水提物的作用Teucrium polium谷胱甘肽体外稳态的研究:其保肝作用的可能机制

摘要

背景．Teucrium polium在阿拉伯传统医学中用于治疗肝病。谷胱甘肽是一种重要的细胞内抗氧化剂，肝内谷胱甘肽水平在肝脏疾病中衰竭。假设和目标．这项研究验证了水提取物的假设脊髓灰质炎通过增强培养肝细胞中谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶的活性来维持细胞内谷胱甘肽水平。方法. 增加浓度的影响（0.01–1 mg/mL）的水提取物脊髓灰质炎在培养的HepG2细胞中培养24小时后，使用（a）台盼蓝排斥试验，（b）[二甲基噻唑-2yl]-2,5-二苯基四唑溴胺（MTT）试验和（c）乳酸脱氢酶（LDH）试验评估细胞完整性；（2）谷胱甘肽氧化还原状态；和（3）谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶活性采用重复测量实验设计。结果. 浓度为0.375时 mg/mL和0.5 mg/mL时，提取物增加了细胞内总谷胱甘肽和还原性谷胱甘肽的水平，对细胞内氧化性谷胱甘肽的含量没有影响。提取物对谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶活性没有影响。结论．这些数据说明了水提物的保肝作用机制脊髓灰质炎部分原因可能是由于细胞内谷胱甘肽水平升高。

1.导言

阿拉伯传统医学中的一种提取物Teucrium polium（Polygermander）是唇形科的一员，广泛分布于地中海国家的丘陵和沙漠中，用于治疗肝病、高血压和糖尿病[1]。该提取物还用作止吐剂、解痉剂、抗炎剂、解热剂、镇痛剂和驱虫剂，并用于治疗高脂血症和消化性溃疡[2]．

治疗的好处脊髓灰质炎提取物通常归因于其抑制氧化过程的能力。例如，Suboh及其同事[3.的酒精提取物脊髓灰质炎能够以浓度依赖性的方式抑制过氧化氢诱导的红细胞脂质过氧化脊髓灰质炎抑制铁（Fe²）⁺)-在对培养肝细胞无毒的浓度下诱导大鼠肝匀浆脂质过氧化[4]我们还报道了该植物的水提取物能够以浓度依赖性的方式清除超氧阴离子和羟基自由基，并且能够在体外抑制其他氧化过程，例如β-胡萝卜素和血浆，以及螯合铁5]．

有证据表明，由于持续的氧化过程和肝内谷胱甘肽水平的消耗，肝脏在肝脏疾病中受到氧化应激[6，7]．根据摘录的事实脊髓灰质炎在传统医学中仍然广泛用于治疗肝病，因此有理由假设提取物治疗作用的可能机制是由于提取物抑制氧化过程和维持内源性抗氧化剂水平的能力。然而，目前还没有关于该提取物对谷胱甘肽等内源性抗氧化剂影响的实验室数据。因此，我们设计了一项研究来评估脊髓灰质炎此外，我们还评估了增加水提取物浓度对培养肝细胞的细胞活力和完整性的影响，结果见当前通讯。

2.材料和方法

２.１.植物材料和提取物制备

叶和茎脊髓灰质炎在春季（5-6月）从以色列加利利地区的山丘中采集。采集后，将植物部分在室温下阴凉处干燥7-10天。然后将其研磨，并将粉末储存在室温下的布袋中直到水提取物被制备出来。为此目的，将干燥的植物材料(25克)在250毫升蒸馏水中搅拌15分钟，温度为95，然后进行快速过滤，首先使用粗纤维素过滤器，然后使用Whatman #1滤纸。平均单株产量为11.5%。将得到的溶液冷冻干燥，然后将粉末储存在放入干燥剂中，直到需要。

２.２.化学试剂

所有涉及培养肝细胞的分析用培养基和试剂均从以色列拜特哈梅克生物工业有限公司购买。所有其他化学品和试剂均为最高纯度等级，并从美国密苏里州圣路易斯的西格玛化学公司购买。

