新颖二甲基乙酰胺，含制剂改善眶下麻醉效能与牙周炎大鼠

抽象

背景.为了评估含有新二甲基乙酰胺衍生物，抗氧化，和在大鼠慢性牙周炎的血管收缩剂的制剂的急性毒性和局部麻醉活性。方法. 以2%水溶液为溶剂，研究了新型麻醉剂二甲基乙酰胺配方LHT-15-32。测定其急性静脉和皮下毒性。测定实验性牙周炎大鼠上第二磨牙痛敏阈值。采用化学发光法测定大鼠牙龈黏膜氧化应激活性和总抗氧化能力。牙周组织形态学观察局部变化。组织IL-1β，IL-10和TNF-α浓度进行定量酶联免疫吸附测定法评估。LHT-15-31的Na-阻断活性进行了研究上的分离的神经元Limnaea stagnalis”咽旁神经节。查出的坐骨神经拉纳radibunda用不同浓度的LHT-15-32来评估其导电性灌注。Statistical analysis was used, and continuous variables were presented as mean ± square deviation. The normality of distribution was determined using ANOVA. Newman–Keuls parametric criterion was used for intergroup comparison. LD₅₀指标通过概率分析计算。结果.LHT-15-32急性静脉内和皮下毒性比其活性物质的低。The formulation by infraorbital administration induced deep dental anaesthesia which lasted over 70 min and activated the local antioxidant defense system and decreased IL-1β在牙龈组织的水平。各地在大鼠的影响上臼齿LHT-15-32触发组织修复评估给药后五天。在10^-6个到10^-3个 M concentration, LHT-15-32 inhibited sciatic nerve conductivity and blocked Na⁺在以剂量依赖的方式分离的神经元的信道。结论.该制剂可以被认为是一种有效的和安全的方式与牙周炎麻醉上臼齿。

1.介绍

现代临床实践，尽管在创造新的局部麻醉剂（LA）和优化将药物输送到暴露部位的技术方面取得了明显的成功，但在实现LA的最佳镇痛效果方面仍然遇到困难[1个]。其中最常见的原因为缺乏牙科LA效力的是，几乎总是LA施用给患者的牙髓，根尖区，牙周，或肺泡区域[面积炎症过程1个,2个]。

采用渗透法或神经阻滞时期间牙髓炎或根尖周炎[从业者经常遇到足够的深度和牙齿麻醉与炎症的持续时间的诱导很大的困难三]。临床研究表明，下牙槽神经阻滞下磨牙炎症过程的患者中，30-45%的失败或19-56%的低成功，即使在由经验丰富的临床医生进行麻醉的情况下[4个]。既不颊和舌，也不神经的传统块的浸润麻醉的组合伴随着增加操作的效率。因此，在牙科麻醉充足的问题，现在是两个临床和实验药理学家的一个重要挑战[1个,4个]。

利多卡因作为LA成功使用的悠久历史，因为它已经在20的中部被首先给药^日世纪(5个]。利多卡因通过钠的可逆阻滞抑制神经传导⁺由于它的抗氧化特性，可以引导和稳定细胞膜。作为一种单一疗法或与血管收缩剂联合使用，除了局部炎症外，它一直表现出令人满意的麻醉效果[1个]。

这项研究的目的是评价含有新二甲基乙酰胺衍生物，抗氧化，和在大鼠慢性牙周炎的血管收缩剂的制剂的急性毒性和LA活性。

2。材料和方法

2.1。伦理

这项研究已符合GLP标准和用于试验和其他科学目的法规的欧洲公约保护脊椎动物动物的所有要求。该研究方案已审查并谢切诺夫大学生物伦理委员会（莫斯科，俄罗斯）7月6日批准，2017年（第一次会议7，登记号，6/7 / 2017-11）。

2.2。药物制剂

新制剂（实验室代码：LHT-15-32）已经在药物化学和生物活性化合物的全苏科学中心的药物设计（AUSC BAC，俄罗斯）含有2％水溶液N-乙酰部被开发L-谷氨酰胺2-二乙基氨基-2'，6'- dimethylphenylacetamide（实验室代码：LHT-4-00，AUSC BAC;化学纯度：99.75％）作为活性物质。Every 1 mL of the solution contained 2 mg of ethyl-methyl-hydroxypyridine malate (EMHPM) and epinephrine 1 : 200,000. Pharmacological property of LHT-15-32 has been compared with LHT-4-00 alone solubilized in distilled water临时和利多卡因（利多卡因HCI，20 mg/mL，20 mL，Hospira公司，美国）。两种参比药物的浓度均为2%。在引入前，用8.4%碳酸氢钠测定每个试验溶液的pH值，并将其调整至7.35，同时考虑溶液的体积和浓度。

