反应检测受体mRNA表达和ET蛋白水平_一个受体，III类PI3K，自噬基因Beclin 1，LC3 II / I，P62，NF-κB, p-NF -κB采用Western blot分析。mmLDL显著增强了et -1诱导的收缩(theË_马克斯value increased from 184.87 ± 7.46% in the NS group to 319.91 ± 20.31% in the mmLDL group ( ),和压电陶瓷₅₀value increased from 8.05 ± 0.05 to 9.11 ± 0.09 ( )。除了上调III类PI3K，的Beclin-1，和LC3 II / I的蛋白水平和下调该P62的，mmLDL显著增加ET的mRNA表达和蛋白水平_一个并增加了p-NF-的蛋白水平κB.然而，这些效果显著3-MA抑制。mmLDL经由III类PI3K /的Beclin-1途径激活自体吞噬和上调的ET_一个受体通过下游的NF-κB通路。了解mmLDL对ET的影响_一个受体及其作用机制可能为心血管疾病的防治提供新的思路。

1.简介

自噬是一个进化保守的代谢过程;作为一种重要的生存机制，它可以降解和翻转细胞器和细胞质内容物[1]。自噬过程包括形成双层膜的自噬体，细胞质物质吞噬作用，和自噬体的与溶酶体融合降解的。自噬体的形成取决于组件的Beclin-1和含有PI3K-III类磷脂激酶信号复合物。这些复合物介导的自噬体前体的成核和激活泛素样结合途径（Atg5的-ATG12和微管相关蛋白轻链3 - 磷脂轭合物），以促进分离和膜扩展[22，3]。

内皮素（ET）系统是由配体和受体，并且在该系统中的不平衡在心血管疾病的发病机理中起重要作用。ET-1作为高活性的血管收缩剂，其激活内皮素A型（ET_一个和B型内皮素(ET_乙）受体。ET-1的不平衡与病理状况，如arteriomesenteric缺血再灌注相关联4]。的等_一个受体在整个心血管系统，其介导收缩，增殖，凋亡，纤维化和血管的[的血管平滑肌细胞（VSMC）中高度表达五]。在与ET的特异性敲除心肌细胞_一个改善受体、衰老引起的心肌肥大和收缩功能障碍，自噬在其中发挥重要作用[6]。

最低限度修饰低密度脂蛋白（mmLDL）是其中一些脂质的氧化轻度氧化的低密度（氧化低密度脂蛋白）脂蛋白，但维持一个整体载脂蛋白B的结构。mmLDL可以通过除巨噬细胞清除受体[其他LDL受体被识别7]。mmLDL可诱导巨噬细胞的促炎作用，包括细胞骨架重排、巨噬细胞的胞饮作用、ROS的产生、泡沫细胞的形成以及减少凋亡细胞的吞噬作用[8]。mmLDL具有多种促进动脉粥样硬化的特征。如mmLDL诱导单核细胞粘附于内皮细胞，产生集落刺激因子、单核细胞趋化蛋白-1和组织因子，损伤内皮细胞，促进oxLDL生成;此外，mmLDL可激活人冠状动脉细胞中多种凋亡信号通路[9]。

在这里，我们首次探讨了mmLDL对小动脉ET的影响_一个受体在活的有机体内以及自噬在这一过程中的作用。本研究结果可能加深对mmLDL血管生物学机制的认识。

2.材料和方法

2.1。mmLDL准备

采用硫代巴比妥酸反应物质(TBARS)法和琼脂糖凝胶电泳检测LDL、mmLDL和oxLDL之间的差异。根据TBARS方法,氧化载脂蛋白B,胆固醇氧化产品,和在血浆中脂质过氧化反应产品都能与硫代巴比土酸反应形成malondialdehyde-like结构,随后和低密度脂蛋白的氧化程度可以根据结构的数量进行评估。LDL类丙二醛结构的天然浓度低于4μ而mmLDL和oxLDL的天然浓度在5μ和20μ大于20 mol/g LDLμ摩尔，/克LDL分别。根据琼脂糖凝胶电泳，oxLDL的具有大量电底片的氧化在一个快速迁移速率，其随后mmLDL然后LDL [最高水平10，11]。

