APS 药理科学的进步 1687 - 6342 1687 - 6334 Hindawi出版公司 938324年 10.1155 / 2010/938324 938324年 研究文章 的水提物的影响 Teucrium polium谷胱甘肽在体外体内平衡:Hepatoprotectant行动的可能机制 Shtukmaster 斯特拉 Ljubuncic 佩贾 Bomzon 15:25 李 春广 药理学系 布鲁斯和露丝Rappaport医学院 以色列理工学院 邮政信箱9649 海法31096 以色列 technion.ac.il 2010年 08年 03 2010年 2010年 08年 06 2009年 25 11 2009年 15 01 2010年 2010年 版权©2010 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

背景。 Teucrium polium在阿拉伯传统医学用于治疗肝脏疾病。细胞内谷胱甘肽是一种重要的抗氧化剂,在肝脏疾病和肝内谷胱甘肽水平枯竭。 假设和目标。这次调查测试的假设水提取物 t . polium维持细胞内谷胱甘肽水平增加培养的肝细胞中谷胱甘肽过氧化物酶,谷胱甘肽还原酶活性。 方法。增加浓度的影响(0.01 - 1毫克/毫升)的水提物 t . polium评估在培养HepG2细胞孵化后24小时(1)细胞完整性用台盼蓝排斥试验(a), (b) (di-methylthiazol-2yl) 2, 5-diphenyl-tetrazoliumbromide试验(MTT), (c),乳酸脱氢酶(LDH)测定;(2)谷胱甘肽氧化还原状态;和(3)谷胱甘肽过氧化物酶及谷胱甘肽还原酶活动使用重复测量实验设计。 结果。在浓度为0.375毫克/毫升和0.5毫克/毫升,提取增加了细胞内的总水平,减少谷胱甘肽和没有影响细胞内的氧化谷胱甘肽。提取没有影响谷胱甘肽过氧化物酶,谷胱甘肽还原酶的活动。 结论。这些数据表明,水提取物的王亚南作用的机制 t . polium部分可能是由于增加细胞内谷胱甘肽的水平。

 1。介绍

在阿拉伯国家的传统医学,提取的 Teucrium polium(Polygermander),唇形科家族中的一员,广泛分布在地中海国家的山和沙漠,是用于治疗肝脏疾病,高血压,糖尿病 1]。提取也用作止吐剂,抗痉挛,抗炎、退热剂,镇痛,和一个anti-carminative,治疗高脂血症和消化性溃疡 2]。

治疗的好处 t . polium提取通常归因于他们抑制氧化过程的能力。例如,Suboh和他的同事们( 3显示一个酒鬼提取的 t . polium会抑制氢peroxide-induced脂质过氧化在红细胞浓度的方式。以前,我们报道了一个水提物 t . polium抑制了铁(Fe²+全身的)在大鼠肝匀浆脂质过氧化作用浓度没有有毒培养肝细胞( 4]。我们还报道说,工厂的水提物能清除超氧化物阴离子和氢氧自由基浓度的方式,可以在体外抑制其他氧化过程,如氧化 β胡萝卜素和血浆以及螯合铁( 5]。

有证据表明,肝脏氧化压力在肝脏疾病是由于持续的氧化过程和肝内谷胱甘肽的耗竭水平( 6, 7]。基于提取的 t . polium仍广泛用于治疗肝脏疾病在传统医学,它是合理的假设的可能机制提取的治疗行为是由于提取的能力,抑制氧化过程和维持内源性抗氧化水平。然而,没有实验室数据提取的影响内源性抗氧化剂,如谷胱甘肽。因此,我们设计了一个研究来评估的水提物的影响 t . polium在细胞内谷胱甘肽体内平衡。此外,我们也评估了影响水提物的浓度增加的细胞培养肝细胞的可行性和完整性,以及这项研究的结果发表在当前的通信。

 2。材料和方法 2.1。植物材料和提取准备

叶和茎 t . polium收集在春季(5)从以色列的加利利地区的山丘。收集后,核电站部分干了7 - 10天在室温下在树荫下。然后他们被地面和粉末是存储在布袋 5 ° C 直到水提物。为此,干植物材料(25克)在250毫升蒸馏水搅拌15分钟,享年95岁 ° C 首先由粗纤维素,其次是快速过滤,然后使用绘画纸# 1滤纸进行过滤。w / w的平均收益率为11.5%。最终的解决方案是冷冻干燥粉是存储 - - - - - - 18 ° C 在一个干燥剂,直到需要。

