文摘
肾毒性的限制因素之一是使用阿霉素(阿霉素)作为抗癌化疗。在这里,我们研究了可能的保护作用的辅酶q10(辅酶q) Dox-induced肾毒性机制。两剂(10和100毫克/公斤)的辅酶q10对8天,口服药物在大鼠肾毒性的存在与否由一腹腔内注射阿霉素(15毫克/公斤)在第四天的实验。我们的研究结果表明,低剂量的辅酶q10成功地扭转Dox-induced肾毒性控制水平(例如,血尿素氮和血清肌酐水平,肾的浓度减少谷胱甘肽(GSH)和丙二醛、过氧化氢酶活性和细胞凋亡蛋白酶3的表情,和肾组织病理学)。另外,辅酶q10的高剂量没有显示出优越nephroprotection低剂量,没有明显改善肾组织病理学,过氧化氢酶活性,或半胱天冬酶3表达相比Dox-treated组。有趣的是,辅酶q10的高剂量明显减少肾谷胱甘肽水平以及过氧化氢酶活性,造成轻微诱导半胱天冬酶3表达控制相比,可能由于prooxidant效应剂量的辅酶q10。我们得出这样的结论:辅酶q10保护Dox-induced肾毒性的预防措施调整剂量。
1。介绍
阿霉素(阿霉素),也被称为阿霉素是一种广谱抗癌蒽环霉素抗生素,已被成功地用于治疗各种血液恶性肿瘤和实体瘤。不幸的是,阿霉素的使用被限制摄入量有关毒性的发生重要器官,如心脏,肾脏和肝脏1]。的确切机制Dox-induced肾毒性还没有完全理解。肾Dox-induced毒性可能multiorgan损伤介导的一部分,主要是通过自由基形成最终导致膜脂质过氧化作用[2]。诱导细胞凋亡和调制的一氧化氮(NO) (3)其他机制可能参与有毒副作用与强力霉素治疗有关。此外,阿霉素可能通过其直接肾损害引起肾毒性效应,因为它积累优先在肾脏4]。阿霉素毒性作用其他器官如心脏和肝脏可以调节血液供应肾脏和改变异型生物质解毒过程,分别,从而间接导致Dox-induced肾病。
大量的抗氧化化合物已经被提议作为chemopreventive治疗Dox-induced毒性(5]。这些化合物的抗氧化剂辅酶q10(辅酶q)一直试图减少毒性与阿霉素治疗(6),但其影响Dox-induced肾毒性尚未阐明。辅酶q、也被称为泛醌,是唯一自然产生的脂溶性抗氧化剂,是内生合成时7]。肉、鱼、坚果和某些油一些最富有的辅酶q10的营养来源,而低得多的水平都可以在奶制品、蔬菜、水果和谷类食品(8]。使用它作为膳食补充剂和cotherapy结合药物治疗的条件,包括心血管疾病、癌症、肌肉神经退行性疾病、糖尿病(9]。
辅酶q10的nephroprotective效果仍然是有争议的。一方面,辅酶q10显示nephroprotective效应在一些动物模型(10,11]。另一方面,没有报道在另一个肾保护动物研究[12]。此外,肾移植接受者的病人进行的一项研究显示,尽管有明显的抗氧化作用的辅酶q、肾脏功能反映在肌酐水平不提高13]。在目前的工作,试图探讨辅酶q10对强力霉素治疗引起的肾损害的影响。
2。材料和方法
2.1。化学物质
辅酶q10粉是一个慷慨的礼物Mepaco(埃及)。盐酸阿霉素10毫克瓶(意大利法玛西亚、SPA、意大利),多克隆兔/ antirat半胱天冬酶3抗体(1毫克/毫升;美国实验室的愿景),生物素化的山羊antirabbit二级抗体(转导实验室、美国),包总蛋白浓度(钻石诊断、埃及),血尿素氮(BUN)测定,肌酐,减少谷胱甘肽(GSH)和过氧化氢酶(Biodiagnostic、埃及)购买。
2.2。动物和实验设计
