血栓的纤溶酶降解Stenotrophomonassp。来自印尼大豆发酵食品Wistar鼠

文摘

目标。评估血栓纤溶酶的降解效果从食物来源Stenotrophomonas印度尼西亚的sp.。方法。在动物研究中,这种酶安全使用细胞培养进行了测试。对表达的影响组织纤溶酶原激活物也在细胞培养分析。为在活的有机体内研究中,使用25 Wistar鼠:正常控制,消极的控制,与原油和semipurified酶口服治疗组25毫克/公斤,与阳性对照组接受Lumbrokinase 25毫克/公斤。血凝块的尾巴被kappa注射角叉菜胶诱导1毫克/公斤体重。结果。细胞培养实验证实了该酶浓度的安全使用和增加tPA的表达式。减少血栓的阳性组中观察到70.35±23.11%的负控制动物(100%)。原油中的血栓观察酶治疗降至56.99±15.95%和71.5±15.7% semipurified酶。扫描电镜显示清楚,血液凝块被发现在动物注射kappa卡拉胶;然而,在治疗和积极的团体,血栓是大幅减少。结论。口腔治疗的酶Stenotrophomonassp.印尼发酵食品在Wistar鼠能够降低血栓引起的。

1。介绍

心血管疾病是报告为[1750万人死亡的主要原因1]。到2030年,每年估计有超过2300万人将死于心血管疾病,急性心肌梗死,因为血管血栓形成(2]。目前的药物,人体组织纤溶酶原激活物(t-PA),是一个主要的外在纤溶系统的激活(3)和丝氨酸蛋白酶家族中的一员,参与了纤维蛋白溶解(4]。溶栓药物在血凝块溶解纤维蛋白不仅用于心肌梗死也为血栓栓塞中风,深静脉血栓形成,肺栓塞清除堵塞的血管5,6]。溶栓治疗t-PA目前受限于reocclusion相对较高的发病率和抗再灌注,尽管治疗肝素化[7,8]。

组织纤溶酶原激活物物、链激酶、尿激酶激活纤溶酶原转化为物活性血纤维蛋白溶酶,进一步降低血液中纤维蛋白凝块。另一个有效的溶栓代理lumbrokinase地龙地龙直接和lumbrokinase-like蛋白质降解纤维蛋白(8- - - - - -10]。

链激酶、尿激酶也被认为是有效的溶栓药物治疗。然而,旁边是昂贵的,药物的副作用,如发生过敏反应由于链激酶政府已报告。试图寻找新的更自然和安全的药物来源因此被积极地追求。

微生物已被公认的血栓溶解剂来源,链激酶等溶血性链球菌和葡萄球菌激酶金黄色葡萄球菌(2]。更多的关注给微生物纤溶酶的食物来源,特别是传统的发酵食品,安全消费了几十年。后来发现报道的代理(NK)从纳豆激酶溶栓芽孢杆菌纳豆从日本分离发酵大豆食品(2,11]。此外,芽孢杆菌amyloliquefaciensDC-4和枯草芽孢杆菌ld - 8547与中国soybean-fermented食品豆豉还发现产生溶栓酶(12,13]。

筛查和隔离的纤溶菌Oncom制成印尼大豆发酵食品,透露一些细菌,这些细菌中我们发现Stenotrophomonassp。这一发现是独一无二的,因为大多数纤维蛋白溶解微生物的食物来源属于报道芽孢杆菌sp。印尼的细菌酶发酵的安全Oncom制成测试使用细胞培养和实验老鼠,而的影响Stenotrophomonas酶降解观察血栓使用实验老鼠。

2。材料和方法

三个细菌隔离Oncom制成从茂物获得农业大学,印度尼西亚。Κappa卡拉胶和胎牛血清(FCS)从Sigma-Aldrich购买,人类宫颈腺癌细胞系(海拉S3)和成纤维细胞亩骶细胞系(3 t3-sa)从美国购买类型文化集合(罗克维尔市,医学博士,美国),和杜尔贝科修改鹰的介质/ F12基础培养基(美国Gibco,卡尔斯巴德,CA)和penicillin-streptomycin (Gibco)是来自当地的代表。血小板计数,红细胞,白细胞,血小板分布宽度,和平均微粒体积测定半自动的血液学分析仪mek - 6450 k(日本Kohden、日本)。电池包稀释剂(日本Kohden、日本),autofine涂布机JEOL JFC 1600和扫描电子显微镜JEOL地产- 6510是用生物分子科学实验室提供的,用的书。

