的抑制作用石榴从先兆子痫患者等离子诱导的内皮细胞血管紧张素II I型受体和血栓素B2果提取物

抽象

这项研究旨在评估是否石榴果实提取物调制血管紧张素II类型I受体（AT1-R）和血栓素B2水平在从先兆子痫患者诱导血浆内皮细胞。从人脐静脉内皮细胞获得的内皮细胞。在汇合时，内皮细胞分为5组，其中包括暴露于来自正常妊娠（NP）2％血浆内皮细胞，血管内皮细胞暴露于来自在存在暴露于PP先兆子痫患者（PP），和内皮细胞2％血浆的乙醇提取物石榴（PP + PG）在以下三种剂量：14;28;和56个ppm。通过免疫组织化学技术观察AT1-R的表达，和血栓素B2水平通过免疫测定技术进行。等离子体由PP显著增加AT1-R的表达和血栓素B2水平相比于正常妊娠等离子体处理的细胞。AT1-R表达的显著增加（）通过的高剂量治疗衰减石榴提取。此外，血栓素B2水平显著升高(的最低剂量处理减弱的石榴提取。我们进一步得出结论石榴fruit protects and inhibits the sensitivity of endothelial cells to plasma from preeclamptic patients due to inhibition of AT1-R expression (56 ppm) and reduced thromboxane B2 levels (14 ppm).

1.简介

先兆子痫是一种妊娠相关疾病的特点是集体的症状，如增加血压和蛋白尿。这种复杂的综合征导致孕妇和胎儿的发病率和死亡率。这种综合征的病理生理机制尚不清楚。易感人群，遗传和环境危险因素参与了胎盘的缺陷。有缺陷的胎盘和子宫胎盘中灌注压子宫肌层原因减少不当滋养细胞浸润刺激的复合循环的生物活性因子的释放[1- - - - - -5]。

在先兆子痫中发现的血管系统的功能障碍与由内皮细胞产生的血管活性因子有关。这是参与此功能障碍的一个途径是肾素 - 血管紧张素 - 醛固酮系统。到血管收缩血管紧张素II（ANG-II）的低灵敏度正常妊娠被发现，但在先兆子痫的情况下此感光度增加之前的临床发作的疾病[6- - - - - -9]。血管紧张素II通过两种受体发挥其作用和其结合的Ang-II类型I受体（AT1-R）诱导收缩[7]。

先兆子痫还与不相称的血清因素，包括血栓素和前列环素与该释放的未定义的机制相关联。血栓素水平发现，只有在重度子痫前期，以显著增加。血栓素的比例大大增加在严重的情况下[10,11]。此外，由先兆子痫中获得的血清还含有细胞毒性因子，可以破坏内皮细胞。因此，这必须发病机制减少或通过药物或其他药剂被抑制。石榴是印度尼西亚古果，主化合物，其中是多酚和碳水化合物[12]可以充当治疗先兆子痫的替代疗法的草药[13- - - - - -16]。据我们所知，没有以前的研究，评价的影响石榴因此，这种病理机制必须被药物或其他药物药物减少或抑制。因此，本研究的目的是调查是否石榴果实提取物调制从先兆子痫患者通过等离子体激发内皮细胞AT1-R和血栓素B2的水平。

2.材料和方法

2.1。内皮细胞分离培养

从人脐静脉收集内皮细胞。从怀孕的母亲获得了具有以下特性这脐静脉：一个健康足月（38孕周）妊娠，血红蛋白水平10克/分升，剖宫产。产后立即将脐带插入缓冲液(100 mL Hank’s Balance Salt Solution (HBSS)、庆大霉素(GENTA, MERCK, Germany)、碳酸氢钠、红酚4 mL、HEPES溶液2 mL、去离子水)中10 cm，并在运输到目标实验室的过程中保持低温。为达到最佳效果，取脐带后12小时内进行分离[17]。

When the umbilical cord was in clean condition, a cannula was inserted (±1.5 cm) at one edge of the vein and secured tightly using suture. After that, the veins were gently washed with PBS and then closed off tightly at the distal edge to the cannula. After washing, the collagenase (SIGMA, type HA, C-6885) (5 mg/10 mL; 10 mL) was injected into the vein by 10 mL syringe then incubated at 37°C for 8 minutes. The cell pellet was suspended in 4 mL 199 culture medium (SIGMA, M-5017, USA) which was supplemented with a cocktail (gentamycin, bicarbonate phenol red, 20% fetal bovine serum (GIBCO), and 20 mL new born calf serum (SIGMA, N-4637, USA). This cell suspension was cultivated into wells that had been coated with gelatin (SIGMA, G1393). Cells were allowed to achieve the confluency at 37°C and 5% CO₂。

2.2。等离子先兆子痫患者的隔离

对于采血，正常妊娠和子痫前期患者均给予知情同意。书面知情同意应由印度尼西亚东爪哇玛琅的Brawijaya大学医学院卫生研究伦理委员会完成。子痫前期患者的临床表现为收缩压(160 mmHg) and diastolic blood pressure (110 mmHg) in two measurements (4–6 hours between measurements) and proteinuria (2+）油尺。Plasma was isolated from 2 mL of whole blood in citrate anticoagulant. The blood was centrifuged at 1000 g, for 10 minutes at −40°C. Plasma was used in cell culture experiments as detailed in the following sections [17]。

2.3。细胞治疗

一旦汇合，细胞处理被分为5个重复实验，包括内皮细胞暴露于2%的正常妊娠血浆(NP);2%血浆子痫前期患者(PP)处理细胞;PP +的乙醇提取物石榴(PG) fruit at several doses, including 14 ppm; 28 ppm; and 56 ppm.

