百里香醌促进胰腺癌细胞死亡和减少肿瘤大小通过抑制组蛋白脱乙酰作用和诱导组蛋白乙酰化作用

文摘

胰腺导管腺癌(PDAC)几乎therapy-resistant。作为恶性肿瘤的病变进展,癌症治疗的前驱期提供了一个窗口可以干扰肿瘤进展。百里香醌(Tq),精油的主要生物活性成分黑种草的种子,已经证明在多个癌症抗肿瘤药活动。在这项研究中,我们研究了抗肿瘤药的潜力在人类PDAC Tq细胞系,AsPC-1 MiaPaCa-2。Tq (10 - 50μ米)抑制细胞生存能力和扩散,造成部分G2周期阻滞在两个细胞系的剂量依赖性的方式。细胞积累subG0 / G1期,表明细胞凋亡。这是与upregulation p53的差别,对这些基因bcl - 2。独立于p53, p21 Tq增加mRNA表达十二倍。Tq也诱导H4乙酰化作用(12)赖氨酸和表达下调hdac活性,减少hdac表达式1,2,3×40 - 60%。体内,Tq显著降低肿瘤大小在建立肿瘤异种移植的67% (),以及增加H4乙酰化和减少hdac表达式。我们的研究结果表明,Tq介导的组蛋白乙酰化的转译后的修改,抑制hdac表达和诱导proapoptotic信号通路。这些分子目标说明理由使用Tq操作作为一个有前途的抗肿瘤药预防术后癌症复发,手术切除后延长PDAC患者的存活期。

1。介绍

黑种草是一个草用于传统医学在许多中东国家治疗广泛的疾病,包括哮喘、糖尿病、高血压、头痛、湿疹、各种胃肠疾病。百里香醌(Tq),最丰富的组成部分黑种草种子的植物精油提取,已经证明具有抗氧化和抗炎活动通过机制仍在定义(1- - - - - -3]。此外,Tq报道显示在多种癌症,抗肿瘤的活动包括前列腺癌、结肠癌、乳腺癌、肉瘤,白血病(1- - - - - -3]。Tq可以抑制癌细胞的增殖,逮捕癌症细胞周期进展,诱导proapoptotic效果,增强细胞毒性化疗药物的活性(3- - - - - -6]。涉及分子目标包括bcl - 2,还存在,PPARs NF-kB, STAT3, MAPK, Akt, ROS (3]。Proapoptotic Tq是通过p53-dependent透露的活动,独立的途径。在异种移植小鼠模型Tq可以抑制肿瘤的生长,可能通过抑制血管生成4]。Tq是显示抑制细胞在乳腺癌细胞迁移和入侵方式存在剂量依赖的相关性(3]。最后,Tq可以减轻一些毒品的毒性与多种化疗药物(3,5,6]。小Tq操作的安全性和临床活性的研究在人类没有发现不良反应与剂量2600毫克/天(3]。

在真核细胞,DNA是紧紧缠绕形成核小体核心组蛋白蛋白质。调节基因表达控制通过乙酰化组蛋白脱乙酰作用,在转译后的修改方式通过组蛋白乙酰转移酶(帽子)和组蛋白去乙酰酶抑制剂(hdac)。hdac抑制导致了组蛋白乙酰化作用和随后的基因表达的变化,它可以抑制细胞周期进程和促进肿瘤细胞的凋亡7]。HDAC抑制剂已报告导致p53-independent p21的表达方式(8]。我们最近已经表明Tq可以作为小说的促炎通路抑制剂PDAC细胞,这是通过本构和差别明显对这些肿瘤坏死因子介导的α激活NF -κB (9]。使用Trichostatin类似结果(TSA),完善的HDAC抑制剂,从而表明Tq可以作为HDAC抑制剂(9]。然而,它尚未决定是否Tq抗肿瘤的活动包括组蛋白乙酰化和脱乙酰作用。

在这项研究中,我们探索了Tq PDAC细胞的抗肿瘤的潜力。除了研究调查Tq和p21表达之间的关系,我们评估Tq对组蛋白乙酰化作用的影响/脱乙酰作用在体外和体内。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

PDAC细胞系,AsPc-1 MiaPaCa-2和Hs766T从写明ATCC购买。细胞在DMEM培养补充10%胎牛血清在潮湿大气中5%的有限公司₂。细胞治疗Tq (10 - 50μ米)(Sigma-Aldrich)。Tq浓度选择基于剂量反应研究。