2.1。酶的生产

细菌分离株生长在酪素培养基,组成的0.5% (w / v)酪蛋白,0.5% (w / v)的葡萄糖,0.6% (w / v) Na₂HPO₄2 h₂啊,0.2% (w / v)酵母提取物,0.1% (w / v)氯化钾,0.01% (w / v) MgSO₄7小时₂O;媒体的pH值调整到8.5。孵化了一夜之间在37°C和120 rpm。吸光度测量在600纳米细菌生长。胞外酶是收获在8930 g离心后30分钟。颗粒被删除,上层清液(粗酶)保持在−20°C到使用。硫酸铵65% (w / v)被添加到粗酶和保持在4°C,激起了一夜之间,和离心机在15880克15分钟在4°C。上层清液被颗粒收集和溶解与磷酸盐缓冲20毫米,pH值7.5。纤维蛋白降解试验后的酶活性进行了分析(14),而蛋白质含量是化验后洛瑞法(15]。

2.2。细胞培养和治疗

S3海拉细胞被培养在F12基础培养基,而3 t3 SA在杜尔贝科修改鹰的培养基培养细胞用10%胎牛血清和1% penicillin-streptomycin补充。这些细胞被孵化有限公司37°C的5%₂的气氛。媒介是每2 - 3天更换一次,直到达到80%的细胞融合。文化是subcultivated的比率1:4使用1毫升trypsin-ethylenediaminetetraacetic酸(Gibco)。在治疗之前,细胞无血清培养系统中维护。原油和治疗semipurified酶在不同的浓度。每个浓度的实验重复了四次测试,治疗和持续时间是24小时。

2.3。MTT(微量培养四唑盐)测定

FCS、谷酰胺、碳酸氢钠、青霉素和链霉素是添加杜尔贝科的修改鹰/ F12基础培养基。海拉S3和3 t3细胞增多和亚文化在75厘米²培养瓶(猎鹰,BD)在这些媒体,在37°C下CO分压的5%₂。增加海拉S3和3 t3细胞分离利用trypsin-ethylenediaminetetraacetic酸和悬浮在新的媒体。后达到80%汇合的状态,细胞在治疗之前serum-starved原油和semipurified酶。这些细胞被孵化与不同浓度(0、1、3、5、10、20、40、80、160、320年和640年μg / mL)的酶Stenotrophomonassp。蜡样芽胞杆菌,和地衣芽孢杆菌为24小时。年底的孵化,20μL(麻省理工了,孵化又持续了4个小时。最后,盘子是使用微型板块阅读读者(美国BIO-RAD) 590海里。

2.4。逆转录聚合酶链反应

S3海拉细胞培养与FCS 10%直到到达汇合的状态,处理原油和semipurified酶24小时,并进一步在5%孵化有限公司₂在37°C。从S3海拉细胞总RNA提取使用试剂盒试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的建议。RNA浓度是量化使用NanoDrop 2000 c分光光度计(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)。序列tPA基因的引物用于PCR分析如下:正向和反向引物:5′atc TTG GGC AGA ACA TAC CG-3′, 5′tgc行动CTT CCC TCT有条件现金援助GT-3′,分别。为内部标准使用β-肌动蛋白基因,他们5′GAG柠檬酸ACG手枪TTG GTC三大′,5′tcg CTG TTG亚美大陆煤层气有限公司柠檬酸GAG GA-3′为正向和反向引物(16]。PCR总额是25μL包含5μL DNA,掌握混合(Promega) 12.5μ1.9 L,核酸酶游离水μl .描述的周期是各国et al ., 199017]。5μ分析了L PCR产品与1%琼脂糖电泳TAE 1 x缓冲和运行60分钟80 V。使用ChemiDoc定量rt - pcr进行™(Bio-Rad)。

2.5。动物

25雄性大鼠(鼠形),股票纯种,重300 - 400克适应一个环境可控的房间7天的,协议号码说下文- proc apc - 035。协议已经进行审核和批准的机构动物保健和使用委员会用生物分子科学实验室。