2．3.细胞培养

提取物的水提取物的作用脊髓灰质炎在细胞完整性方面，在培养的HepG2细胞中评估了谷胱甘肽氧化还原状态以及GPx和GR的活性。HepG2细胞来源于人肝母细胞瘤，保留了成熟肝细胞的许多分化特征[8]。细胞生长在罗斯韦尔公园纪念研究所培养基（RPMI 1640）中，该培养基含有葡萄糖（2 g/L），并补充10%胎牛血清，10000 U/mL青霉素，10 mg/mL链霉素、1%谷氨酰胺、1%Hepes缓冲溶液，pH值7.4，并保持在95%O的湿空气中₂: 5%的公司₂在37°C。在80%的汇合处，胰蛋白酶化细胞，离心(1700 rpm，室温下5分钟)，在新鲜培养基中重悬，并在微滴度孔中(6孔培养皿(10个⁶ 细胞/孔）。附着后，将其培养在0.01–1的无血清培养基中 添加mg/mL提取物，并在37°C下保持24小时。

2.4.细胞完整性分析

使用三种不同的试验来评估提取物对细胞完整性的影响：（a）台盼蓝排斥试验来确定细胞活力，（b）监测线粒体呼吸的[二甲基噻唑-2yl]-2,5-二苯基四唑溴胺（MTT）试验；（c）乳酸脱氢酶（LDH）试验来评估质膜完整性。

2.4.1。台盼蓝排除试验

台盼蓝排斥试验广泛用于测定细胞完整性[9，10]．HepG2细胞( 细胞/孔）与0.01–1 mg/mL植物提取物在37°C下孵育24小时。然后将细胞暴露于染料中，并在血液细胞仪中计数吸收染料的细胞数。然后计算含染料细胞与不吸收染料的细胞的比例。重复实验7–10次。

2.4.2。MTT试验

MTT法是一种代谢能力测试，用于评估线粒体性能[9，10]．这是一种colometric assay，依赖于在活细胞中通过线粒体琥珀酸脱氢酶将黄色四唑溴化铵(MTT)转化为紫色福马扎衍生物[11]．简单地说，HepG2细胞( 细胞/孔）首先与0.01–1进行孵育 mg/mL植物提取物在37°C下培养24小时。然后将细胞培养在无血清培养基中，MTT（0.5 毫克/毫升，10 五十） 添加。培养3.5小时后，100 L-酸性异丙醇（0.04–0.1 添加N HCl（在绝对异丙醇中）以溶解福尔马赞晶体，并在ELISA阅读器中以570/650测定吸光度 将代谢活性细胞的数量确定为经处理细胞与作为对照的未经处理细胞的吸光度之比（以百分比表示）。该实验重复9次。

2.4.3.乳酸脱氢酶测定

细胞培养基中存在胞浆酶LDH，表明细胞膜受损[9，10]．简单地说，HepG2细胞(先用0.1-1 mg/mL植物提取物在37℃下孵育24小时。孵化完成后，50从每口井中收集上培养液的L。然后用细胞裂解液在室温下裂解40分钟，收集裂解液。按照制造商说明，使用CytoTox 96非放射性细胞毒性测定试剂盒(Promega, WI, USA)测定LDH活性。细胞释放乳酸脱氢酶的百分比用公式:(上清液吸光度)/(上清液吸光度+裂解液吸光度)实验重复了七次。

2.5。细胞内谷胱甘肽总含量的测定

HepG2细胞在与上述相同的条件下接种并在细胞瓶中生长。在80%的汇合处，细胞被胰蛋白酶消化、离心（1700 室温下每分钟旋转5分钟），重新悬浮在新鲜培养基中，并在六孔皿（10⁶细胞/)。附着后，更换培养基，细胞在含提取物的新鲜无血清培养基中37℃孵育24小时。未处理的细胞作为对照。在孵育期结束时，用Dulbecco 's磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗细胞三次。洗涤后，将细胞刮入1ml PBS中。为了提取细胞谷胱甘肽，然后用声波发射器将细胞分散两次20秒的脉冲。取了一份声波来测定蛋白质[12]．剩余的声波酸立即用5%磺基水杨酸(2:1 v/v)酸化，以防止谷胱甘肽的自发氧化。超声在冰上静置10 m后，在10000rpm下离心10 min去除变性蛋白。上清液转移到1.7 mL塑料管中，酸化后的样品在70°C，直到使用，总是少于一周。