成年雄性Wistar鼠体重185 - 250克从国家研究中心,获得埃及吉萨金字塔。动物被关在住房条件(12 h照明周期和标准°C温度),三个或四个老鼠/笼,让他们适应一周。老鼠提供实验室周润发和自来水随意。这项工作是道德经董事会批准的医学院,Minia大学埃及(7/2010)依照1986年欧共体指令(86/609 / EEC)。动物被随机分配到不同的实验组,每组与组之间没有重量统计上的显著差异。动物组control-untreated集团(),CoQ10L集团()接受低剂量(L)口头辅酶q 10毫克/公斤(10),CoQ10H集团()处理高(H)口服辅酶q10的剂量100毫克/公斤(14),Dox-treated集团()收到一个ip注射剂量的阿霉素15毫克/公斤(剂量选择基于我们的初步实验和Ajith et al。(以前的研究15)肾毒性是在低剂量)给定的前5天未见动物牺牲,阿霉素/ CoQ10L和阿霉素/ CoQ10H组()接受类似的强力霉素治疗,以及类似的低或高剂量的辅酶q10,分别连续8天,前3天开始注射阿霉素。大量的动物被分配给组接收阿霉素,预期更高的死亡率是基于我们的初步实验。辅酶q10粉,准备在1%羧甲基纤维素,是由胃管。动物没有得到辅酶q收到同样体积的1%羧甲基纤维素。同样的,动物没有收到阿霉素注射同样体积的蒸馏水ip(阿霉素车辆)。
2.3。评估肾功能
5天的阿霉素注射后,每只老鼠重然后由颈椎脱位牺牲。从颈静脉静脉血液样本收集,离心机在5000 rpm 15分钟(Janetzki T30离心机)。标记的肾功能和肾毒性,包子和血清肌酐测定使用比色诊断包根据制造商的指示。
2.4。肾匀浆制备和测定蛋白质浓度
牺牲后,肾脏都迅速切除和体重。左肾的纵切面于10%福尔马林固定嵌在石蜡组织病理学和免疫组织化学检查。其余的肾脏在液氮快速冻结和保持在−80°C。准备肾组织匀浆生化分析、肾均质(Glas-Col均质机),和20%的w / v匀浆制备在冰冷的磷酸盐缓冲剂(0.01米,pH值7.4)。匀浆是离心20分钟,每分钟3000转,上层清液保持在−80°C到使用。蛋白质浓度测定在上层清液总蛋白工具包使用分光光度计(贝克曼du - 64 UV / VIS)。
2.5。评价肾谷胱甘肽和过氧化氢酶的水平
评价肾抗氧化防御机制是由评估肾组织谷胱甘肽酶和过氧化氢酶的水平。谷胱甘肽,用光谱光度测量的工具。简单,该方法是基于谷胱甘肽巯基的反应与5、5′硫代-国际清算银行2-nitrobenzoic酸(Ellman试剂),并产生一个黄颜色的5-thio-2-nitrobenzoic酸测定colorimetrically在405 nm使用贝克曼du - 64 UV / VIS分光光度计。结果表示为μ摩尔/ g肾脏蛋白质。评估肾匀浆过氧化氢酶抗氧化分解率的酶活性测定H2O2在510纳米的组织匀浆后用比色设备描述。结果表示为单位/ g肾脏蛋白质。
2.6。评估肾脂质过氧化物和没有水平
肾脏脂质过氧化作用被确定为硫代巴比土酸反应物质和表示为等价物的丙二醛(MDA),使用1,1,3,3-tetramethoxypropane作为标准(16]。结果表示为nmol / g肾脏蛋白质。稳定的氧化终端产品的评估没有,亚硝酸盐,硝酸盐作为一个索引的生产。这种方法是基于格里斯反应(17],取决于总亚硝酸盐在540 nm的光度测量硝酸盐亚硝酸盐,转换后的含铜镉颗粒。结果表示为nmol / 100毫克肾脏蛋白质。
2.7。组织病理学和免疫组织化学检查
肾组织固定在10%福尔马林和嵌入在石蜡切片机切片的5μ米厚度,为常规组织病理学评估与苏木精和伊红染色。从每个动物三个幻灯片组,每个都有三个部分,受到半定量的使用光学显微镜显微镜分析(奥林巴斯CX41)。肾功能的变化被分级为轻度,中度或严重。成绩+、+ +和+ + +是轻微的,温和,和严重的水平,揭示不到25岁,50岁和75%的组织病理学改变字段检查,分别。
免疫组织化学染色法进行半胱天冬酶3使用多克隆兔/ antirat半胱天冬酶3抗体。简而言之,部分deparaffinized,水化然后洗0.1磷酸盐缓冲剂。部分被0.01%胰蛋白酶处理10分钟37°C然后用磷酸盐缓冲洗5分钟。内源性氧化物酶被治疗0.5% H淬火2O2在甲醇和非特异性结合被正常山羊血清稀释1:50 0.1磷酸盐缓冲剂。组织中孵化主要抗体(半胱天冬酶3;1:1000)在一夜之间在4°C。之后,组织被清洗和孵化的生物素化的山羊antirabbit二级抗体(1:2000)30分钟。进一步30分钟孵化vectastain ABC试剂后,添加底物diaminobenzidine是6分钟,这给了棕色的免疫反应性的网站。
