自由基清除活性和铁还原能力Juniperus thurifera(l),j . oxycedrus(l),J. Phoenicea.(l)和Tetraclinis Articulata.(l)

摘要

客观的．本研究的目的是研究和比较叶水提取物的抗氧化性能和酚含量Juniperus thurifera，Juniperus oxycedrus，Juniperus Phoenicea,和Tetraclinis Articulata.从摩洛哥。方法．采用2,2-二苯基-1-苦基肼(DPPH)自由基清除能力、Trolox等效抗氧化能力(TEAC)和铁还原抗氧化能力(FRAP)测定其抗氧化活性。分光光度法测定了提取物中总酚和总黄酮的含量。结果．与标准抗氧化剂(丁基羟基甲苯(BHT)、槲皮素和Trolox)相比，所有提取物均表现出有趣的抗氧化活性。水提物Juniperus oxycedrus经DPPH、TEAC和FRAP测定，其抗氧化活性最高₅₀的值μg / ml，μg / mLμ克/ ml分别。在抗氧化能力和总酚类内容物之间观察到的强相关性表明酚类化合物是这些植物提取物的抗氧化性能的主要因素。结论．这些结果表明Juniperus thurifera，Juniperus oxycedrus，Juniperus phoenicea,和Tetraclinis Articulata.可以构成具有抗氧化能力的天然化合物的一个很有前景的新来源。

1.介绍

研究人员正在寻找对人体健康没有任何副作用的天然抗氧化剂。研究人员正在寻找更新、有效和安全的抗氧化剂，以便在食品和药物制剂中使用它们来取代合成的抗氧化剂。

药用植物是具有抗氧化活性的化合物的主要来源。几项研究报告了摩洛哥药用植物的有趣成分，包括酚酸、类黄酮和单宁，这些物质作为抗氧化剂对健康有益[1- - - - - -3.]．

摩洛哥植物群包含超过4200种维管植物。然而，很少有药物经过药理或化学性质的筛选[4]．其中，柏科是世界上最常见的针叶树(裸子植物)科。事实上，它们给地中海盆地的植物景观留下了深刻的印象，是世界生物多样性的热点之一。柏科植物生长于海岸至高海拔地区，也能在极端的生态条件下生长，被认为是摩洛哥传统医学中最重要的芳香植物之一。

最近的研究确认了柏科植物的许多传统用途的有效性，报道称柏科植物提取物含有大部分重要的酚类化合物，特别是黄酮类化合物、新木质素和苯丙素[5- - - - - -7]．在此背景下，根据四个被选物种(Juniperus thurifera，Juniperus phoenicea，Juniperus oxycedrus,和Tetraclinis Articulata.)，评价该植物科的化学分类学和药理差异是很有趣的。在世界上一些地区，这些物种在传统医学中有许多用途。瞻博网络浆果被用作香料，特别是在欧洲烹饪中，这是唯一的香料来自针叶树。在摩洛哥，柏科植物的焦油、叶子和果实被广泛用于治疗不同的头发和皮肤问题，如头皮屑、湿疹、瘙痒和真菌感染[8]．此外，柏科植物的干叶冲剂可用于内服治疗风湿病、腹泻和糖尿病。这些健康益处的部分原因可能是它们的抗氧化剂的潜在影响，如酚类化合物对人体产生的活性氧[9，10]．

因此，本研究旨在确定和比较水叶提取物的抗氧化潜力Juniperus thurifera，Juniperus phoenicea，Juniperus oxycedrus,和Tetraclinis Articulata.采用DPPH自由基清除活性(DPPH)、Trolox等效抗氧化能力(TEAC)和铁还原抗氧化能力(FRAP)测定其总酚含量，并探讨总酚含量与抗氧化活性的关系。