采用DTNB-GSSG还原酶回收法测定谷胱甘肽水平[13]在测量GSH之前，将样品解冻并用0.2的pH值反滴定至7.0 N NaOH。分别测量总GSH含量（谷胱甘肽的还原形式和氧化形式之和）和氧化形式（GSSG）。在含有0.01的反应杯中进行GSH测定 M磷酸钠缓冲液（pH值7.5），5 毫米乙二胺四乙酸，10 毫米5,5-二硫代生物-2-硝基苯甲酸（DTNB），2 mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），10 U/mL谷胱甘肽还原酶，约100 最终体积为1的g细胞蛋白 反应动力学在412处通过分光光度法进行跟踪 通过监测吸光度的增加，使其在5分钟内保持稳定。

为了测定GSSG含量，还原型谷胱甘肽的SH基团经10%烷基化后，进行相同的DTNB循环试验 mM N-乙基马来酰亚胺（NEM），以去除反应中的还原型谷胱甘肽。为了避免在用于测定GSSG水平的分析中过量N-乙基马来酰亚胺的不利影响，通过在Sep-Pak（C18）柱上分离去除过量的NEM（Sigma Chemical Corp.，MI，USA）。吸光度增量为412 使用标准曲线（0-2.5）将nm转换为GSH和GSSG浓度 nmol GSSG）。结果以nmol/mg蛋白质表示。实验重复八次，重复测定GSH和GSSG。

2.6. 谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性的测定

HepG2细胞接种并在细胞瓶中生长，然后在六孔培养皿（10）中生长⁶ 培养期结束时，将HepG2细胞清洗并刮成1个细胞 mL PBS，然后按照制备用于谷胱甘肽测定的相同方式进行超声处理 五十） 采用超声波法测定蛋白质含量[12]．剩余的声波酸用于测定酶的活性。

GPx酶对细胞内的过氧化物进行解毒。由于过氧化物可分解形成高活性自由基，GPx在保护细胞免受自由基诱导的损伤，特别是脂质过氧化方面起着至关重要的作用。该酶还催化过氧化氢和有机过氧化物（R–O–O–H）的还原使用还原性谷胱甘肽作为还原当量来源，分别还原为水和相应的稳定醇（R–O–H）。当通过GPx还原有机过氧化物生成氧化性谷胱甘肽时，通过GR将其循环至还原状态，并将NADPH氧化为NADP⁺.NADPH氧化过程伴随着340处吸光度的降低 以叔丁基过氧化氢（t-BOOH）为底物对GPx进行分析[14].在含有1个样品的反应杯中进行分析 M缓冲液三氯化氢+5 mM EDTA（pH值8.0），0.1 M GSH，2 mM NADPH，10 U/mL谷胱甘肽还原酶、样品和稀释1的叔丁基过氧化氢 : 1000，最终体积为1.0的蒸馏水 在340℃时，吸光度下降，反映出NADPH的氧化与样品中的GPx活性成正比 结果以GPx活性/mg细胞蛋白的单位表示。实验重复十次。

2.7。谷胱甘肽还原酶(GR)活性测定

该酶GR催化GSSG还原为GSH，对谷胱甘肽氧化还原循环至关重要，以维持足够水平的还原细胞GSH。在通过谷胱甘肽还原酶还原GSSG的过程中，每还原一个GSSG分子消耗一个NADPH分子。因此，通过NADPH消耗量的测量。GR的活性使用Carlberg和Mannervik描述的方法进行测定[15]轻微修改。GR分析是在含有1 M Tris HCl缓冲液+5 mM EDTA（pH值8.0），0.033 总秘书长，2 mM NADPH，以及最终体积为1.0的样品 mL.在340℃时，通过分光光度法监测吸光度的降低，这反映了在样品中存在的GR还原GSSG期间NADPH的氧化 结果以GR活性/mg细胞蛋白的单位表示。实验重复十次。