2.8。统计分析
分析了一维方差分析数据,随后Dunnett多重比较检验。的值表示为±SEM手段。卡方检验是用于分析动物死亡率结果的重要性。所有统计分析是使用GraphPad棱镜软件(版本5)。计算时的差异被认为是重要的值小于0.05。
3所示。结果
3.1。辅酶q10对死亡率的影响和肾/体重比Dox-Treated老鼠
在牺牲时,没有观察到动物的控制,死亡率CoQ10L, CoQ10H组(表1)。另一方面,阿霉素治疗动物死亡率显著增加。共同服用辅酶q10的阿霉素/ CoQ10L和阿霉素/ CoQ10H组死亡率没有明显改善。肾/体重比不是唯一影响辅酶q在低或高剂量。阿霉素治疗肾/体重比显著增加,由政府没有改变的剂量的辅酶q10。
3.2。辅酶q10对面包和肌酐Dox-Treated老鼠
包子和肌酐总结在表的结果1。老鼠接受单剂量阿霉素(15毫克/公斤,ip)显示显著增加面包和肌酐水平与对照组相比。伴随的辅酶q10在低剂量阿霉素导致显著降低面包和肌酐水平与正常对照组。另一方面,高剂量的辅酶q导致更少的包子和肌酐水平显著改善Dox-treated组,但仍显著高于控制。无论是低还是高辅酶q10,没有强力霉素治疗,对这两种标记的肾功能有任何影响与控制。
3.3。辅酶q10对肾的影响谷胱甘肽过氧化氢酶,脂质过氧化反应,没有水平Dox-Induced肾毒性
强力霉素治疗显著降低了肾谷胱甘肽和过氧化氢酶水平与未经处理的控制数据1(一)和1 (b)、职责)。伴随治疗的低剂量阿霉素辅酶q恢复肾谷胱甘肽和过氧化氢酶值水平统计与控制。另一方面,伴随治疗高剂量阿霉素的辅酶q10没有影响肾过氧化氢酶水平,改善肾谷胱甘肽水平较低,明显高于阿霉素组,但仍远远低于控制。高剂量的辅酶q10,没有强力霉素治疗,显示明显降低肾谷胱甘肽和过氧化氢酶与控制。
(一)
(b)
(c)
(d)
肾MDA是评估肾脏脂质过氧化(图的一项指标1 (c))和亚硝酸盐/硝酸盐比率作为肾功能的指标没有水平(图1 (d))。阿霉素显著增加肾MDA和亚硝酸盐/硝酸盐比率比控制。在低剂量管理辅酶q Dox-treated动物检索MDA水平统计控制但无意义的对亚硝酸盐/硝酸盐比没有影响。另一方面,给予高剂量的辅酶q10 Dox-treated动物改善MDA强力霉素组相比,但仍具有统计学意义的控制和恢复亚硝酸盐/硝酸盐比率水平与控制。辅酶q孤独的低或高剂量没有显著影响肾MDA或没有水平。
3.4。辅酶q在Dox-Treated大鼠肾组织病理学的影响
组织病理学检查显示,控制和CoQ10L组正常肾肾小球和皮质小管(数据结构2(一个)和2 (b);表2)。另一方面,Dox-treated集团面对扩张肾小球空间和明显的肾小管变性脱落细胞,蛋白质转换和囊性扩张(图2 (d))。伴随管理辅酶q10在低剂量阿霉素导致组织病理学阿霉素诱导的损害的逆转,与肾皮质小管的上皮细胞的再生和修复肾皮质(图的正常形态2 (e))。辅酶q给出的高剂量阿霉素,然而,没有反向形态变化出现在阿霉素组,但显示明显的肾小管变性脱落上皮细胞及投与强力霉素组(图2 (f))。此外,高剂量没有CoQ10H强力霉素治疗组显示变性的有些小管的上皮衬里(图2 (c))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.5。辅酶q10对肾脏细胞凋亡的影响在Dox-Induced肾毒性