所有程序遵守标准操作程序和作业指导书在动物药理学实验室按照指南的护理和使用实验动物(18];使用的设备和程序已经被AAALAC国际认证。有尾巴的老鼠比13厘米长。尾巴的结扎是用丝绸做的4/0,动物被注射kappa卡拉胶,1毫克/公斤的体重。10分钟后,结扎了,动物被观察到另一个24小时。老鼠被分为5(五)组:()正常对照组:注射(注射)。以水为安慰剂,一天三次口头与生理盐水治疗,8天;(2)负对照组:注射用kappa卡拉胶(注射),1毫克/公斤的体重,和治疗口头与生理盐水为8天每天三次;(3)积极的对照组:注射用kappa卡拉胶(注射),体重为1毫克/公斤(注射),和治疗与lumbrokinase口服剂量的25毫克/公斤体重,一天三次8天;(4)与粗酶治疗组:注射用kappa卡拉胶(注射),1毫克/公斤体重,和治疗口头与粗酶剂量25毫克/公斤体重,一天三次8天;(5)与semipurified酶治疗组:注射kappa卡拉胶,1毫克/公斤的体重,和治疗与semipurified酶口服剂量的25毫克/公斤体重,一天三次8天。我们观察到梗塞的尾巴的长度出现深色的日常。量化的血栓遵循以下计算: 研究期结束时,老鼠与戊巴比妥钠安乐死,体重150毫克/公斤(i.c。),麻醉(氯胺酮和甲苯噻嗪剂量80毫克/公斤i.p剂量为7.5毫克/公斤体重)。

2.6。尾部分准备和扫描电子显微镜

安乐死之后,尾巴从实验老鼠从身体中取出。尾巴被切的宽度0.25厘米,沉浸在固定剂的解决方案。尾巴部分被冲洗10分钟连续脱水在50岁,75年,85年,95%和绝对乙醇。样品在丙酮冲洗两次10分钟。干样本铂金涂autofine涂布机JEOL JFC 1600和检查5 KV JEOL地产- 6510。

2.7。统计分析

数据表示为±SEM。正常细胞和细胞之间的对比统计分析处理原油和semipurified酶是利用学生的进行的t以及。所有的动物实验结果被单向方差分析统计分析事后测试多个比较(图基或Games-Howell测试)使用23统计软件SPSS®版本。所有统计测试是在5%的显著性水平。

3所示。结果

在以前,纤溶胞外酶的活动从印尼传统发酵食品微生物(Oncom制成利用纤维蛋白平板筛选和酶谱方法(19),显示三种最潜在的隔离。这些隔离标识使用16 srna序列基因分析和显示地衣芽孢杆菌,蜡样芽胞杆菌,和Stenotrophomonassp。

酶从Stenotrophomonassp.选择进一步的PCR分析和动物实验由于最有毒的(MTT分析如图所示1)也在考虑之前的纤维蛋白平板和酶谱分析的结果。活动的原油和硫酸铵沉淀(semipurified)酶测定使用纤维蛋白降解试验(14Lowry)和蛋白质浓度测定的方法(15如表所示1。

3.1。MTT试验

MTT分析早筛查毒性,之前进行PCR分析和实验动物模型。这个试验是有用的测试细胞生存能力和可能的细胞毒性的三个潜在的纤溶酶的细菌。

MTT分析显示不同的结果在3 t3和S3海拉细胞计数处理后的原油从分离酶Stenotrophomonassp。,地衣芽,和b的仙人掌(图1)。3 t3细胞计数显示当没有区别对待类似的剂量的粗酶从三个分离株(图1(一))。结果在S3海拉细胞被然而不同;治疗后细胞死亡的百分比从粗酶Stenotrophomonassp。,地衣芽,和b的仙人掌40岁μ克/毫升24.85%、57.22%和77.39%。这些百分比计算作为初始细胞数量减去剩余细胞的数量(图1 (b))除以初始细胞数乘以100%。比例更高意味着更高的细胞死亡。基于这些数据,进一步研究原油和semipurified酶Stenotrophomonassp。这似乎更少有毒。类似的效果在S3海拉细胞计数被发现当细胞受到原油和semipurified酶Stenotrophomonassp。(图1 (c))。

MTT测定了两个重要的发现:)在三个潜在的纤溶菌酶Stenotrophomonas至少发现了有毒,将用于进一步实验;(2)原油和semipurified酶Stenotrophomonas给了相似的结果,也与PCR用于进一步的实验,找到影响t-PA表达和用于实验老鼠找到它们对血栓退化的影响。浓度/剂量应用于进一步的实验考虑MTT数据和先前研究纤维素板和酶谱分析。