2.材料和方法

2．1．植物材料

2014年2月，树叶落了j . thurifera，j . Phoenicea，j . oxycedrus和t .关节动物分别来自Oukaimeden、essaououira、Ourika和Ait Issi Ihahan地区的野生居群。收集地点的特点见表1．叶片经Pr. Fennane鉴定，代金券标本保存于拉巴特科学研究所植物标本室，编号为79594 (j . thurifera), 79592 (J. Phoenicea.), 79588 (j . oxycedrus)和79589 (t .关节动物）.采集的植物材料在室温(20-24℃)风干。干燥植物的叶子从植物中分离出来，保存在密封的深色容器中直到使用。

2．2．植物提取物的制备

将干燥粉状植物材料10 g浸泡在100 mL沸腾蒸馏水中，室温静置30 min，制备水提物。热液用Whatman滤纸过滤，在60°C的旋转蒸发器真空浓缩，4°C保存备用。

2．3.抗氧化活性

2.3.1。清除DPPH自由基活性

水提取物的能力j . thurifera，j . Phoenicea，j . oxycedrus和t .关节动物清除DPPH自由基的方法采用Şahin等[11]．等分50μ从DPPH甲醇溶液(60μM)。将反应混合物摇匀，室温黑暗孵育20 min，在517 nm处记录吸光度。空白部分由甲醇代替提取物组成。以丁基羟基甲苯(BHT)和槲皮素为阳性对照。样品对DPPH自由基抑制率的计算公式如下: 在哪里是对照样品的吸光度和为测试样品的吸光度。样品浓度提供50%的抑制(IC₅₀)是由不同浓度的抑制作用曲线确定的。

2.3.2。Trolox等效抗氧化能力(TEAC)测定

根据Loizzo等的方法测定各样品的ABTS自由基清除活性[12]．ABTS与每硫酸钾反应生成ABTS自由基阳离子。使用前16小时，将ABTS (2 mM)和过硫酸钾(70 mM)的混合物置于室温黑暗中过夜，形成自由基阳离子ABTS。然后用80%甲醇稀释ABTS溶液，得到吸光度为在734纳米。100年μ将适当稀释的样品L加入2ml ABTS溶液中，室温孵育1 min后，在734 nm处记录吸光度。用不同浓度(0 ~ 0.24)的Trolox标准溶液得到标准曲线μg / mL)。同时测定不同浓度的提取物和部位对ABTS自由基的清除能力，计算其清除能力₅₀，其清除DPPH的方法与上述方法相似。

2.3.3。还原能力测定

采用铁氰化钾-氯化铁法研究了萃取物的铁还原能力[13]．简单地说，不同浓度的每个提取物0.2 mL，磷酸盐缓冲液2.5 mL (0.2 M, pH 6.6)，铁氰化钾2.5 mL_3.铁(CN)₆(1%)混合，50℃孵育20 min，使铁氰化物还原为亚铁氰化物。加入2.5 mL 10% (w/v)三氯乙酸终止反应，1000 rpm离心10分钟。最后将上层2.5 mL与2.5 mL蒸馏水和0.5 mL FeCl混合_3.(0.1%)，在700 nm处测定吸光度。样品浓度提供0.5的吸光度(IC₅₀)通过绘制吸光度与相应样品浓度的关系图来计算。以BHT和槲皮素为对照品。

2.3.4。总酚含量的测定

采用Folin-Ciocalteu比色法分光光度法测定总酚含量[14]．简单地说,20μ提取液与1.16 mL蒸馏水和100 mL蒸馏水混合μL of folin-ciocalteu试剂，然后加入300 μL (Na₂有限公司_3.解决方案(20%)。在40°C孵育30分钟后，在760 nm处测量反应混合物的吸光度。以没食子酸为对照品，结果以毫克没食子酸当量表示(μg GAE)/mg植物提取物干重(edw)。

2.3.5。总黄酮含量的测定

用氯化铝比色法测定总黄酮含量[15]．取0.5 mL槲皮素提取物或槲皮素标准溶液与0.5 mL 2% AlCl混合_3.．室温1 h后，在420 nm处测定吸光度。总黄酮含量以微克槲皮素当量表示(μG QE）/ Mg干植物提取物（EDW）。

