1。介绍
自噬是一种散播他们守恒的代谢过程;作为一种重要的生存机制,它会降低,在细胞器和细胞质内容(
1 ]。的自噬过程由bilayer-membrane形成自噬体,胞质物质的吞噬作用,自噬体与溶酶体融合的退化。自噬体的形成取决于Beclin-1的组装和第三类PI3K-containing磷脂激酶信号复合物。这些复合物调解autophagosomal前体的成核和激活两个ubiquitin-like绑定路径(Atg5-Atg12和microtubule-associated蛋白轻链3-phospholipid轭合物)促进膜分离和扩张(
2 ,
3 ]。
内皮素(ET)系统由配体和受体,和一个不平衡在这个系统在心血管疾病的发病机制中起着重要的作用。ET-1作为一个高度活跃的血管收缩剂,激活内皮素a型(等一个 )和内皮素B型(等B )受体。ET-1失衡与病理条件下,如arteriomesenteric缺血再灌注(
4 ]。的等一个 受体高表达在血管平滑肌细胞(VSMCs)整个心血管系统,调节收缩,血管的增殖、凋亡和纤维化(
5 ]。在细胞的特定基因敲除等一个 受体,aging-induced心肌肥厚和收缩功能障碍的改善,在此期间自噬发挥了重要的作用(
6 ]。
最低限度改性低密度脂蛋白(mmLDL)是一个温和的氧化低密度脂蛋白(oxLDL)的脂质氧化,但一些维护不可或缺的载脂蛋白B的结构。mmLDL可以被低密度脂蛋白受体除了巨噬细胞清道夫受体(
7 ]。mmLDL诱发macrophagocytes的促炎作用,包括细胞骨架重排,巨噬细胞胞饮,ROS生产、泡沫细胞的形成,减少凋亡细胞的吞噬作用[
8 ]。mmLDL拥有多个atherosclerosis-promoting特性。例如,mmLDL诱导单核细胞与内皮细胞的粘附生成集落刺激因子、单核细胞趋化蛋白1,和组织因素,导致内皮细胞损伤和促进oxLDL代;此外,mmLDL可以激活多种细胞凋亡信号通路在人类冠状动脉(
9 ]。
这里,第一次,我们探索的影响mmLDL arteriomesenteric等一个 受体
在活的有机体内 在这一过程中以及自噬的作用。这项研究的结果可能会加深mmLDL的血管生物学机制的理解。
2。材料和方法
2.1。mmLDL准备
硫代巴比土acid-reactive物质(TBARS)方法和琼脂糖凝胶电泳被用于研究低密度脂蛋白之间的差异,mmLDL, oxLDL。根据TBARS方法,氧化载脂蛋白B,胆固醇氧化产品,和在血浆中脂质过氧化反应产品都能与硫代巴比土酸反应形成malondialdehyde-like结构,随后和低密度脂蛋白的氧化程度可以根据结构的数量进行评估。自然的malondialdehyde-like结构的低密度脂蛋白的浓度低于4
μ 摩尔/ g的低密度脂蛋白,而自然mmLDL浓度和oxLDL 5之间
μ 摩尔/ g LDL和20
μ 摩尔/ g LDL和超过20
μ 分别摩尔/ g的低密度脂蛋白。琼脂糖凝胶电泳,oxLDL最高水平的氧化与大量的电子底片在快速迁移率,这是紧随其后的是mmLDL然后低密度脂蛋白(
10 ,
11 ]。
人类低密度脂蛋白(0.2毫克/毫升;σ,圣路易斯,密苏里州,美国)应用于EDTA-free磷酸盐(PBS)包含1
μ mol / L FeSO4 。96小时后透析在4°C, 0.25毫米EDTA终止氧化反应用于mmLDL [
10 ,
11 ]。mmLDL集中到1毫克/毫升。和TBARS mmLDL氧化的程度决定,malondialdehyde-like结构,结果表明,浓度为10.36±1.15
μ 摩尔/ g的低密度脂蛋白。琼脂糖凝胶电泳(0.8%)显示,mmLDL的流动是低密度脂蛋白的1.66 - -1.70倍。准备mmLDL避光储存在4°C和2周内使用。