标记的细胞凋亡,诱导半胱天冬酶3被免疫组织化学染色(图评估3)。半定量的分析进一步执行(图计算程度的意义4)。大鼠肾脏的免疫组织化学染色显示,政府的强力霉素引起的免疫反应性显著增加半胱天冬酶3控制相比,在肾小球及肾小管高度表达cytoplasmically和一些核(图3 (d))。伴随管理辅酶q10在低剂量阿霉素显著降低半胱天冬酶3表达水平显著的阿霉素(图3 (e))。另一方面,辅酶q10的高剂量阿霉素未能产生类似的效果,因为它显示高半胱天冬酶3表达在肾小球和肾小管(图3 (f))。有趣的是,政府的高剂量的辅酶q、但不是低剂量,没有强力霉素引起显著的表达半胱天冬酶3相比,控制(图3 (c))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
4所示。讨论
尽管广泛的临床使用阿霉素治疗的癌症患者,其肾毒性的机制产生它不利影响仍在激烈争论。提出的机制之一是自由基的形成和氧化应激1]。的水平在人血浆内源性抗氧化剂辅酶q似乎会增加阿霉素治疗(18]。这可能是通过upregulation辅酶q基因表达的细胞防御机制对化疗促进细胞存活(19]。这要求我们注意调查辅酶q10的作用可能对Dox-induced nephroprotective剂肾损害,特别是在它的成功在保护从Dox-induced毒性(6]。
在这项研究中使用的剂量的阿霉素对应于当前正在使用的剂量在临床实践20.]。在目前的研究中,这一剂量产生急性肾功能恶化在动物组接收它。这种改变在肾功能完全恢复到水平统计控制的预防性共同服用辅酶q10的无意义的低剂量。辅酶q10的高剂量也改善Dox-induced肾功能恶化,但仍明显高于控制水平。这表明越来越多的辅酶q10剂量不赋予更多nephroprotection Dox-induced肾损害。
此前曾尝试改善Dox-induced肾毒性化合物,部分成功地保持正常的肾功能和结构可能通过抗氧化效果,如咖啡酸苯乙基酯(21),生姜罗斯科(15),而茄属植物torvum [22]。预防低剂量的辅酶q10, 3天前和扩展5天与强力霉素治疗,同时恢复大部分肾抗氧化参数和凋亡信号来控制水平。增强肾抗氧化状态导致的低剂量辅酶q预防性治疗可以解释其nephroprotective效果。这样nephroprotective效果可能不是伴随着阿霉素处理的任何变更,包括代谢、胆汁排泄,间隙(23与阿霉素抗肿瘤性能恶化),也不报告在乳腺癌细胞培养(24]。
增加剂量的辅酶q10给予强力霉素治疗没有任何改善肾功能或组织病理学结构辅酶q剂量过低。此外,cotherapy辅酶q10更高剂量的阿霉素导致失望的影响涉及肾抗氧化状态和细胞凋亡。这些结果意味着prooxidant辅酶q在高剂量的效果。事实上,一些抗氧化剂被报道拥有prooxidant效应在高剂量,类黄酮:槲皮素、杨梅酮、山柰酚(25],姜黄素(26)被发现调解感应高浓度的活性氧。一些研究表明类似prooxidant辅酶q效应在体外(27- - - - - -29日]。这是进一步支持的prooxidant影响辅酶Q模拟报告,称为mitochondrial-targeted辅酶Q mitoQ [30.]。肾血液透析患者进行的一项研究显示,辅酶q10抑制氧化应激和仍然出人意料地减少氧自由基吸收能力(31日]。在这些患者患有肾功能减弱,辅酶q10的浓度可能会高于正常水平,这可能导致此类prooxidant的外观效果。这里,我们首次提供了一个机械prooxidant高剂量辅酶q机制的证据在活的有机体内,人活着时,导致氧化应激明显减少肾谷胱甘肽过氧化氢酶水平和诱发轻度肾细胞凋亡与肾细胞凋亡蛋白酶3的表达。
总之,在剂量为10毫克/公斤,辅酶q10防止Dox-induced在大鼠肾毒性。然而,增加剂量的辅酶q与此同时与强力霉素100毫克/公斤不是nephroprotective。这可能是由于prooxidant辅酶q10的影响体现在高剂量,即使它没有强力霉素单独给出。
利益冲突
作者报道,没有利益冲突。