2.2。MTT试验

细胞生长在48-well盘子和孵化全部37°C和5%增长媒体有限公司₂。Tq治疗后,细胞生存能力检查使用MTT(溴化Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium)转换试验如前所述。简而言之,MTT (Sigma-Aldrich)添加到井(500μg / mL)。4小时后甲瓒晶体在DMSO可溶性,光密度测量在570海里。光密度与可行的细胞数量直接相关。实验进行了一式三份,重复3次。

2.3。流仪分析DNA的内容

细胞,种子在100毫米菜密度为7.5×10⁵细胞/盘,接受Tq和孵化24或48小时。细胞被收获,用磷酸盐(DPBS) permeabilized 70%乙醇,核糖核酸酶处理1%,沾propidium碘(PI),享年100岁μ克/毫升。流仪分析fluorescence-activated进行分选机(FACStar +;正欲)360海里Argon-Iron激光。每样10000事件收集和分析使用细胞适合分析程序(正)。

2.4。膜联蛋白V-FITC染色

Tq治疗后,细胞被洗DPBS缓冲区和从生长板中删除。是通过离心收集细胞5分钟,膜联蛋白V-FITC试剂(BD生物科学)有或没有π复染色用于resuspend颗粒。在黑暗中孵化15分钟后在室温下细胞被流式细胞术分析。FITC (FL1 BP525/5 nm)和π(FL3, BP 610/5 nm)收集在对数模式。分析使用贝克曼库尔特精英执行软件。

2.5。RNA提取和存在

总RNA分离使用Tri-Reagent(技术)。rna是量化和互补dna合成使用ImProm-II™逆转录系统(Promega)。TaqMan基因表达分析是从应用生物系统公司购买的。GAPDH是用作看家基因。互补dna受到实时qPCR使用HotStart-IT或VeriQuest探针qPCR大师混合(Affymetrix)和TaqMan技术(7500序列检测器,应用生物系统公司)。相对mRNA水平量化使用应用生物系统公司软件。

2.6。蛋白质分离和免疫印迹分析

其他地方的细胞或组织溶解产物进行了分析描述(10]。细胞细胞溶解在修改里帕裂解缓冲,在上层清液和蛋白质浓度测定用BCA蛋白质测定试剂(皮尔斯)。平等的蛋白质数量(25μg)运行在10% SDS-polyacrylamide板凝胶,转移到聚乙二烯二氟化物膜,和孵化主要抗体,乙酰化H4(活动主题)和反β肌动蛋白(Chemicon),都在PBST稀释。与二次孵化后抗体、蛋白质乐队是可视化增强化学发光试剂(ECL +免疫印迹检测系统,Amersham法玛西亚生物技术)。

2.7。组蛋白去乙酰酶抑制剂(hdac)活动

确定HDAC活性PDAC细胞Tq治疗后我们使用比色HDAC活性试验装备(Biovision)。HDAC比色底物(乙酰化赖氨酸侧链)孵化与核提取与Tq PDAC细胞治疗后。脱乙酰作用底物的敏化衬底,在治疗与赖氨酸开发人员产生了发色团。在405纳米的发色团吸光度,直接与HDAC活性决定使用协同HT multidetection标(BioTeck)。

2.8。Tq小鼠的毒性

老鼠(8-week-old)被分成组,每组10和Tq毒性决心每天腹腔注射后连续20天。Tq的剂量5、10、20或30毫克/公斤体重。Tq稀释在等渗盐水(0.9%)和控制动物收到相同比例的乙醇稀释的盐水。

2.9。异种移植模型

动物研究批准后进行的协议IACUC托马斯杰弗逊大学医院。异种移植模型生成PDAC还是男性裸体小鼠(Crl:ν/ Nu-muBR)重- g(查尔斯河实验室)。悬浮液AsPC-1或Hs766T PDAC细胞(5×10⁶在0.2毫升PBS)皮下注入4-6-week-old雄性老鼠的侧面。动物被关在光和温度控制的环境和提供食物和水随意。肿瘤大小决定。腹腔内治疗Tq(5 - 30毫克/公斤)在生理盐水或0.1%甲醇三次每周开始当达到皮下肿瘤直径1厘米。5周后动物牺牲,测量肿瘤大小、肿瘤处理实时qPCR HDAC表达水平的评估。

2.10。统计分析

所有实验进行4 - 6次。数据分析的统计显著性方差分析与事后学生的以及分析。这些分析进行援助的一个计算机程序(JMP 5校园软件SAS驱动器)。差异被认为是重要的。肿瘤大小估计Manny-Whitney显著差异的等级和测试。