2.2。动物和分组
SPF-level ICR小鼠的男女,年龄从8周11周,体重20 - 24 g,买来的动物中心西安交通大学,中国。动物有免费的水和食物,并分为不同的目的,每组10个动物。动物治疗方案被批准的西安交通大学动物伦理研究所。
调查在鼠标arteriomesenteric mmLDL等的影响一个 受体,mmLDL组8注射1毫克/公斤mmLDL通过尾静脉注射间隔12 h。在96 h,动物是被通过颈椎脱位后眼球血液了;然后,收集肠系膜动脉为后续实验(
11 - - - - - -
13 ]。生理盐水(NS)组和低密度脂蛋白组被给予相同剂量的生理盐水和低密度脂蛋白,分别。
探索第三类PI3K / Beclin-1通路的影响,第三类的腹腔内注射PI3K抑制剂3-methyladenine (3-MA;MedChemExpress,中国上海)同时管理的动物。确定的最佳剂量3-MA 5 15和25毫克/公斤组织设计。所需的浓度和双重蒸馏水3-MA准备。注射执行2 h mmLDL第一次注射前的每一天,每天一次。在96 h,老鼠被杀使用颈椎脱位的方法,和3-MA不是在牺牲前2 h (
12 ]。最优3-MA剂量确定基于等一个 受体介导的血管收缩曲线。
2.3。血管收缩功能的检测
鼠标被杀后,包含肠系膜动脉组织立即被收集,然后沉浸在Na+ 克雷布斯解决方案(包含NaHCO 15毫米3 ,氯化钠119毫米,1.2毫米MgCl2 1.2毫米,不2 阿宝4 脱水CaCl, 1.5毫米2 、4.6毫米氯化钾4.6和5.5毫米在4°C葡萄糖)。周围组织被隔离在显微镜下,10 s进行血管内灌注0.1% Triton x - 100。血管内皮是移除。样品和缓冲洗10 s,然后20
μ 米5是用于预缩试验。当乙酰胆碱(ACh);10
μ 米)诱导舒张率低于10%,内皮认为成功移除。
动脉被切成圈,1 - 2毫米的长度。两个金属丝直径40
μ m插入穿过戒指,和一个连接到负载张力调整设备和另一个连接到肌动描记器(丹麦Myo技术/ S、DMT、丹麦)。五环被放入恒温箱(37°C)的Na+ 克雷布斯的解决方案。为了实现血氧饱和度,混合气体含有95% O2 和5%的公司2 是持续通风。pH值维持在大约7.4,静息张力保持在1.5 mN。克雷布斯的解决方案是更换每20分钟,平衡时间为1.5 h。K+ 克雷布斯解决方案(包含NaHCO 15毫米3 1.2毫米,不2 阿宝4 ,1.5毫米CaCl2 氯化钾,63.5毫米,1.2毫米MgCl2 葡萄糖、氯化钠60毫米和5.5毫米)应用于检测环的活动。动脉环冲洗三次。重复上述过程。当收缩振幅由K的两个应用程序引起的+ 克雷布斯液体都高于1 mN和收缩振幅之间的差异在10%,进行后续实验。调查等一个 受体介导收缩功能,血管环孵化等B 受体拮抗剂bq - 788 0.1
μ 米(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)30分钟。然后,ET-1(恩佐物化学,中国上海)(ET-1的受体激动剂等一个 和等B 受体,等一个 没有发现针对受体受体激动剂)10−11 -10年−7 M添加使用浓度积累方法,的量效曲线等一个 受体介导血管收缩了(
14 ,
15 ]。预备调查显示,同时腹腔内注射多粘菌素B在尾静脉注射mmLDL并不影响mmLDL的影响,因此,内毒素的干扰的可能性排除在外。
2.4。实时聚合酶链反应(rt - pcr)