2.3。动物和生物对象

55只雄性18-20 g的白种杂交小鼠和15只青蛙(拉纳radibunda)是从俄罗斯科学院(RAS)的实验动物育种设施获得的。在俄罗斯RAS理论与实验生物物理研究所动物饲养设施购买了65只斯普拉格-道利雄性大鼠，体重250-300克。动物在无致病性条件下和自然光照周期下饲养。提供了无菌食品和水自由采食，并保持室温（25   2°C）和湿度（60   10%）。小鼠随机分为11组进行毒理学实验。将50只大鼠随机分为5组，每组10只：正常大鼠、对照组、利多卡因、LHT-4-00和主要组；15只动物分为3组，每组5只（正常组、对照组和主要组），进行形态学检查。在刺激前，将青蛙坐骨神经标本分离出3.5厘米长，在22℃的林格溶液中保存30-40分钟。从咽旁神经节分离出不同的神经元Limnaea stagnalis.

2.4。急性毒性试验

LHT-15-32急性静脉(IV)毒性评估与之前描述的平均剂量(LD)评估方法相同₁₀₀），这引起动物的死亡（GAD，1990年）。该制剂皮下（SC）的毒性（LD₅₀）被注册在分配给一个明确的剂量组LHT-15-52注射后14天的小鼠如先前所述[6个]。

2.5。牙周炎的建模

如前所述，在麻醉（硫喷妥钠，Sandoz，GmbX，奥地利；40 mg/kg，IV）的雄性Sprague-Dawley大鼠中诱发实验性牙周炎，将其分为所有组，但用丝线（5-0，Ethicon Inc.，美国）结扎第二个上磨牙，使其保持完整[7个]。

2.6。牙科麻醉评估

On day 15, the anaesthetized animal (thiopental sodium, SANDOZ, GmbX, Austria; 40 mg/kg, IV) was placed on a heated platform of a stereotaxic system SR-5R (Narishige Co, Ltd, Japan) equipped with a portable drill. Two holes 0.3 mm in diameter and 3.0–3.5 mm in depth were drilled in the second upper molar, where free ends of a platinum-stimulating electrode (ADInstruments, USA) were fixed with a drop of plastic filling. The other ends of the electrode were drawn out through the hole in the cheek skin on the animal’s withers and fixed with purse skin suture. Four days later, rectangular impulses (100 imp/s for 5 s) of increasing current strength from 0.1 to 10 mA (BIOPAC MP-160, BIOPAC Systems Inc., USA) were applied to the tooth to achieve a pain sensitivity threshold (PST) registered by occurrence of the animal motor reaction and vocalization. Test solution (0.2 mL) was administered infraorbitally 10 min after baseline PST registration (zero-level of PST). Full anaesthesia was suggested if 5 s-long 10 mA stimulation caused no animal reaction (100% level of PST).

2.7。局部氧化应激试验

我们使用Fe引起的化学发光，以评估后LA电平测量用硫喷妥钠第二天过量大鼠牙龈黏膜组织的匀浆氧化应激活性（OSA）和总的抗氧化能力（TAC）如先前所述[八]。

2.8。酶联免疫吸附测定（ELISA）

IL-1β，使用大鼠白细胞介素1中，通过定量ELISA大鼠牙龈组织匀浆检测IL-10和TNF-α的浓度β（CSB-E08055r），白细胞介素大鼠10（CSB-04595r），和鼠TNF-α（CSB-11987r）ELISA试剂盒（Cusabio技术，LLC，中国）和StatFax 4200自动阅读器（USA）。

2.9。坐骨神经传导性分析

坐骨神经试样由含氧的Tyrode溶液（mM的灌注：;氯化钾，4，0;氯化钠，145，0的MgCl_2个，1，0;氯化钙_2个，1，80；崔斯，5。0；葡萄糖，10。0；pH值7.3–7.5），含10^-3个，10^-4个，10^-5个或10^-6个 M concentrations of LHT-15-32 at 22–24°C. To create moderate acidosis, the pH of the Tyrode solution was adjusted to 6.5–6.7 by HCl. The specimen was stimulated by linear impulses of increased current strength using gold-plated brass electrodes (ADInstruments, USA) and a BIOPAC MP-160 system. Action potential (AP) amplitude was measured and expressed as % of baseline.