 2.2。化学试剂

所有培养基和试剂的分析涉及培养肝细胞从生物产业有限公司购买,拜特Haemek,以色列。所有其他化学药品和试剂纯度最高的等级,从西格玛化工有限公司购买,圣路易斯,密苏里州,美国。

 2.3。细胞培养

的水提物的影响 t . polium在细胞完整性、谷胱甘肽氧化还原状态,GPx的活动和在培养HepG2细胞GR进行评估。HepG2细胞是来源于人类肝母细胞癌和保留许多成熟肝细胞的分化特性( 8]。细胞生长在罗斯威尔公园纪念研究所介质(RPMI 1640)含有葡萄糖(2 g / L)和补充10%胎牛血清,10000 U /毫升青霉素,链霉素10毫克/毫升、1%谷氨酰胺,1%消息灵通的缓冲溶液,pH值7.4,保持湿润空气的95%2:5%的公司2在37°C。80%的融合,细胞使胰蛋白酶化,离心机(5分钟在室温下1700 rpm),镀resuspended新鲜培养基,在微量滴定井( 2 × 10 4 细胞/(10)或six-well盘子6细胞/)。附件之后,他们在无血清培养基培养,增加了0.01 - 1毫克/毫升提取并保持24小时37°C。

 2.4。分析细胞的完整性

三种不同的分析被用来评估提取细胞完整性的影响:(a)台盼蓝排斥试验来确定细胞生存能力,(b) (di-methylthiazol-2yl) 2, 5-diphenyl-tetrazoliumbromide (MTT)分析监控线粒体呼吸;(c)的乳酸脱氢酶(LDH)测定评估质膜完整性。

2.4.1。台盼蓝排斥试验

台盼蓝排斥试验被广泛用于确定细胞完整性( 9, 10]。HepG2细胞( 2 × 10 6 细胞/)孵化了0.01 - 1毫克/毫升植物提取24小时37°C。然后细胞暴露在染料和细胞的数量,染料在血细胞计数器计数。dye-containing细胞细胞的比例没有染料被计算。实验重复7 - 10倍。

 2.4.2。MTT试验

MTT测定是代谢能力的测试和评估线粒体性能( 9, 10]。这个colometric试验依赖于转换的黄色四唑溴化(MTT)紫色甲瓒导数在可行的细胞线粒体琥珀酸脱氢酶( 11]。简单地说,HepG2细胞( 2 × 10 4 细胞/)第一次孵化与0.01 - 1毫克/毫升植物提取24小时37°C。细胞在无血清培养基培养,MTT(0.5毫克/毫升,10 μ L)补充道。3.5小时孵化后,100年 μ L酸异丙醇(0.04 - -0.1 N HCl绝对异丙醇)被添加到溶解甲瓒晶体和吸光度测定的ELISA读者在570/650 nm。新陈代谢有关细胞的数量被确定为吸光度的比值(表示为一个百分比)治疗的细胞治疗细胞作为控制。实验重复了9次。

 2.4.3。LDH测定

胞质酶的存在、LDH、细胞培养基是指示性的细胞膜损伤( 9, 10]。简单地说,HepG2细胞( 2 × 10 4 细胞/)第一次孵化与0.1 - 1毫克/毫升植物提取物为24小时37°C。在完成孵化,50 μ L上层介质收集从每个。未经处理的细胞被细胞溶解和细胞溶菌作用解决了40分钟在室温和溶菌产物收集。LDH活性测定使用CytoTox 96非放射性细胞毒性试验装备(美国WI Promega),按照制造商的说明。LDH释放细胞的百分比是决定使用公式:(上层清液的吸光度)/(上层清液的吸光度+溶菌产物的吸光度) × One hundred.实验重复了七次。

 2.5。总细胞内的谷胱甘肽的决心

HepG2细胞被播种和细胞生长在烧瓶在相同的条件下,已被描述。80%的融合,细胞使胰蛋白酶化,离心机(5分钟在室温下1700 rpm), resuspended新鲜培养基,镀six-well菜(106细胞/)。附件后,介质被取代和新鲜无血清细胞培养介质包含提取24小时37°C。参与细胞的控制。潜伏期结束时,这些细胞被洗了三次与杜尔贝科的磷酸缓冲盐(PBS)。洗后,细胞被刮进1毫升PBS。提取细胞谷胱甘肽,细胞被分散使用超声发生器由两个20秒。用近摄的整除蛋白质测定( 12]。的其余部分用立即被酸化磺基水杨酸为5% (v / v 2: 1)防止自发氧化谷胱甘肽。站在十米冰后,用在10000转离心10分钟 4 ° C 去除变性蛋白。结果上层清液转移到1.7毫升塑料管道和酸化样品被冻结了 - - - - - - 70°C到使用,总是不到一周。