使用RNA提取总RNA提取工具包(美国Proteintech生物技术)和程序严格按照设备执行的指令。在260 nm和280 nm吸光度检测来确定总RNA浓度和纯度。反转录进行互补脱氧核糖核酸(美国优秀的应用生物系统公司)。荧光定量PCR仪(LightCycler 480 II系统)是用于rt - PCR。SYBR绿色装备用于基因扩增,和互补dna作为模板。建立了一个对照组,表演的过程是一样的,除了添加cDNA实验组。的正向和反向引物等一个 受体5′-TGCCTCTGTTGCTGTT-3′, 5′-TGTGGTTGTTCTGCTCTTGG-3′,分别和管家GAPDH基因5′-TCAACGGCACAGTCAAG-3′, 5′-ACTTCCACGACATACTCAGC-3′,分别。25岁的反应系统
μ L,包括95°C条件5分钟紧随其后40周期94°C的20年代,55°C 20年代和30年代的72°C。分离效率曲线被用于分析的特异性PCR产品,和循环阈值(
C T )方法用于定量mRNA分析。的
C T GAPDH作为内部参考的价值,和相对mRNA的表达等一个 受体是基于计算值。
2.5。免疫印迹分析
每个样本都包括两个从同一组肠系膜动脉。•瑞帕裂解缓冲含有蛋白酶抑制剂的添加,以及匀浆。BCA试剂盒用于蛋白质的量化。提取的蛋白质进行sds - page隔离和PVDF膜转移紧随其后。炼乳(5%;准备与T-TBS缓冲区)申请样品阻塞。主要包括抗体等一个 受体抗体(稀释,1:500;美国GeneTex, Inc .),二类PI3K抗体(1:1000;细胞信号技术),p-NF -
κ B p65抗体(1:1000;细胞信号技术)、Beclin-1抗体(1:3000;Proteintech生物技术公司,美国),LC3抗体(1:500;Proteintech生物技术)、p62抗体(1:3000;Proteintech生物技术),NF -
κ B抗体(1:3000;Proteintech生物技术),GAPDH抗体(1:1000;Proteintech生物技术),他们准备用PBS含有2%牛血清白蛋白作为稀释剂。第二抗体是peroxidase-labeled山羊anti-rabbit免疫球蛋白和山羊anti-mouse免疫球蛋白(,1:5000)。图像拍摄和图像评估版本。4.0(日本富士胶片影像有限公司)进行光密度分析。灰度自校正。靶蛋白的水平提出了乐队灰度之间的比率的目标基因和看家基因。
2.6。血清oxLDL决心
动物牺牲后,眼球被切除,和血液收集。血液样本被凝固在室温下30分钟。样本是离心机在845 g×30分钟在4°C,和上层清液收集进行分析。血清的浓度oxLDL决心使用酶联免疫吸附测定(elisa)。执行的程序都严格按照设备指令(Dakewe生物科技有限公司、深圳、中国)。标准曲线生成基于oxLDL内容的示例。
2.7。统计分析
数据均值±SEM。血管环的收缩反应表现为相对于收缩比例由63.5毫米的K+ ,响应特性描述与最大收缩比例(
E 马克斯 )和负对数受体激动剂的浓度导致了一半
E 马克斯 (压电陶瓷50 )。统计分析和策划与棱镜8.0软件进行。未配对学生的
t 以及与韦尔奇的校正应用于比较两组数据。单向方差分析(方差分析)与Dunnett期末测验用于多重比较。双向方差分析与Bonferroni期末测验进行了相应比较两个数据点在每个浓度的两条曲线。
P
<
0.05
被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。血管环的收缩反应,动脉内皮去除的影响,oxLDL水平
血管环的收缩值在63.5毫米K+ 各组之间差异不显著(2.89±0.47 mN mmLDL;mmLDL + 3-MA, 2.78±0.38 mN;NS, 2.90±0.42 mN;低密度脂蛋白,2.86±0.44 mN;
P
>
0.05
,
n = 8)。每一个血管环preconstricted 20
μ 米5 -扩张10紧随其后
μ M呵,膨胀值低于5%的preconstriction值,表明内皮的完全删除。血清oxLDL浓度略有区别NS组和mmLDL集团,虽然没有观察到显著差异(112.58±6.38