2.10。娜⁺通道阻塞活动

我们所用的补丁丛方法的全细胞构型来访问通过钠离子电流⁺非分化神经元的通道。用含氧溶液（mM:CsCl，120；Tris-OH，2，pH 7.3-7.4）透析神经元。用LHT-15-32溶液（mM:NaCl，110；MgCl）灌流外膜表面_2个和Tris OH，2，pH值7.5）[9个]。

2.11。形态学评估

为了评估当地的形态变化，围绕大鼠受影响的摩尔软组织从完整，控制和主要群体，硫喷妥钠过量，被洛杉矶评估五天后检查。显微镜载片通过标准程序制成：组织在10％中性缓冲福尔马林中地固定并包埋在石蜡（LP莱卡1020组织处理，德国）。然后，石蜡块的切片用下列脱石蜡并用苏木精和伊红染色进行（徕卡RM 2265，德国）。三微米的组织载玻片通过光学显微镜观察徕卡用数码相机DMC5400（德国）。

2.12条。统计分析

获得的数据的统计处理进行了使用SPSS（16.0版）[10]。Continuous variables were presented as mean (M) value ± square deviation (SD). The normality of distribution was determined by one-way analysis of variance (ANOVA). Newman–Keuls parametric criterion was used for intergroup comparison. LD₅₀索引通过概率单位分析计算[6个]。

3。结果与讨论

3.1。结果

Acute toxicity of the IV administered formulation for mice was 205 ± 7 mg/kg vs. LD₁₀₀index of its active substance alone averaged 108 ± 12 mg/kg ( ,数字1个). LD₅₀indexes of both the formulation and its active component LHT-4-00 for the SC route were significantly higher (657 ± 21 mg/kg and 297 ± 20 mg/kg for LHT-15-32 and LHT-4-00, respectively) than for IV route of administration.

Infraorbital injection of lidocaine led to a moderate dental anaesthesia onset in rats with periodontitis which lasted no long than 17.3 ± 2.3 min (Figure2个）。LHT-4-00深度麻醉牙齿麻醉登船的较低速度。The duration of painkilling averaged 32.4 ± 3.4 min (当用利多卡因相比）。The formulation induced full anaesthesia onset 32.1 ± 1.7 min after infraorbital injection. Rats of the main group did not react on painful incentives during 72.1 ± 2.6 min of stimulation (当用利多卡因和LHT-4-00）相比。

OSA水平在大鼠牙周炎牙龈黏膜时与完整动物相比（见表比增加了三倍多1个)，而TAC则成比例下降。所有受试溶液在眶下给药后一天引起局部氧化应激活性的变化。利多卡因组大鼠牙龈组织OSA降至6.4±0.7×10^三 imp/s, LHT-4-00 to 5.3 ± 0.4 × 10^三 imp/s和LHT-15-32至3.2 ± 0.3 × 10^三 imp/s (与利多卡因相比）。利多卡因组TAC值为1.7±0.4×10^三imp/s, LHT-4-00组3.9±0.3×10^三 imp/s, and in the main group 4.7 ± 0.5 × 10^三 imp/s (当用利多卡因相比）。牙周炎用两个IL-1相关联β与IL-10组织水平的凹陷沿着TNF-α升高。不同于利多卡因组，主组中，IL-1β和而IL-10的浓度保持不变TNF-α组织水平显著下降（表1个）。

在生理性和中度酸中毒条件下，坐骨神经标本的AP振幅随含LHT-15-32溶液灌注量的减少而减小（图三）。LHT-15-32在10^-6个到10^-3个 M concentration applied at the outer side of the neuronal membrane in a dose-dependent manner blocked Na channels of isolated neurons (Figure4个）与计算出的EC₅₀7.78 × 10^-5个 M.