谷胱甘肽水平测定使用DTNB-GSSG还原酶回收试验( 13与一些细微的修改。谷胱甘肽测量之前,样本解冻和pH值7.0和0.2 N氢氧化钠滴定。总谷胱甘肽含量(的总和减少和氧化形式的谷胱甘肽)和氧化形式(GSSG)分别测定。谷胱甘肽测定是在试管中含有0.01钠磷酸盐缓冲剂(pH值7.5),5毫米EDTA, 10 mM 5, 5 ′ -dithio-bio-2-nitrobenzoic酸(DTNB), 2毫米烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、谷胱甘肽还原酶10 U /毫升,大约100 μ g细胞蛋白质在最后一卷1毫升。随后的反应动力学是在412 nm spectrophometrically 5分钟通过监测吸光度的增加。

测定GSSG内容、同一DTNB回收试验进行烷基化后SH组减少了10毫米的谷胱甘肽N-ethylmaleimide (NEM)为了消除减少谷胱甘肽的反应。为了避免N-ethylmaleimide过剩的不利影响分析用于确定GSSG水平,超额NEM被分离在Sep-Pak (C18)列(美国MIσ化学公司)。吸光度的增加在412海里被转换为谷胱甘肽和GSSG浓度使用标准曲线(0 - 2.5 nmol GSSG)。nmol /毫克蛋白表达的结果。实验重复了八次重复的谷胱甘肽和GSSG决定。

 2.6。测定谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活动

HepG2细胞被播种,在细胞生长的玻璃瓶,然后在six-well菜(106细胞/)在相同的条件下,已被描述。年底潜伏期HepG2细胞被洗了,刮到1毫升PBS然后被用在相同的方式为谷胱甘肽的决心。一个整除(100 μ L)蛋白用近摄的决心 12]。用的其余部分被用来确定酶的活动。

酶、GPx解毒作用细胞中的过氧化物。由于过氧化物可以分解形成高活性自由基,GPx起着至关重要的作用在保护细胞免受自由radical-induced损伤,尤其是脂质过氧化作用。酶催化过氧化氢的还原和有机过氧化物(R-O-O-H)水和相应的稳定的醇(R-O-H),分别使用减少谷胱甘肽作为一种减少等价物。当氧化谷胱甘肽在减少GPx有机过氧化物的产生,它是回收的国家减少了GR与氧化NADPH辅酶ii+。NADPH氧化的过程伴随着吸光度下降在340 nm从而GPx活性的监测光谱光度测量的方法。GPx化验使用t-butylhydroperoxide (t-BOOH)作为底物( 14]。试验是在试管中含有1米缓冲Tris-HCl EDTA (pH值8.0)+ 5毫米,0.1谷胱甘肽,2毫米NADPH,谷胱甘肽还原酶10 U /毫升、样本,和t-butylhydroperoxide稀释1:1000年1.0毫升蒸馏水在最后一卷。吸光度下降,反映出氧化成正比的NADPH GPx活性的样品,之后在340海里。结果表示为单位GPx活性/ mg细胞蛋白质。实验重复了十次。

 2.7。测定谷胱甘肽还原酶(GR)活性

GR,酶催化的还原GSSG谷胱甘肽,谷胱甘肽氧化还原循环必不可少的,为了保持适当的减少细胞谷胱甘肽的水平。在减少GSSG谷胱甘肽还原酶,一个分子的NADPH GSSG每个分子的消耗减少。因此,减少由GR GSSG可以由测量NADPH的消费决定。GR的活动是化验使用的方法描述了他本人和Mannervik 15与一些细微的修改。GR试验是在试管中含有1 M Tris-HCl缓冲+ 5毫米EDTA (pH值8.0),0.033 GSSG, 2毫米NADPH,样品在最后一卷1.0毫升。吸光度下降,这反映了NADPH的氧化在减少GSSG GR在示例中,监测spectrophotometrically 340海里。结果表示为单位的GR活性/ mg细胞蛋白质。实验重复了十次。

 2.8。数据的统计分析

每个实验的样本大小是由权力分析任意设定在80%以检测效果在5%概率使用Statemate版本1 (GraphPad软件公司,圣地亚哥,美国)。不同浓度的提取的影响评估在各种研究参数使用重复测量实验设计。的数据的水提取的影响 t . polium细胞生存能力,谷胱甘肽氧化还原状态,GPx的活动和GR分析单向方差分析(方差分析)与Dunnett期末测验。所有的数据表示为平均值±标准偏差。