μ g / L和111.32±5.84
μ g / L;
P
>
0.05
,
n = 8)。
3.2。抑制作用的3-MA mmLDL-Induced调节的表达等<子> < /订阅>受体
与NS组相比,mmLDL组显示明显增加等一个 受体介导的血管收缩,明显的量效曲线左移。的
E 马克斯 值从201.58±16.63% NS组增加到346.16±29.46% mmLDL集团(
P
<
0.001
),压电陶瓷50 值从8.05±0.05 NS组增加到9.11±0.09 mmLDL组(
P
<
0.01
)(图
1(一) )。mmLDL ET的水平增加一个 受体:mRNA的表达等一个 受体增加从1.06±0.05 (NS) 2.12±0.09 (mmLDL) (
P
<
0.001
),蛋白质水平等一个 受体增加从0.14±0.01 (NS) 0.32±0.01 (mmLDL) (
P
<
0.001
)(数据
1 (b) 和
1 (c) )。支持数据补充文件所示
1 。
图1
3-MA抑制mmLDL的影响等一个 在VSMCs受体。(一)3-MA对抗mmLDL-strengthened收缩曲线由ET-1剂量依赖性的方式。(b)的mRNA表达等一个 受体(相对于GAPDH;
n = 6)。(c)的蛋白质含量等一个 受体(
n = 4,每个样品池2肠系膜动脉)。数据均值±SEM。统计分析使用单向方差分析(方差分析)与Dunnett后续测试和双向方差分析Bonferroni期末测验。
∗
∗
∗
P
<
0.001
与NS组(生理盐水)。
#
#
P
<
0.01
和
#
#
#
P
<
0.001
与mmLDL组。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
探索3-MA对实验结果的影响,以及它的最佳剂量,动物被分成三个组3-MA腹腔内注射(5、15、25毫克/公斤)。3-MA抑制血管收缩的mmLDL-induced改进剂量依赖性的方式。与mmLDL组相比,5毫克/公斤组显示血管收缩曲线的稍微向右移,稍微降低
E 马克斯 值(346.16±29.46%和316.59±33.63%;
P
>
0.05
),稍微降低压电陶瓷50 值(9.11±0.09和8.82±0.09;
P
>
0.05
)。与mmLDL组相比,15毫克/公斤组表现出明显的收缩曲线的右转(
E 马克斯 :346.16±29.46%和242.85±27.25%,
P
<
0.001
;压电陶瓷50 :9.11±0.09和8.22±0.09,
P
<
0.05
)。尽管25毫克/公斤集团的收缩曲线显示稍微向右移15毫克/公斤的价格相比,差异无显著意义(25毫克/公斤组
E 马克斯 和压电陶瓷50 值分别为224.07±24.23%和8.05±0.06,分别;图
1(一) )。因此,15毫克/公斤作为3-MA进一步探索的最佳剂量的作用第三类PI3K / Beclin-1 upregulation的等一个 受体mmLDL引起的。3-MA 15毫克/公斤显著抑制ET mmLDL的加强效果一个 受体:mRNA表达和蛋白质水平等一个 受体降低为1.28±0.06 (
P
<
0.001
)和0.21±0.01 (
P
<
0.001
)(数据
1 (b) 和
1 (c) )。低密度脂蛋白的尾静脉注射1毫克/公斤没有显著影响等一个 受体介导收缩曲线(图
1(一) )。
3.3。抑制作用的3-MA mmLDL-Induced影响第三类PI3K Beclin-1, LC3 II /我和p62蛋白质