3.2。逆转录聚合酶链反应分析

PCR方法进行分析组织纤溶酶原激活物(t-PA)基因的表达在S3海拉细胞酶治疗。的数据显示,原油和semipurified酶治疗Stenotrophomonassp.增加t-PA表达与正常相比控制如图2。

组织纤溶酶原激活物表达的增加意味着增加纤维蛋白溶解活性,由于激活纤溶酶原转化为物活性胞浆素。

3.3。在实验动物溶栓活动

酶的功效Stenotrophomonassp.减少使用实验大鼠血栓形成进行了分析。在这项研究中,我们应用kappa角叉菜胶诱导大鼠血栓形成,因为,不同种之间,kappa卡拉胶形成血栓的报道,而lambda-carrageenan是不活跃的在这方面20.]。血栓形成的后果,尾巴梗死依稀可见几分钟后intravein管理(21]。

图3表明,注入kappa立即角叉菜胶诱导的血栓形成表现为深色的老鼠尾巴。我们测量这个黑暗的长度段尾的所有实验群体日常。尾巴梗塞在治疗的不同变化如图3(一个)。尾巴梗塞的百分比计算方法如前所述。阴性对照组,比例从100%开始后12小时的注入和第九天增加了120%。治疗粗酶,semipurified酶(硫酸铵沉淀),和lumbrokinase降低血栓形成的长度,这是显示为减少比例的尾巴梗塞。我们发现,lumbrokinase组,黑尾巴%在粗酶治疗,它达到了%,%与semipurified酶治疗。我们的观察表明,黑尾巴的长度(暗示血栓)厘米,厘米,cm与lumbrokinase口服治疗后,粗酶(Stenotrophomonassp),和semipurified酶,分别,而黑尾巴段负控制仍然13厘米。

血栓形成的注射角叉菜胶引起的大鼠尾原油减少口服治疗酶,semipurified酶Stenotrophomonassp,还lumbrokinase(阳性对照组)。的治疗时期,坏疽的迹象老鼠尾巴,尤其是负面的控制。坏疽是一个术语,用来描述衰减或死亡的器官或组织,由于缺乏血液供应。这种情况是存在的影响由于kappa注射角叉菜胶凝块的形成。

分析使用扫描电子显微镜是由250 x放大和集中在尾静脉,以可视化的血栓形成。图4展示了四个不同的治疗实验结果。结果证实,Κ角叉菜胶注入产生血凝块或血栓(图4 (b)),而正常对照组并没有透露任何阻塞血管(图4(一))。负控制中发现的有显著差异,治疗组。阴性对照组的静脉血栓,同时,对治疗组,很大一部分是越来越清楚表明少或没有堵塞(数字4 (c)和4 (d))。

3.4。血液学

测量实验老鼠的健康状态酶处理后,我们进行血液分析的实验。血液学中的数据是正常的值鼠形(22),这意味着与原油和semipurified酶治疗Stenotrophomonassp。不改变健康状况(表吗2)。Kappa注射角叉菜胶影响血小板计数统计。血小板或thrombocytes参与止血,导致血栓的形成,已经观察到在图3(深色尾巴梗死)。与负控制的老鼠相比,我们观察到轻微下降,各治疗组血小板计数。semipurified集团内的酶,血小板值较低,没有明显不同于正常组()。

4所示。讨论

血栓性心血管疾病的并发症是死亡和残疾的主要原因在许多病人。溶栓被用来降低心肌梗死等危及生命的疾病的负担,脑血管血栓和静脉血栓栓塞。治疗的主要方法是预防和清除血块。清除血块最有效的方法是通过使用凝血酶抑制剂或纤溶酶原激活物,防止血凝块的形成或降低血液凝块,分别。事实上,大多数心血管疾病治疗的药物开发是基于这些方法中的任何一个。使用酶治疗疾病的治疗相关性越来越受欢迎,尤其是心血管疾病。溶栓药物(酶/蛋白质)分为两种类型根据工作机制。组织纤溶酶原激活物物如t-PA和尿激酶降解纤维蛋白通过激活纤溶酶原转化为物活跃的血纤维蛋白溶酶进而将溶解纤维蛋白血凝块和plasmin-like蛋白质直接降解纤维蛋白(8- - - - - -10]。