 3所示。结果 3.1。影响水提物的<斜体> T。polium < /斜体>对HepG2细胞的完整性

首先,我们研究了提取物浓度的增加的影响 t . polium培养的可行性HepG2细胞利用台盼蓝排斥试验,发现提取没有影响细胞的生存能力后24小时孵化与提取(数据未显示)。

然后我们使用MTT试验评估相同浓度的影响水提物的体外培养的HepG2细胞内线粒体呼吸。在低浓度0.05 - -0.25毫克/毫升,水提物增加了线粒体呼吸 ( p < 0 。 01 ) 。在0.01毫克/毫升的浓度和0.5毫克/毫升,提取没有影响线粒体呼吸。在更高浓度0.75 - 1毫克/毫升,提取抑制线粒体呼吸 ( p < 0 。 01 ) (图 1)。

增加水提物的浓度的影响 t . polium在线粒体呼吸HepG2使用MTT检测培养细胞。数据平均值±标准偏差。样本大小 ( n ) = 9 。 * p < 0 。 01 从控制代表了不同的意义。所有的数据都被描绘成比例控制线粒体呼吸(100%)。

LDH实验被用来确定提取的效果在培养HepG2细胞的原生质膜的完整性。在低浓度0.01 - -0.25毫克/毫升,提取没有影响孵化24小时后LDH泄漏。在更高浓度0.5 - 1毫克/毫升,提取增加细胞LDH流出 ( p < 0 。 01 ) (图 2)。

增加水提物的浓度的影响 t . polium在膜完整性HepG2使用LDH测定培养细胞。数据平均值±标准偏差。样本大小 ( n ) = 7 。 * p < 0 。 01 从控制代表了不同的意义。所有数据提出了总额的比例(100%)。

基于这些发现,三个浓度的提取,即0.25毫克/毫升,0.375毫克/毫升,和0.5毫克/毫升的提取,然后用来评估细胞内谷胱甘肽的提取体内平衡的影响。

 3.2。影响水提物的<斜体> T。polium < /斜体>总谷胱甘肽水平培养HepG2细胞

0.375 - -0.5毫克/毫升浓度范围,提取显著增加 ( p < 0 。 01 ) 细胞内的总水平(图 3),减少谷胱甘肽(图 4),并没有影响的GSSG HepG2细胞(数据未显示)。和减少总谷胱甘肽的结果是相似的,因为细胞内谷胱甘肽几乎只在其减少的形式。

24小时的曝光效果的水提物 t . polium在培养细胞HepG2总谷胱甘肽水平。数据平均值±标准偏差。样本大小 ( n ) = 8 。 * p < 0 。 01 从控制代表了不同的意义。

24小时的曝光效果的水提物 t . polium减少谷胱甘肽(GSH)含量HepG2细胞培养。数据平均值±标准偏差。样本大小 ( n ) = 8 。 * p < 0 。 01 从控制代表了不同的意义。

因为水提物增加了谷胱甘肽水平降低而不影响氧化谷胱甘肽水平在0.375 - -0.5毫克/毫升浓度范围,谷胱甘肽(GSSG比例增加。

 3.3。影响水提物的<斜体> T。polium < /斜体>谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶的活动

0.25 - -0.5毫克/毫升浓度范围,我们发现提取没有影响的活动GPx(图 5)和GR(图 624小时后)。

24小时的曝光效果的水提物 t . polium谷胱甘肽过氧化物酶活性在HepG2细胞培养。数据平均值±标准偏差。样本大小 ( n ) = 10 。

24小时的曝光效果的水提物 t . polium在培养细胞HepG2谷胱甘肽还原酶活性。数据平均值±标准偏差。样本大小 ( n ) = 10 。

 4所示。讨论

这项工作的目的是评估的水提物的影响 t . polium在细胞内谷胱甘肽的体内平衡。在这项研究中,我们发现的水提物 t . polium没有影响细胞完整性较低(0.01 - -0.25毫克/毫升)浓度。在更高浓度(0.75 1毫克/毫升),提取细胞有毒,因为它是抑制线粒体呼吸和增加细胞LDH流出。在浓度为0.375毫克/毫升和0.5毫克/毫升,提取显著增加细胞内的总水平,减少谷胱甘肽和没有影响细胞内大量的氧化谷胱甘肽。自提取增加了细胞内谷胱甘肽在不影响氧化谷胱甘肽水平降低的水平,谷胱甘肽(GSSG比例增加。与此同时,我们发现提取没有影响GPx和GR的活动。