3所示。结果

3.1。Tq诱导剂量依赖性降低PDAC细胞生长

细胞生存能力显著降低了Tq浓度和时间的函数,在这两种细胞系,MiaPaCa-2(图1(一)),和AsPC-1(图1 (b))。例如,细胞生存MiaPaCa-2细胞治疗50μM Tq 24、48和72 h为82%,80%,和62%,分别。细胞存活率增加浓度的差异与更长的治疗时间变得更加明显。这些结果证实了Tq抑制PDAC细胞增殖。

3.2。Tq诱发PreG1 PDAC细胞积累高峰

细胞周期的概要文件被流监控仪分析PI染色细胞DNA含量在24和48 h后治疗MiaPaCa-2和AsPC-1细胞Tq(30到50μ米)。亚二倍的细胞的DNA直方图显示明显积累preG1峰值在24 h表示死亡,凋亡细胞的积累。30岁时μ米的Tq凋亡细胞的比例增加到29%在24 h,在48小时(图达到49%2(一个)),而增加到15% AsPC-1细胞后24小时和48小时后达到24%(图2 (b))。

3.3。Tq细胞凋亡晚期

分析细胞的数量的直方图显示,晚期凋亡细胞的数量明显增加,同时减少在MiaPaCa-2活细胞的数量(图3(一个)(图)和AsPC-1细胞3 (b))。这些发现证实Tq-induced PDAC细胞数量增加preG1分数是由于细胞凋亡。

3.4。Tq-Induced Apoptosis-Related基因的细胞凋亡是伴随着监管

分析Tq-mediated细胞凋亡的分子机制,我们研究了赞成和凋亡基因的表达在MiaPaCa-2细胞。实时qPCR分析表明Tq诱导剂量依赖性增加Bax mRNA表达(图4)。Tq剂量依赖性下调bcl - 2 mRNA表达,因此,伯灵顿/ bcl - 2 mRNA比率增加。此外,Tq p53诱导2倍增加mRNA表达治疗24小时后和p21 mRNA表达的12倍后最早(图3 h的治疗4)。细胞也用p53抑制剂预处理,击球α前,1 h Tq操作。这种治疗废除p53诱导,伯灵顿/ bcl - 2 mRNA比率下降,减少了从12到2-3-fold p21 mRNA的表达。这些数据提供的证据p53-independent upregulation p21的Tq操作。因为许多HDAC抑制剂已被证明p21刺激信号无论p53的突变状态,我们调查了Tq操作是否可以作为HDAC抑制剂。

3.5。Tq显著减少的表达HDAC 1, 2, 3 mRNA表达和HDAC活性

以确定是否通过hdac抑制Tq操作行为,我们评估实时qPCR hdac 1 - 6的表达。见图5Tq (50μ米)hdac 1 - 3的表达降低40 - 50%。Tq (50μ米)时间(图hdac活动减少了60%6)。

3.6。Tq剂量依赖性增加组蛋白乙酰化作用

评估是否参与组蛋白乙酰化作用Tq操作模式的行动,我们评估在组蛋白赖氨酸乙酰化的12 4 (H4 Ac-K12)免疫印迹。核提取物治疗Tq (30 - 50μ米)MiaPaCa-2细胞表现出剂量依赖性增加乙酰化后24 h(图7)。这些数据表明,Tq操作不仅降低HDAC表达式和活动也增加组蛋白乙酰化作用。

3.7。Tq显著减少肿瘤大小在人类PDAC异种移植

接下来,我们测试了不同剂量的影响人类PDAC Tq异种移植。异种移植生成的还是男性裸体小鼠(Crl:ν/ Nu-muBR)重- g(查尔斯河实验室)。人类PDAC细胞系(AsPC-1和Hs766T)被利用。当肿瘤达到1厘米,动物服用不同剂量的Tq(5 - 30毫克/公斤体重)。我们这里显示数据从动物对待Tq 30毫克/公斤体重5周。肿瘤大小显著((图)萎缩67%的动物8)。分析肿瘤的hdac表明Tq显著降低hdac 1的表达,2和3 mRNA相比vehicle-treated控制(图9)。