Human LDL (0.2 mg/mL; Sigma, St. Louis, MO, USA) was applied to EDTA-free phosphate-buffered saline (PBS) containing 1 μmol / L FeSO₄。一个fter a 96-hour dialysis at 4°C, 0.25 mM EDTA was used to terminate the oxidizing reaction for mmLDL [10，11]。该mmLDL was concentrated to 1 mg/mL. The degree of mmLDL oxidation was determined with TBARS, and the result showed that the concentration of malondialdehyde-like structures was 10.36 ± 1.15 μ摩尔/克LDL。电泳（0.8％琼脂糖凝胶）显示mmLDL的迁移率为1.66-1.70倍的LDL。将制备的mmLDL从光在4℃下存储起来在2周内使用。

2.2。动物和分组

SPF-level ICR mice of both sexes, with age ranging from 8 weeks to 11 weeks and a weight of 20–24 g, were purchased from the animal center of Xi’an Jiaotong University, China. The animals had free access to water and food and were divided for different purposes, with 10 animals in each group. The animal treatment protocols were approved by the Institute of Animal Ethics of Xi’an Jiaotong University.

探讨mmLDL对小鼠小动脉ET的影响_一个mmLDL组接受8次注射，每次注射1 mg/kg的mmLDL，间隔12小时。96 h取眼球抽血后脱位处死;然后收集肠系膜动脉用于后续实验[11-13]。生理盐水（NS）组和LDL组给予生理盐水和LDL的相同剂量，分别。

为探讨III类PI3K/Beclin-1通路的影响，腹腔注射III类PI3K抑制剂3-甲基ladenine (3-MA;MedChemExpress，上海，中国)同时给予动物。为确定3-MA、5、15和25 mg/kg组的最佳剂量。用双蒸馏水配制所需浓度的3-MA。每天第一次注射mmLDL前2小时注射，每天1次。96 h采用颈椎脱位法处死小鼠，在牺牲前2 h内不给予3-MA [12]。根据ET确定最佳3-MA剂量_一个受体介导的血管收缩曲线。

2.3。检测血管收缩功能

小鼠被杀死后，将含有肠系膜动脉的组织立即收集，然后浸入一个娜⁺-Krebs solution (containing 15 mM NaHCO₃，119 mM NaCl, 1.2 mM MgCl₂，1。2 mM NaH₂PO₄，1。五 mM dehydrated CaCl₂， 4.6 mM KCl 4.6和5.5 mM葡萄糖)在4℃。在显微镜下分离周围组织，用0.1% Triton x-100进行10s血管内灌注。去除血管内皮。用缓冲液洗涤样品10 s, 20 sμ被用于一个预缩试验M 5-HT。当乙酰胆碱（ACH-; 10 μM)诱导舒张率低于10%，认为内皮被成功去除。