2.8。数据的统计分析

每个实验的样本大小由任意设置为80%的功率分析确定，以便使用Statemate版本1 (GraphPad Software, Inc.， San Diego, CA, USA)检测5%概率的效果。采用重复测量实验设计，评估不同浓度的提取物对不同研究参数的影响。的水提取物效果的数据脊髓灰质炎在细胞活力方面，谷胱甘肽氧化还原状态和GPx和GR的活性通过单因素方差分析（ANOVA）和Dunnett后测进行分析。所有数据均以平均值±标准偏差表示。

3.结果

３．１．水提物的作用脊髓灰质炎HepG2细胞的完整性

首先，我们研究了增加提取物浓度的效果脊髓灰质炎使用台盼蓝排斥试验检测培养的HepG2细胞的活力，发现提取物与提取物一起培养24小时后对细胞活力没有影响（数据未显示）。

然后我们使用MTT法来评估相同浓度的水提取物对培养的HepG2细胞线粒体呼吸的影响。在较低浓度(0.05-0.25 mg/mL)时，水提取物促进线粒体呼吸．在0.01 mg/mL和0.5 mg/mL浓度下，提取物对线粒体呼吸无影响。在0.75 - mg/mL浓度较高时，提取物抑制线粒体呼吸(图1).

然后用LDH法测定提取物对培养的HepG2细胞质膜完整性的影响。在0.01-0.25 mg/mL的低浓度下，浸提液24小时后对LDH泄漏无影响。在浓度较高的0.5-1 mg/mL时，提取物可增加细胞乳酸脱氢酶外流(图2).

根据这些发现，提取物的三种浓度，即0.25 毫克/毫升，0.375 毫克/毫升和0.5毫克/毫升 然后用mg/mL的提取物评估提取物对细胞内谷胱甘肽稳态的影响。

３.２．水提物的作用脊髓灰质炎培养HepG2细胞中总谷胱甘肽水平的研究

在0.375 ~ 0.5 mg/mL浓度范围内，提取物明显增加细胞内总胆固醇水平（图3.)，还原型谷胱甘肽（图4)，对HepG2细胞中GSSG含量无影响(数据未显示)。总谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽的结果是相似的，因为细胞内的谷胱甘肽几乎完全以还原型形式存在。

由于水提物在0.375-0.5 mg/mL浓度范围内增加了还原性谷胱甘肽水平而不影响氧化性谷胱甘肽水平，GSH/GSSG比值增加。

3.3.水提取物的作用脊髓灰质炎谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶活性的研究

超过0.25–0.5 在mg/mL浓度范围内，我们发现提取物对GPx的活性没有影响（图5)和GR（图6)暴露24小时后。

4.讨论

这项工作的目的是评估水提取物的效果脊髓灰质炎在这项研究中，我们发现脊髓灰质炎在低(0.01-0.25 mg/mL)浓度下对细胞完整性没有影响。在高浓度(0.75-1 mg/mL)时，提取物对细胞有毒性，因为它抑制线粒体呼吸和增加细胞乳酸脱氢酶外流。在0.375 mg/mL和0.5 mg/mL浓度下，提取物显著提高了细胞内总谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽的含量，而对细胞内氧化谷胱甘肽含量无影响。由于提取物增加了细胞内还原性谷胱甘肽水平而不影响氧化性谷胱甘肽水平，GSH/GSSG比值增加。同时，我们发现提取物对GPx和GR的活性没有影响。

结果表明，黄芪提取物的最大无毒浓度脊髓灰质炎介于0.25 - 0.5 mg/mL之间。因此，我们检测了该浓度范围内的提取物对细胞内谷胱甘肽稳态的影响。我们观察到脊髓灰质炎在0.375 mg/mL和0.5 mg/mL浓度下，增加了细胞内总谷胱甘肽水平，降低了细胞内氧化谷胱甘肽水平。因此，我们推测该提取物能够提高GPx和GR的活性，从而增强细胞内谷胱甘肽的循环。然而，我们没有看到这两种酶的活性有这样的影响。众所周知，谷胱甘肽生物合成的最终产物是还原型谷胱甘肽[16，17]鉴于我们的发现，提取物对GPx和GR还原酶的活性没有影响，我们建议脊髓灰质炎通过促进谷胱甘肽生物合成途径提高细胞内谷胱甘肽水平。为了验证这一建议，还需要进一步的实验来验证提取物对谷胱甘肽合成酶活性的影响。