几项研究已经表明,微生物可以产生溶栓酶,它能减少血栓形成或作为组织纤溶酶原激活物和plasmin-like蛋白(19,23]。最近,微生物纤溶酶的食物来源受到很多关注。这种情况下打开机会去探索传统发酵食品,用于治疗疾病与血栓形成有关。众多强大的纤溶微生物一直孤立的从传统的发酵食品,如韩国人钟Gook-Jang,日本纳豆,中国豆豉,印尼坦佩(2,11- - - - - -14]。

我们已经成功地孤立纤溶微生物从当地(印尼)发酵大豆Oncom制成。在微生物中,确认为有效的隔离Stenotrophomonassp.是独一无二的,因为大多数的食物来源纤溶微生物属于报道芽孢杆菌sp。血清中的细胞外酶可以降解纤维蛋白原组件完全,建议潜在的应用程序的过程中血凝块溶解(未公开的数据)。纤溶活性相似,证明了lumbrokinase从蚯蚓(路)地龙rubellus即以高纤溶活性(10,19,23]。这种细菌的发现与纤溶活性筛选的微生物是令人惊讶,因为属Stenotrophomonas还没有研究,但与各种有益的功能和应用程序,比如植物生长。

合格的和负担得起的溶栓药物是迫切需要降低心血管疾病的发生率没有忽视新药的安全性和有效性的候选人。安全性研究通常由使用实验动物细胞培养实验之前,为了避免可能有害动物模型的条件。在这个实验中,酶的三个分离株进行了测试使用海拉S3和3 t3细胞。酶的分离Stenotrophomonassp。似乎有点至少有毒比其他酶。因此,我们这种酶用于进一步的动物实验。

在这项研究中,我们观察到更高t-PA S3海拉细胞中表达,当孵化与纤溶酶Stenotrophomonassp。t-PA基因的表达可以通过转录和转译监管机制(4]。几项研究已经表明,t-PA启动子在海拉细胞识别两个键的监管区域:第一个是有关营地响应要素(CRE),和其他相关序列相似性AP2。t-PA的表达也受到各种感受器包括细胞因子肿瘤坏死因子、白介素,表皮生长因子,和类维生素a肿瘤促进剂(4,24]。炎症可以诱发纤溶酶原激活物inhibitor-1 (PAI-1)表达式,将迅速诱发血栓形成,通过激活凝血通路(25]。

卡拉胶是一家人的线性硫酸化多糖提取红色海藻(23]。卡拉胶可以用于建立一个鼠标溶栓模型涉及变黑的尾巴由于炎症和细胞损伤坏死(13,26- - - - - -28)和诱导结肠炎症和炎性浸润的发展,溃疡,结肠炎(29日]。坏死的尾巴与血管血栓形成(20.)当卡拉胶管理系统,由于其凝集活性对血液细胞(30.]。梗塞的尾巴的老鼠注射角叉菜胶诱导的血栓形成后也显示在先前的研究评估(纳豆激酶的纤溶活性31日]。在我们的研究中,炎症和致黑尾巴被发现后不久卡拉胶注入。这些症状也减少了纤溶酶的口服治疗Stenotrophomona年代sp. lumbrokinase。类似的结果是观察口服治疗,纳豆激酶的纤溶酶芽孢杆菌纳豆孤立的日本传统发酵食品纳豆(2,11]。显然,口头的纤溶酶治疗一个合适的时间可以有效地降低血栓在动物器官。保持纤溶活性的能力在动物观察胃与另一个纤维蛋白降解酶,即lumbrokinase从蚯蚓10,19,32]。酶似乎有效地吸收在大鼠肠道(32]。电子显微镜分析在我们的研究中证实的能力Stenotrophomonas酶口服到达并积极降低血栓形成的老鼠尾巴。安全的酶处理后的实验动物正常的血液在我们的研究中反映的参数观察到实验结束。

5。结论

总之,我们确认安全的酶(应用原油或semipurified形式)Stenotrophomonassp.从印尼分离发酵食品Oncom制成在细胞培养和实验老鼠。原油的影响和semipurified酶血栓有辱人格的活动也相似。的溶栓酶的活动表现为显著减少kappa角叉菜胶诱导的血栓形成实验老鼠也显示通过扫描电子显微镜检查。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突的作者和/或出版。

确认

作者感谢戴安娜努尔Afifah准备的Oncom制成隔离的监督下玛吉t . Suhartono Laurentia Stephani执行纤维蛋白溶解检查,和弗兰斯Kurnia细菌鉴定。这项研究受到了生物技术研究格兰特态Jaya大学的研究生和用生物分子科学实验室(下文),她们说,印度尼西亚。

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