２.４.统计分析

所有的测定都有3个重复。采用SPSS 20软件进行均数和标准差(SD)计算，抗氧化活性和酚类化合物组成以均数±SD表示，并进行方差分析以确定显著性差异。

3.结果

3．1.抗氧化活动

抗氧化活性是一个复杂的过程，通常通过多种机制发生，受多种因素影响，不能用单一的方法来描述。因此，要考虑到抗氧化作用的各种机制，必须进行不止一种类型的抗氧化能力测量[16- - - - - -18]．在这项研究中，采用了三种互补试验来评估抗氧化活性j . thurifera，J. Phoenicea.，j . oxycedrus和t .关节动物输液:DPPH自由基清除活性，Trolox等效抗氧化能力(TEAC)，还原能力测定。

如表所述2，各测定方法的抗氧化能力排序相同，即依次递减，j . oxycedrus,紧随其后的是j . thurifera，t .关节动物和j . oxycedrus．

所有提取物均能将稳定的紫色自由基DPPH还原为黄色DPPH。从…中提取的水j . oxycedrus清除自由基活性最强的是IC₅₀的价值μ克/毫升(表2）.另一方面，DPPH的还原能力最低J. Phoenicea.水提取物(集成电路₅₀＝μg / mL)。

所有水提取物都比合成的抗氧化剂BHT（IC₅₀＝μg/mL)和槲皮素(IC₅₀＝μg / mL)。相似地，j . oxycedrus在ABTS和IC还原功率测定中表现出最佳的性能₅₀＝μ克/毫升,μ克/ ml分别。

3．2．总酚类化合物

水提取物j . thurifera，J. Phoenicea.，j . oxycedrus和t .关节动物的特征是存在大量的酚类化合物(图1）.总酚类物质的含量最高的是j . oxycedrus(的） μg GAE/mg edw，其次为j . thurifera（的） μg GAE /毫克企业级数据仓库,t .关节动物（的） μg GAE/mg edw，和J. Phoenicea.（的） μg GAE /毫克仓库。

3．3.总类黄酮含量

黄酮类化合物的含量为6.70 ~ 20.81μg（qe）/ mg EDW（图2）.测定了高浓度的黄酮类化合物j . oxycedrus占，,μg（qe）/ mg EDWj . thurifera和t .关节动物分别。确定最低的黄酮浓度浓度J. Phoenicea.（μg (QE) / mg仓库)。

3．4．总抗氧化能力与酚含量的关系

为了评估用于确定四种抑制性物种的总抗氧化能力的三种测定方法的适用性和可靠性，我们对这些方法获得的总抗氧化能力的值进行了相关性分析。如表所示3.,所有在显着性水平，表明三种不同方法测定的抗氧化能力值是高度相关性的。DPPH值与ABTS活动强烈相关（)，并与FRAP值(）.ABTS和FRAP值之间的相关性也非常显著(）.

3．5．总酚含量、类黄酮含量与抗氧化活性的相关性研究

四种摩洛哥柏科样品的抗氧化能力与酚含量的相关性见表3.．DPPH法得到的抗氧化活性数据与总酚含量高度相关(）总黄酮浓度（）.总酚和类黄酮含量与ABTS (；)及FRAP价值观(；）.

4.讨论

氧化应激与多种疾病有关，包括糖尿病、类风湿关节炎、心血管疾病、动脉粥样硬化、神经退行性疾病(帕金森、阿尔茨海默和亨廷顿)、癌症和衰老[19- - - - - -21]．来自植物的天然抗氧化剂如酚醛酸和来自植物的黄酮类化合物可以通过清除自由基，抑制脂质过氧化，并通过其他机制来提供抗氧化应激的抗性[22，23]．因此，本研究的目的是通过三种众所周知的方法(DPPH, ABTS，并探讨其抗氧化活性与提取物中总酚和黄酮类化合物含量之间可能的相关性。

其实所用的方法有不同的反应机制[24]．例如，DPPH和ABTS分析基于电子和H原子转移，而FRAP分析基于电子转移反应[24- - - - - -26]．三种方法均表明所研究的植物具有较强的抗氧化和抗自由基活性。