2.4。石榴萃取

石榴在干燥的条件从Bandungan村，三宝垄，中爪哇，印度尼西亚获得。将萃取液通过研磨的肉开始石榴水果使用400目研磨机。取100克粉末(70%乙醇，1:3比例)浸渍2次24小时)。然后从黄芩中分离出多酚类提取物石榴沉积。将该多酚提取物在45-50℃的真空烘箱中干燥8-9小时。这个过程得到25克石榴提取。

2.5。AT1-R表达分析

免疫组织化学检测内皮细胞AT1-R表达。有关方法的详情已在前面解释[18]。我们使用兔抗血管紧张素ii型1型受体多克隆抗体(Bioss Antibody, Catalog bs-0630R, Woburn, Massachusetts, USA)。

2.6。血栓素B2水平分析

使用ELISA技术（;目录KGE011，明尼阿波利斯，MN，USA R＆d系统）测定血栓素B2的水平。根据来自制造商的说明书进行的过程。

2.7。统计分析

数据表示为平均值±标准偏差，并使用采用SPSS 17.0统计软件包软件单因子变异数分析进行分析组间差异。事后检验来检查处理之间显著差异（被认为是统计显著）。

3.结果

表1和图1和2存在于来自每个组的内皮细胞的AT1-R表达。的AT1-R表达显著更高是PP组相比，NP组（)。的最高剂量石榴果实提取物显著抑制了ppl诱导的AT1-R表达增加(）到达与N​​P组相似的水平（)。

表2和图3.存在于血管内皮细胞从每个实验组培养基中的血栓素B2水平。血栓素B2水平相比于NP组的PP组显著更大（)。Out of 14 ppm, 28 ppm, and 56 ppm of extract, only lowest dose of the石榴水果提取物显著抑制了pp诱导的血栓素B2水平的升高(）到达与N​​P组相似的水平（)。

4。讨论

另一方面，先兆子痫的妇女对血管紧张素- ii没有表现出这种耐药，这种耐药早在妊娠第10周就可以观察到，因此早在出现临床明显症状之前就可以观察到。这种敏感性在怀孕8个月后仍然存在[19]。对于这种敏感性的增加有几种解释。首先，子痫前期患者的脂肪组织AT1-R升高。AT1-R的表达可能也存在于其他组织中[20.]。在这项研究中，这是该发现，AT1-R表达显著越高PP组相比，NP组的第一份报告（)。这项研究表明内皮细胞通过暴露于子痫前期血浆调节AT1-R的表达。的最高剂量石榴果实提取物显著防止AT1-R表达PP-诱导增加（)与对照组(NP)的水平相当()。我们的发现表明，石榴果提取物抑制了内皮细胞的AT1-R表达的信号。

在本研究中，PP组的血栓素B2水平明显高于NP组()。这一发现表明子痫前期患者血浆中含有激活环氧合酶的生物活性因子。磷脂酶A2活性催化膜磷脂sn-2酯键水解生成花生四烯酸，花生四烯酸是环氧合酶的底物。这种酶会把花生四烯酸转化为血栓烷。事实上，有报道称先兆子痫的孕妇体内可溶性磷脂酶A2和花生四烯酸水平升高[21,22]。此外，从先兆子痫胎盘的滋养层细胞分泌与正常胎盘相比磷脂酶A2的更高的水平。磷脂酶A2活性的这一增长是积极血栓的更高水平[相关22,23]。Out of 14 ppm, 28 ppm, and 56 ppm of extract, only lowest dose of the石榴水果提取物显著抑制了pp诱导的血栓素B2水平的升高(）到达与N​​P组相似的水平（)。我们假设石榴果提取物抑制为血栓素生产环氧合酶的酶。几份报告显示，石榴水果提取物可作为环氧合酶抑制剂[24,25]。

总之,石榴由于抑制AT1-R表达(56ppm)和降低血栓素B2水平(14ppm)，水果提取物保护和抑制内皮细胞对子痫前期患者血浆的敏感性。

伦理

本研究通过Brawijaya大学健康研究的伦理委员会，医学系，玛琅，东爪哇，印度尼西亚。

利益冲突

作者宣称没有关于本文的发布利益冲突。

承认

作者感谢来自生物医学科学和生理分子实验室的所有技术人员对这项实验的帮助。

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