mmLDL尾静脉注射后,第三类PI3K的蛋白质含量,Beclin-1,和LC3 II /我从0.75±0.04,1.79±0.24,0.80±0.04,1.17±0.04,4.01±0.17,1.33±0.05 (
P
<
0.001
,
P
<
0.001
,
P
<
0.001
),分别和p62蛋白质含量从3.35±0.10 (NS)下降到1.23±0.09 (
P < 0.001)。3-MA显著降低mmLDL-induced第三类PI3K的蛋白质含量,增加Beclin-1,和LC3 II /我为0.84±0.05,2.36±0.34,0.66±0.03 (
P
<
0.001
,
P
<
0.01
,
P
<
0.001
),分别增加了mmLDL-induced p62蛋白质水平下降2.44±0.13 (
P
<
0.001
),这表明3-MA抑制自噬激活引起的mmLDL(数字
2(一个) - - - - - -
2 (d) ;补充文件
2 )。
图2
免疫印迹分析表明3-MA抑制的影响mmLDL第三类PI3K的蛋白质含量,Beclin-1, LC3 II /我和p62。(一)第三类PI3K的蛋白质含量。(b) Beclin-1的蛋白质含量。(c) LC3 II /我的蛋白质含量。(d) p62的蛋白质含量。所有的值表示为均值±SEM。
n = 4,每个样本的池2肠系膜动脉。统计分析是用单向方差分析Dunnett执行的测试后。
∗
∗
P
<
0.01
和
∗
∗
∗
P
<
0.001
与NS组(生理盐水)。
#
#
P
<
0.01
和
#
#
#
P
<
0.001
与mmLDL组。
(一)
![]()
(b)
![]()
(c)
![]()
(d)
![]()
(e)
![]()
3.4。抑制作用的3-MA mmLDL-Induced影响p-NF——<斜体>κB < /斜体>蛋白质
mmLDL组显示的水平增加arteriomesenteric p-NF -
κ B蛋白,增加从0.14±0.01 (NS) 0.41±0.02 (
P
<
0.001
)。3-MA集团与mmLDL组相比,显示出显著降低p-NF -
κ B水平(0.17±0.01;
P
<
0.001
;图
3(一个) )。NF -
κ B蛋白质含量在NS, mmLDL 3-MA + mmLDL组分别为0.15±0.04,1.16±0.01,0.14±0.01,分别(所有
P
>
0.05
;图
3 (b) )。这个分析的支持数据补充文件所示
3 。
图3
免疫印迹分析显示mmLDL的影响和3-MA p-NF——的蛋白质含量
κ B和NF -
κ b (a) p-NF——的蛋白质含量
κ b (b)的蛋白质含量NF -
κ b值表示为均值±SEM。
n = 4,每个样本的池2肠系膜动脉。统计分析是用单向方差分析Dunnett执行的测试后。
∗
∗
∗
P
<
0.001
与NS组(生理盐水)。
#
#
#
P
<
0.001
与mmLDL组。
(一)
![]()
(b)
![]()
4所示。讨论
mmLDL是心血管疾病的危险因素,对内皮细胞造成损害,并导致泡沫细胞的生产。然而,mmLDL的致病机制尚不清楚。本研究第一次表明,尾静脉注射mmLDL可以移植等一个 老鼠arteriomesenteric平滑细胞受体水平加强等一个 受体介导的血管收缩。此外,本研究发现,第三类PI3K / Beclin-1自噬通路参与arteriomesenteric的监管等一个 老鼠受体水平
在活的有机体内 第一次。
增加等一个 受体水平起着重要的作用在多种心血管疾病的发病机制,如高血压[
16 ,
17 ),肺动脉高压(
18 ,
19 )、扩张型心肌病和微血管功能障碍(
20. ,
21 ]。等一个 受体敲除能扭转或自噬的差别减少aging-induced对这些标记(