动脉被切成1-2毫米长的环状。两根直径为40的金属线μ米是通过环插入，其中一个连接到负载张力调整设备和其它连接到myographer（丹麦缪技术A / S，DMT，丹麦）。这些环置于恒温箱（37℃）充满的Na⁺克雷布斯的解决方案。达到氧饱和度，混合气体含氧量达到95%₂和5％CO₂是持续通风。pH值维持在7.4左右，静置张力维持在1.5 mN。每20分钟更换一次克雷布斯溶液，平衡时间1.5 h。K⁺-Krebs solution (containing 15 mM NaHCO₃，1。2 mM NaH₂PO₄，1。五 mM CaCl₂，63。五 mM KCl, 1.2 mM MgCl₂，60 mM NaCl, and 5.5 mM glucose) was applied to detect the activity of the rings. The arterial rings were rinsed three times. The abovementioned procedures were repeated. When the contractile amplitudes caused by the two applications of K⁺-Krebs liquid were both higher than 1 mN and the difference between the contractile amplitudes was within 10%, subsequent experiments were carried out. To investigate ET_一个受体介导的收缩功能，血管环在与ET孵育_乙受体拮抗剂BQ-788为0.1μM (Sigma, St. Louis, MO, USA) for 30 min. Then, ET-1 (Enzo Biochem, Shanghai, China) (ET-1 is the agonist of the ET_一个和ET_乙受体,等_一个受体特异性激动剂尚未发现)^-11-10年^-7M采用浓度积累法添加，ET的剂量效应曲线_一个受体介导的血管收缩[14，15]。预测试表明，mmLDL的尾静脉注射期间多粘菌素B的同时腹腔注射不影响mmLDL的效果，因此，内毒素干扰的可能性被排除。

2.4。实时聚合酶链反应（RT-PCR）

使用RNA提取试剂盒(Proteintech Biotechnology, USA)提取总RNA，严格按照试剂盒说明书操作。测定260 nm和280 nm处的吸光度，测定总RNA的浓度和纯度。对cDNA进行逆转录(Perkin-Elmer Applied Biosystems, USA)。采用荧光定量PCR仪(LightCycler 480 II system)进行RT-PCR。使用SYBR Green试剂盒进行基因扩增，cDNA为模板。建立对照组，除添加cDNA外，其余步骤与实验组相同。ET的正向和反向引物_一个受体为5'-TGCCTCTGTTGCTGTT-3'和5'-TGTGGTTGTTCTGCTCTTGG-3'，分别与那些管家基因GAPDH分别5'-TCAACGGCACAGTCAAG-3'和5'-ACTTCCACGACATACTCAGC-3'，是的。反应系统是25 μL, and the conditions included 95°C for 5 min followed by 40 cycles of 94°C for 20 s, 55°C for 20 s, and 72°C for 30 s. Separation efficiency curves were used for the analysis of the specificity of the PCR products, and the cycle threshold (C_Ť用于定量mRNA分析）方法。该C_ŤGAPDH的值被用作内参照，和ET的相对mRNA表达_一个受体基于该值计算。

2.5。Western印迹分析

每个样品由两个肠系膜动脉的来自相同组。RIPA裂解缓冲液含有蛋白酶抑制剂的溶液，并制备匀浆。甲BCA试剂盒用于蛋白定量。进行SDS-PAGE的蛋白质提取，接着分离和PVDF膜转印。淡炼乳（5％;用T-TBS缓冲液中制备）施加样品阻塞。第一抗体包括ET_一个受体抗体(稀释1:500;II类PI3K抗体(1:1000;细胞信号技术)，p-NF-κ乙p65 antibody (1 : 1000; Cell Signaling Technology), Beclin-1 antibody (1 : 3000; Proteintech Biotechnology, Inc., USA), LC3 antibody (1 : 500; Proteintech Biotechnology), p62 antibody (1 : 3000; Proteintech Biotechnology), NF-κB抗体(1:3000;和GAPDH抗体(1:10 00;以含2%牛血清白蛋白的PBS为稀释剂制备。二抗为过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG(均为1:5000)。使用图像测量仪Ver. 4.0(日本富士胶卷有限公司)拍摄图像，进行光密度分析。灰度自校正。目的蛋白的水平以目的基因的条带灰度与管家基因条带灰度的比值表示。

2.6。血清氧化低密度脂蛋白测定

将动物处死后，眼球被切除，并收集血液。该blood sample was coagulated at room temperature for 30 min. The sample was centrifuged at 845 ×g for 30 min at 4°C, and the supernatant was collected for analysis. The concentration of serum oxLDL was determined using enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs). The procedures were performed in strict accordance with the kit instructions (Dakewe Biotech Company Limited, Shenzhen, China). Standard curves were generated based on the oxLDL content in the sample.