动物牙齿完好的牙龈组织形态学评估显示没有变化：粘膜覆盖着正常鳞状上皮。黏膜下层是由结缔组织纤维，成纤维细胞和毛细血管与淋巴细胞数目的限制的。牙周膜被保留下来（图图5（a）和图5（b）). 实验性牙周炎表现为中性粒细胞浸润和牙周组织溶解（图图5（c）和图5（d））。在主组大鼠围绕影响上臼齿LHT-15-32触发软组织修复的眶下给药（图图5（e）和图5（f））。我们观察到，它覆盖鳞状上皮黏膜。粘膜下层和牙周韧带包含成熟肉芽组织与众多的成纤维细胞，淋巴细胞，巨噬细胞，和毛细管型容器。

3.2。讨论

许多从业者一直在经历LA行动的失败在麻醉的患者牙牙周炎。操作过程中增加的不适甚至会导致不良的临床结果，并不能令人满意的结果[11]。有几个原因已经被提出来解释缺乏相关的牙科诊所炎症过程LA效果。其中，周围血管系统上的（a）的效果;（2）由于局部氧化应激激活伤害感受器损伤;和（3）降低的LA的生物靶标的灵敏度最大的重要性[1个]。新制剂LHT-15-32已经发展到解决其中的一些，因此提高牙科诊所的疗效和疼痛控制的安全性。

所述制剂含有N-乙酰基-L-谷氨酸二甲基乙酰胺的盐（利多卡因）（LHT-4-00），具有改进的药理学性质（例如，深度和LA功效的持续时间），作为活性成分[12]。The study results demonstrate prolonged LA effect of the formulation in animals with periodontitis in comparison not only with lidocaine but with LHT-4-00: LHT-15-32 induces a full anaesthesia onset 32.1 ± 1.7 min after infraorbital injection with no less than 72.1 ± 2.6 min of its duration. As体外实验表明，LHT-15-32在各种各样浓度压下分离神经传导性（10^-6个-10^-3个 M) applied at the outer side of the neuronal membrane blocks Na channels in a dose-dependent manner. Nevertheless, satisfactory pain control in this case cannot be explained only by Na⁺通道阻塞和神经传导性抑郁症，因为这两个参考药物作用类似[13]。

合理的解释可能与配方中的抗氧化和血管收缩成分有关。Tsuchiya等人。已经证明细胞膜氧化应激和LA活性之间的直接关系[1个]。LHT-15-32对大鼠牙龈组织中OSA和TAC的平衡作用优于其单一治疗的活性成分。值得注意的是，局部牙周和牙龈炎症过程的减少可能直接与LA改善和药物安全性有关[14]。库尼亚等。已经表明IL-1的关键作用β在炎症反应和TNF-α痛觉过敏发展(13]，而Zhang等。在牙槽骨修复IL-10的报道足够参与牙周炎患者[15]。降低IL-1β和TNF-α水平在一天后LHT-15-32喷射示出了药物参与细胞因子的调控，因此批准药物的抗炎性质。急性毒性数据与作用部位的局部形态变化相结合可提供约LA药品安全的有价值的信息，研究人员。LHT-15-32的急性毒性比其活性物质LHT-4-00，经由施用血管内和皮下途径的显著低。与此同时，围绕阻生牙显示软组织形态学检查组动物的触发修复的特点是例行LHT-15-32诱导LA的前五天。

但是，拟议的提法并非没有限制。组织和药物溶液pH值是一个临界点，对LHT-15-32同样重要。因此，为了实现有效的疼痛控制，配方的pH值应该进行调整临时，这是与一些不便相关联。

总体上，所提出的配方可以被视为其病理改变麻醉牙齿的有效和安全的工具。

4。结论

新型配方LHT-15-32毒性比其活性物质和利多卡因小，能诱导牙周炎大鼠上磨牙深而长的眶下麻醉，抑制牙龈组织的氧化应激反应和炎症过程，在钠所致中度酸中毒的情况下抑制孤立神经传导⁺电流阻断。因此，该制剂可以被认为是在牙周炎的有效和安全的方法来牙科麻醉。

数据可用性

发明的LHT-4-00物质的抽象用于支持该研究已沉积在俄罗斯联邦服务的知识产权库（调查结果http://www1.fips.ru/ofpstorage/Doc/IZPM/RUNWC1/000/000/002/657/613/ИЗ-02657613-00001/DOCUMENT.PDF）。

的利益冲突

作者宣称，有兴趣就本文发表任何冲突。

致谢

这项工作部分是由俄罗斯政府研究理事会资助项目（批准号：2017-14-N08-0036）。作者非常感谢他们的同事对稿件的严格审查，并以他们的实验室工作人员进行专门的援助。

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