我们发现最大无毒浓度的提取 t . polium0.25毫克/毫升之间和0.5毫克/毫升。因此,然后检查的影响细胞内谷胱甘肽的提取在此浓度范围内稳态。我们观察到的水提取物 t . polium在0.375毫克/毫升的浓度和0.5毫克/毫升增加了细胞内总谷胱甘肽水平降低而不影响细胞内的氧化谷胱甘肽水平。因此,我们推测,提取能够增加GPx和GR的活动,导致增强细胞内谷胱甘肽循环。然而,我们并没有看到这种影响两种酶的活动。能够很好的证明,谷胱甘肽的生物合成的最终产物是减少谷胱甘肽( 16, 17]。鉴于我们发现提取没有影响GPx和GR还原酶的活动,我们建议 t . polium提高细胞内谷胱甘肽水平通过促进谷胱甘肽的生物合成途径。进一步的实验提取的效果上谷胱甘肽合成酶的活性需要验证这个建议。

可能的提取物的抗氧化作用机理包括清除活性氧的能力或/和提高内源性抗氧化剂的水平。在本研究,我们发现 t . polium有能力增加一个重要的细胞内抗氧化剂的水平。Kadifkova-Panovka和他的同事们( 18)报道,老鼠的大鼠血浆谷胱甘肽水平使用 t . polium提取与四氯化碳诱导肝硬化部分耗尽之前相比,等离子体在CCl未经处理的水平4全身的肝硬化大鼠。他们的发现表明, t . polium提取王亚南有可能的。因此,这可能是这种植物的根本原因是在阿拉伯传统医学用于治疗肝脏疾病。

虽然我们没有试图确定的抗氧化bioconstituents t . polium在这项研究中,Rizk等人报道,空中的部分植物富含类黄酮( 19]。黄酮类化合物具有许多生物活性,如antitumoral antiischemic,抗过敏药,anti-hepatotoxic,和抗炎活动,这些活动是归因于他们的抗氧化潜力( 20.- - - - - - 22]。类黄酮和其他酚类化合物已报告作为活性氧的拾荒者和脂质过氧化作用的抑制剂 23]。有一些报道一些黄酮类化合物在谷胱甘肽的影响。张证明,同时补充与槲皮素还原谷胱甘肽含量在培养精原细胞氧化损伤后( 24]。其他研究人员表明,类黄酮可以刺激转录的基因(s),负责合成谷胱甘肽( 25, 26]。类黄酮是不仅构成 t . polium。 t . polium还包含了各种二萜( 27已知)和furanoneoclerodane二萜的肝毒素( 28- - - - - - 30.]。虽然二萜可以对细胞有毒,我们无法找到任何证据的活动在低浓度的 t . polium本研究中使用的提取。然而,我们发现 t . polium是有毒的细胞浓度更高,这些化合物可能是负责观察到的细胞毒性的生物活性成分的浓度更高。此外,它不应该被忽视,我们调查的影响的细胞培养系统中提取有毒二萜浓度会增加随着提取物浓度的增加。我们建议这是抑制线粒体呼吸的原因,增加细胞LDH的流出水提物的浓度更高 t . polium。因此,还需要进一步的调查,以明确hepatoprotectant行动的机制dipertenoids类黄酮和肝毒素的行动的各种类型的 t . polium提取的黄酮类和dipertenoid水平可能会有所不同根据地点和季节的植物收集、制备和提取的类型。

我们的研究结果也提供了一些见解的争议的安全性和王亚南和肝毒素的潜力 t . polium提取,因为他们强调之间的微妙的平衡有益的和有毒的影响 t . polium提取谷胱甘肽在体内平衡和细胞的完整性。现在有许多报道 t . polium全身的肝毒性与人类有时严重和致命的并发症( 30.- - - - - - 37]。这个肝毒性已被证实在实验动物 27, 28, 38, 39和培养肝细胞 4, 5]。在这项研究中,我们表明,细胞完整性是提取较低浓度的影响,并将继续影响尽管无意义的增加细胞内谷胱甘肽水平随着提取物浓度的增加。进一步温和提取物浓度的增加导致额外增加细胞内谷胱甘肽水平和外观受损细胞的完整性(减少线粒体呼吸和增加LDH泄漏)。换句话说,提取增加细胞内谷胱甘肽的浓度水平与那些会损害细胞的完整性。

总之,我们的数据表明,在低浓度的水提物 t . polium不是有毒和水提物的王亚南作用的机制,在一定程度上,由于增强细胞内谷胱甘肽的水平。这个增加的机制不是由于提取细胞内谷胱甘肽循环加速,但可能是由于影响谷胱甘肽的生物合成。

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