2.7。统计分析

数据以平均值±SEM表示。血管环的收缩反应以63.5 mM的K相对于收缩的百分比表示⁺和响应特性用的最大收缩百分数描述（Ë_马克斯)和负对数的浓度引起的受体激动剂的一半Ë_马克斯(压电陶瓷₅₀)。与棱镜8.0软件进行统计分析和绘图。配对学生Ť-检验与韦尔奇的修正被用于比较两组数据。多重比较采用单因素方差分析(ANOVA)和Dunnett后验。采用Bonferroni后验进行双因素方差分析，比较两条曲线各浓度下对应的两个数据点。被认为具有统计学意义。

3.结果

3.1。的血管环收缩反应，动脉内皮的去除效果，和氧化低密度脂蛋白水平

对63.5 mM K时维管环收缩值的响应⁺did not show significant differences among the groups (mmLDL, 2.89 ± 0.47 mN; mmLDL + 3-MA, 2.78 ± 0.38 mN; NS, 2.90 ± 0.42 mN; LDL, 2.86 ± 0.44 mN; ，ñ = 8). Each vascular ring was preconstricted with 20 μm5 - ht后扩张10μ且扩张值低于预缩值的5%，表明内皮完全被清除。NS组与mmLDL组血清oxLDL浓度虽无显著性差异(112.58±6.38)，但差异有统计学意义μg/L vs. 111.32 ± 5.84 μ克/升; ，ñ = 8).

3.2。3-MA对ET的mmLDL诱导表达上调的抑制作用_一个接收器

与生理盐水组相比，mmLDL组有显着的增加ET_一个受体介导的血管收缩，与剂量 - 效应曲线的明显向左移动。该Ë_马克斯nns组的值从201.58±16.63%增加到mmLDL组的346.16±29.46% ( ),和压电陶瓷₅₀value increased from 8.05 ± 0.05 in the NS group to 9.11 ± 0.09 in the mmLDL group ( ）（数字图1（a）)。mmLDL增加ET水平_一个受体:ET的mRNA表达_一个receptor increased from 1.06 ± 0.05 (NS) to 2.12 ± 0.09 (mmLDL) ( ),以及ET蛋白水平_一个受体从0.14±0.01 (NS)增加到0.32±0.01 (mmLDL) ( ）(数据图1（b）和图1（c）)。支持数据示于补充文件1。

Ťo explore the effect of 3-MA on the experimental outcomes, as well as its optimal dose, the animals were divided into three groups for 3-MA intraperitoneal injections (5, 15, and 25 mg/kg). 3-MA inhibited the mmLDL-induced improvements in vasoconstriction in a dose-dependent manner. Compared with the mmLDL group, the 5 mg/kg group showed a slightly rightward shift of the vasoconstriction curve, with a slightly decreasedË_马克斯value (346.16 ± 29.46% vs. 316.59 ± 33.63%; ）pEC略微降低₅₀value (9.11 ± 0.09 vs. 8.82 ± 0.09; )。与mmLDL组相比，15mg /kg组收缩曲线明显右移(Ë_马克斯: 346.16±29.46% vs 242.85±27.25% ;压电陶瓷₅₀: 9.11 ± 0.09 vs. 8.22 ± 0.09, )。与15 mg/kg组相比，25 mg/kg组的收缩曲线略有右移，但无显著差异(25 mg/kg组的收缩曲线与15 mg/kg组的收缩曲线无显著差异Ë_马克斯和佩奇₅₀分别为224.07±24.23%和8.05±0.06;数字图1（a）)。因此，我们以15 mg/kg作为3-MA的最佳剂量，进一步探讨III类PI3K/Beclin-1在ET上调中的作用_一个mmLDL诱导的受体。3-MA 15 mg/kg显著抑制了mmLDL对ET的增强作用_一个受体：将ET的mRNA表达和蛋白水平_一个受体下降至1.28±0.06 ( ）和0。21 ± 0.01 ( ）(数据图1（b）和图1（c）)。尾静脉注射低密度脂蛋白1mg /kg对ET无明显影响_一个受体介导的收缩曲线（图图1（a）)。