提取物可能的抗氧化作用机制包括其清除活性氧物种或/和提高内源性抗氧化剂水平的能力。在目前的研究中，我们发现脊髓灰质炎有能力增加一种重要的细胞内抗氧化剂的水平。Kadifkova-Panovka及其同事[18]报道了大鼠的血浆谷胱甘肽水平脊髓灰质炎与未治疗CCl的血浆水平相比，四氯化碳诱导肝硬化前的提取物部分耗尽₄-诱导肝硬化大鼠。他们的发现表明脊髓灰质炎提取物可能具有保肝作用。因此，这可能是阿拉伯传统医学中这种植物用于治疗肝病的根本原因。

虽然我们没有尝试去鉴定抗氧化剂的生物成分脊髓灰质炎在这项研究中，Rizk等人报告说，植物的地上部分富含类黄酮[19]类黄酮具有多种生物活性，如抗肿瘤、抗缺血、抗过敏、抗肝毒性和抗炎活性，其中许多活性归因于其抗氧化潜力[20.- - - - - -22]．黄酮类和其他酚类化合物已被报道为活性氧清除剂和脂质过氧化抑制剂[23]张证明，同时补充槲皮素可以恢复培养精原细胞氧化损伤后GSH的含量[24]．其他研究人员证明，类黄酮可以刺激负责细胞内谷胱甘肽合成的基因的转录[25，26].类黄酮类化合物不仅是脊髓灰质炎．脊髓灰质炎亦含有多种二萜[27]和呋喃一氯代烷二萜，它们是已知的肝毒素[28- - - - - -30.]虽然二萜类化合物对细胞有毒性，但我们在低浓度的脊髓灰质炎本研究中使用的提取物。然而，我们发现脊髓灰质炎在较高浓度下对细胞有毒，并且这些化合物可能是生物活性成分，在较高浓度下对观察到的细胞毒性负责。此外，不应忽视的是，我们研究了提取物在细胞培养系统中的作用，在该系统中，毒性二萜类化合物浓度将随着提取物浓度的增加而增加。我们认为这是在较高浓度的水提取物中抑制线粒体呼吸和增加细胞LDH流出的原因脊髓灰质炎．因此，黄酮类化合物的保肝作用机制和双萜烯类化合物的肝毒作用机制有待进一步研究脊髓灰质炎黄酮和二萜含量的提取物可能因植物采集的地点和季节以及提取物的制备和类型而异。

我们的研究结果也提供了一些关于药物安全性、肝保护和肝毒性潜力的争议脊髓灰质炎提取物，因为他们强调的微妙平衡之间的有益和有毒的影响脊髓灰质炎提取物对谷胱甘肽稳态和细胞完整性的影响。现在有很多关于谷胱甘肽的报道脊髓灰质炎-诱发的肝毒性，有时会导致严重和致命的并发症[30.- - - - - -37].这种肝毒性已在实验动物中得到证实[27，28，38，39和培养的肝细胞[4，5].在这项研究中，我们证明了细胞完整性在低提取物浓度下不受影响，尽管随着提取物浓度的增加，细胞内谷胱甘肽水平无显著增加，但细胞完整性仍然不受影响。提取物浓度的进一步适度增加会导致细胞内谷胱甘肽水平的额外增加els和受损细胞完整性的出现（线粒体呼吸减少和LDH漏出增加）。换句话说，提取物增加细胞内谷胱甘肽水平的浓度与可能损害细胞完整性的浓度一致。

总之，我们的数据表明，在低浓度下脊髓灰质炎无毒，水提取物的保肝作用机制部分可能是由于细胞内谷胱甘肽水平的提高。这种增加的机制不是由于提取物加速细胞内谷胱甘肽循环，而是可能是由于对谷胱甘肽生物合成的影响。

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