6 ]。由心肌细胞保护等一个 受体敲除或等的应用一个 受体拮抗剂,自噬发挥了至关重要的作用
22 ]。3-MA消除了影响心血管等引发的蛋白质一个 受体拮抗剂BQ123,抑制自噬小体的形成和溶酶体的降解;然而,这两个可以抵消这些影响一个 受体敲除(
6 ]。在这项研究中,3-MA抑制了mmLDL-induced upregulation等一个 受体,这也表明自噬的重要角色的监管和保护心血管系统。
自噬与心血管疾病密切相关:生理条件,如营养不良、可以诱导自噬的孤立的心肌细胞,血管上皮细胞,VSMCs [
23 ]。在这种情况下,自噬可以改善细胞器和蛋白质的积累和降解是低于正常水平
24 ]。在心血管的压力下,如缺血再灌注心脏衰竭,自噬可以被激活。然而,自噬是否有益或有害的在这些条件下的压力没有明确确定(
25 ,
26 ]。
VSMC自噬在血管疾病发展具有重要的作用[
27 ]。在自噬过程中,microvessel-associated LC3-I转换从胞质形式LC3 phosphatidylethanolamine-binding形式(LC3-II)促进自噬小体的形成,从而维持其经济增长。LC3-II的形成通常是作为指标的自噬激活(
28 ]。在这项研究中,LC3-II表现出相对较高的蛋白质水平VSMCs mmLDL注射后,这表明mmLDL VSMCs的自噬水平增加。相比之下,3-MA抑制的影响mmLDL自噬激活和表达下调的蛋白质比LC3-II / LC3-I,这表明3-MA VSMCs的自噬水平降低。
p62(脚手架蛋白)和LC3-II与polyubiquitinated蛋白质相互作用,导致后者的退化。自噬的激活过程可以减少p62的内容。因此,p62水平可以表明自噬是否完整(
29日 ]。在这项研究中,与NS相比,mmLDL显著降低VSMCs p62水平
在活的有机体内 ,这表明mmLDL激活自噬过程。
Beclin-1与自噬空泡的形成,及其水平被认为是一个可靠的标记来检测自噬流量(
30. ]。在这项研究中,与NS相比,mmLDL调节Beclin-1和III类PI3K蛋白水平,这表明mmLDL提升VSMCs自噬空泡的形成。mmLDL不仅增加了等一个 受体水平VSMCs VSMCs还诱导自噬。
NF -
κ B通路参与upregulation等B 在VSMCs体外受体(
31日 ]。物转录因子,NF -
κ B具有显著的增殖和凋亡和促炎的效果。NF -的激活
κ B上调Beclin-1和促进自噬
32 ]。Beclin-1 / Atg 6和III类PI3K / Vps 34联合行动,招聘自噬催化剂和抑制剂调节自噬小体的形成在一个特定的方式(
33 ]。LC3磷脂酰乙醇胺结合,这使它与自噬小体的膜集成自噬小体的形成(
34 ]。在这项研究中,mmLDL调节蛋白磷酸化水平的NF -
κ B,而3-MA mmLDL-induced增加使之抑制NF -
κ B磷酸化,这表明,第三类PI3K / Beclin-1参与NF -
κ B激活。本研究首次阐明NF -
κ B通路参与了mmLDL-induced upregulation等一个 在VSMCs受体。
mmLDL上调第三类PI3K的蛋白质含量,Beclin-1,和LC3 II /我在arteriomesenteric VSMCs和p62会使蛋白质含量;即mmLDL激活自噬VSMCs和上调蛋白质和mRNA的表达等一个 受体加强等一个 受体介导的血管收缩效应。此外,自噬的激活VSMCs upregulation的影响等一个 受体。3-MA会使增加引起的自噬水平的upregulation mmLDL,抑制等一个 受体mmLDL所致。因此,mmLDL激活自噬arteriomesenteric VSMCs
在活的有机体内 对移植等一个 受体的水平。