3.3。3-MA对mmldl诱导的III类PI3K、Beclin-1、LC3 II/I和p62蛋白的抑制作用

一个fter caudal vein injection of mmLDL, the protein levels of Class III PI3K, Beclin-1, and LC3 II/I increased from 0.75 ± 0.04, 1.79 ± 0.24, and 0.80 ± 0.04 to 1.17 ± 0.04, 4.01 ± 0.17, and 1.33 ± 0.05 ( ， ，和 ),p62蛋白水平由3.35±0.10 (NS)下降至1.23±0.09 (P < 0.001). 3-MA significantly decreased the mmLDL-induced increase in the protein levels of Class III PI3K, Beclin-1, and LC3 II/I to 0.84 ± 0.05, 2.36 ± 0.34, and 0.66 ± 0.03 ( ， ，和 ),，使mmldl诱导的p62蛋白水平下降至2.44±0.13 ( ),说明3-MA抑制了mmLDL引起的自噬激活(图)图2（a）-2 (d);补充文件2)。

3.4。3-MA对mmldl诱导的p-NF-的抑制作用κB蛋白

mmLDL组动脉-肠内p-NF-水平升高κ乙protein, which increased from 0.14 ± 0.01 (NS) to 0.41 ± 0.02 ( )。与mmLDL组相比，3-MA组p-NF-显著降低κB水平(0.17±0.01; ;数字3(一个))。该NF-κ乙protein levels in the NS, mmLDL, and 3-MA + mmLDL groups were 0.15 ± 0.04, 1.16 ± 0.01, and 0.14 ± 0.01, respectively (all ;数字3 (b))。此分析的支持数据在补充文件中显示3。

4。讨论

mmLDL是心血管疾病的危险因素，可引起内皮细胞损伤，诱发泡沫细胞的产生。然而，mmLDL的致病机制尚不清楚。本研究首次表明，尾静脉注射mmLDL可上调ET_一个在鼠标arteriomesenteric受体水平平滑肌细胞，加强ET_一个受体介导的血管收缩。此外，本研究发现III类PI3K/Beclin-1自噬通路参与了小动脉ET的调节_一个在小鼠受体水平在活的有机体内第一次。

增加等_一个受体水平在高血压等多种心血管疾病的发病机制中起重要作用[16，17、肺动脉高压[18，19、扩张型心肌病和微血管功能障碍[20，21]。ET_一个受体敲除可逆转或减少年龄诱导的自噬标记的下调[6]。在ET介导的心肌细胞保护作用中_一个受体敲除或ET的应用_一个受体拮抗剂，自噬起着至关重要的作用[22]。3-MA消除了ET诱导的心血管蛋白的影响_一个受体拮抗剂BQ123，抑制自噬体的形成和溶酶体的降解;然而，这两种影响都可以被ET逆转_一个受体敲除(6]。在本研究中，3-MA抑制了mmldl诱导的ET上调_一个受体，这也表明在心血管系统的调节和保护自噬的重要作用。

自噬与心血管疾病密切相关:生理条件如营养缺乏可诱导离体心肌细胞、血管上皮细胞、VSMCs自噬[23]。在这种条件下，自噬可以促进低于正常水平的细胞器和蛋白质的积累和降解[24]。在心血管应激，如缺血再灌注损伤和心脏衰竭，自噬可以被激活。然而，自噬是在这些条件下有益的或有害的应力尚未明确确定[25，26]。