此外，这三种方法之间的相关性表明，这三种方法都是适用的和可靠的评价植物提取物的总抗氧化能力。

对生长在摩洛哥的4种柏科植物进行筛选，结果表明:柏科植物的叶水提取物j . oxycedrus对DPPH有最强的清除活动（μg / mL)、abt (μg/mL)，且最佳性能降低功率活性(μg / ml）随后是叶子提取物j . thurifera（μ克/毫升(DPPH);μ克/毫升(abt);μ克/毫升(收紧)),t .关节动物（μ克/毫升(DPPH);μ克/毫升(abt);μ克/毫升(收紧))J. Phoenicea.（μ克/毫升(DPPH);μ克/毫升(abt);μ克/毫升(收紧))(表2）.这项工作还表明，主要的多酚类(类黄酮和酚酸)在不同的树种中是共同的，一些多酚化合物以前已在不同柏科树种的不同研究中被鉴定[27- - - - - -30.]．

关于柏科植物的抗氧化活性已有不同的报道。浆果和叶子J. Phoenicea.在ABTS和DPPH自由基清除活性测试中显示出较强的抗氧化活性，并提供了几种酚类物质(单宁、花青素和黄酮类)，这些物质被认为是该植物的自由基清除剂[31]．在研究土尔其抗氧化活性Juniperus［32，果实和叶子的水提物和乙醇提物j . oxycedrus通过铁还原抗氧化能力测定和DPPH自由基清除活性两种不同的测试，大多数化合物在这些体系下表现出较强的抗氧化作用，这与我们的数据相符。清除DPPH活性高Tetraclinis Articulata.在突尼斯采集的树叶也有报道[33]．

DPPH、ABTS和FRAP法测定的总抗氧化能力与酚含量之间存在较强的相关性3.)，表明酚类化合物在很大程度上促进了柏科植物的抗氧化活性，因此可能在这些重要药用植物的有益作用中发挥重要作用。结果与其他研究一致，有几项研究发现酚类化合物是选定植物的主要抗氧化成分，其抗氧化活性与总酚含量有直接关系[34- - - - - -37]．

5.结论

本研究中获得的发现支持这些植物物种作为治疗剂的传统用途。摩洛哥山脉的较高的抗氧化潜力通过其高酚含量赋予。J．oxycedrus提出了最高的TPC，TFC和抗氧化能力值。此外，叶片提取物的酚含量与抗氧化能力之间存在良好的相关性。这些结果表明水分从叶子中输注j . thurifera，j . oxycedrus，j . phoenicea和t .关节动物是抗氧化剂代谢物的重要来源。需要进一步的研究来确定它们的活性代谢物。

缩写

DPPH:	免费的自由基清除活性
问题:	Trolox等效的抗氧化能力
收紧:	铁还原抗氧化能力
BHT：	丁羟甲苯
j . thurifera：	Juniperus thurifera
J. Phoenicea.：	Juniperus phoenicea
j . oxycedrus：	Juniperus oxycedrus
t .关节动物：	Tetraclinis Articulata.
我知道了50：	具有50%抑制作用的浓度
TPC:	总酚类内容物
交通:	总黄酮内容
SD:	标准差。

相互竞争的利益

所有投稿作者声明没有相互竞争的利益。

致谢

作者感谢公关。科德菲克·贾马尔，医学院和药房学院的主任，他的友好支持，鼓励和对研究工作的兴趣，El Hassani Abdelmounm博士，地区水和森林和荒漠化控制局的工程师，为他的帮助收集植物材料，Pr。Fennane Mohamed，Scientific Institute，Rabat的植物学家，为他的帮助识别物种，以及药理学和毒理学实验室，医学和药房学院，穆罕默德v大学，拉巴特，摩洛哥，特别是公关的药理学和毒理学研究所。Zellou Amina和Doukkali Zohra，在实验工作中的善意建议。

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