4所示。讨论

胰腺导管腺癌(PDAC)仍然是一个迫切的临床问题,因为其侵略性质和抗化疗和放疗。在这项研究中,我们表明,百里香醌(Tq),中东草的有效成分,黑种草,显著抑制PDAC细胞生长和触发器感应不同的proapoptotic信号通路在人类PDAC细胞在体外和体内。这项研究也是第一个表明Tq介导转译后的组蛋白乙酰化的修改和hdac抑制表达式。

肿瘤抑制基因p53是细胞压力的传感器,是细胞凋亡的内在途径的关键催化剂。p53的刺激可以通过激活启动细胞凋亡proapoptotic bcl - 2家族成员,如伯灵顿,和抑制凋亡bcl - 2蛋白,如bcl - 2和Bcl-xl。伯灵顿发生构象变化,随后把线粒体,它插入外膜低聚物,从而导致细胞色素的释放和细胞凋亡11]。bcl - 2 / Bcl-xl形式与伯灵顿形成并防止其插入到线粒体膜。因此,bcl - 2 / Bcl-xl比伯灵顿对凋亡阈值的确定至关重要。研究表明,放松管制的伯灵顿/ bcl - 2 / Bcl-xl有助于发展,增长和扩张的PDAC [12,增加伯灵顿和减少bcl - 2 / Bcl-xl显著提高对化疗药物的敏感性(13,14]。Bcl-xl PDAC治疗被认为是一个理想的目标是持续在PDAC细胞系,是高度耐Fas和TRAIL-mediated凋亡[15]。在我们的研究中,我们表明,Tq (100μ米)诱导显著增加伯灵顿/ bcl - 2 mRNA表达比在PDAC细胞,导致细胞凋亡。

细胞反应的激活p53肿瘤抑制发生细胞周期阻滞通过激活p21的表达。我们的结果表明,有一个显著增加(12)在p21的表达,没有一个相当于增加p53表达(2倍)PDAC细胞治疗Tq最早3 h。这表明p21 Tq诱导表达,部分p53-independent方式。因为许多HDAC抑制剂已被证明p21刺激信号无论p53的突变状态(8,16),我们调查了Tq能否作为HDAC抑制剂。

组蛋白乙酰化和脱乙酰作用(表观遗传调节)是调节基因表达的机制。在肿瘤细胞中,乙酰化/脱乙酰作用平衡变得中断。组蛋白是染色质结构和基因表达改变修改。组蛋白乙酰转移酶(帽子)decondensate染色质和放松折叠核小体,使转录因子启动子站点的绑定8,17,18]。这有效地激活基因表达。组蛋白去乙酰酶抑制剂(hdac)相反的机制和效果,导致基因沉默。Hypoacetylation,由于减少的帽子或HDAC活性增加,导致肿瘤抑制基因的沉默。组蛋白hypoacetylation或hdac超表达与前列腺癌的发展,乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、胃癌(19]。它已经表明,hdac在PDAC [20.),这与HIF-1a超表达,与恶化的生存预后相关(21]。

与基因突变,这是几乎不可能逆转,表观遗传的变化可能是可逆的。这意味着他们是服从药理干预措施。HDAC抑制剂(HDAC-i)显示在多种肿瘤类型显示抗肿瘤的活性,抑制细胞生长和诱导细胞凋亡17,19]。2006年,第一个HDAC-i vorinostat (Zolinza),被批准为单药使用T细胞淋巴瘤(18]。今天,几个后生已经FDA批准的药物和EMEA大约十HDAC-is在癌症治疗和临床开发(22]。在PDAC细胞系HDAC-is结合常规化疗的使用已证明改进抗肿瘤活性比常规化疗独自[23- - - - - -25]。体内,但是,这还没有被证明。吉西他滨的第二阶段研究结合tacedinaline(已知HDAC-i)没有显示出改善病人反应率或独自生存相比,吉西他滨26]。因此寻找有效HDAC-is仍在继续。

我们的研究表明,Tq可以作为HDAC-i PDAC细胞,能强有力地诱导细胞凋亡,影响组蛋白的表观遗传状态通过诱导组蛋白乙酰化作用和抑制组蛋白脱乙酰作用(图10)。我们的数据表明,Tq,作为多目标代理,有临床潜在的抗炎和proapoptotic表观遗传修饰相结合模式的行动。

相互竞争的利益

所有命名的作者没有经济利益的这项工作和出版或其他利益可能认为影响报告的结果和/或讨论这篇文章。

确认

作者承认研究的支持和资助他们收到的手术,托马斯杰弗逊大学医院,费城,宾夕法尼亚州,美国生物医学科学系的,新英格兰大学Biddeford,我,美国相关工作。

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