VSMC自噬在血管疾病的发生中发挥重要作用[27]。自噬过程中，微囊相关的LC3- i从细胞质形式转变为LC3磷脂酰乙醇胺结合形式(LC3- ii)，促进自噬体的形成，从而维持其生长。LC3-II的形成通常被用作自噬激活的指标[28]。在这项研究中，LC3-II表明mmLDL注射后在血管平滑肌细胞的相对高蛋白质水平，这表明mmLDL增加血管平滑肌细胞的自噬水平。与此相反，3-MA抑制mmLDL对自噬激活的影响和下调LC3-II / LC3-I，这表明3-MA减少血管平滑肌细胞的自噬水平的蛋白质的比例。

P62（支架蛋白）和LC3-II与多泛素化的蛋白，这导致后者的降解相互作用。自噬过程的激活可以降低P62的内容。因此，P62水平可以表明自噬是否完整[29]。在这项研究中，与NS相比，mmLDL显著血管平滑肌细胞中的下降水平P62在活的有机体内，提示mmLDL激活了自噬过程。

Beclin-1与自噬空泡的形成有关，其水平被认为是检测自噬通量的可靠标志物[三十]。在本研究中，与NS相比，mmLDL上调了Beclin-1和III类PI3K的蛋白水平，提示mmLDL促进了VSMCs自噬空泡的形成。mmLDL不仅增加了ET_一个受体水平也可诱导自噬。

该NF-κ在ET的上调乙途径参与_乙受体在体外血管平滑肌细胞[31]。作为一种应激敏感的转录因子，NF-κ乙拥有显着的增殖和抗凋亡和促炎效应。NF-κB的激活κ乙上调的Beclin-1和促进自体吞噬[32]。的Beclin-1/6署理和III类PI3K / VPS 34共同动作，招募自噬活化剂与抑制剂来调整自噬体以特定的方式形成[33]。LC3结合至磷脂酰乙醇胺，这允许其与自噬体的自噬体用于形成膜整合[34]。在这项研究中，mmLDL上调NF-κB的蛋白磷酸化水平κB，而3-MA下调NF-中的mmLDL诱导增加κ乙磷酸化，这表明III类PI3K /的Beclin-1参与NF-κB启动。这是第一次，该研究阐明了NF-κB通路参与了mmldl诱导的ET上调_一个受体血管平滑肌细胞。

mmLDL上调III类PI3K，的Beclin-1，和LC3 II的蛋白水平/ I在arteriomesenteric血管平滑肌细胞和下调的p62的蛋白水平;即，mmLDL激活血管平滑肌细胞的自体吞噬和上调的ET的蛋白和mRNA表达_一个增强ET的受体_一个受体介导的血管收缩效应。此外，VSMCs的自噬激活也会影响ET的上调_一个受体。3-MA下调mmLDL诱导的自噬水平升高，抑制ET上调_一个受体引起mmLDL。因此，mmLDL激活arteriomesenteric血管平滑肌细胞的自噬在活的有机体内上调ET_一个受体的水平。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据包含在文章和补充文件中。

的利益冲突

作者声明没有利益冲突。

作者的贡献

隰西鹅和陈晨同等贡献这项工作。

致谢

这项研究是财政由中国国家自然科学基金（编号81202535和81470493），教育的湖南省国土资源厅（编号19K084和19C1722），湖南省科技厅（2018JJ6097），科技支撑郴州局，湖南省（zdyf201821和zdyf201925），诊断和治疗技术在郴州的脂代谢紊乱研究中心，湖南省（yfzx201907）。

补充材料

补充文件1：3-MA对ETA受体的mmLDL诱导的上调表达的抑制效果。补充文件2：3-MA的关于III类PI3K，自噬基因Beclin 1，LC3 II / I，和P62蛋白mmLDL诱导的效应的抑制作用。补充文件3：3-MA的上在p NF-的mmLDL诱导的效应的抑制效果κB蛋白。（补充材料）

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