免疫原性研究中使用食肉动物与定点缺失的磷酸化蛋白狂犬病病毒构造

抽象

不同的方法已应用到开发mesocarnivores的口服疫苗高度减毒狂犬病毒疫苗。一个原型疫苗构建体是SAD dIND1，其包含在P-基因的缺失严重地限制了1型干扰素诱导的抑制。在狐狸和臭鼬的免疫原性研究开展了调查这一高度减毒疫苗是否会比父母SAD B19疫苗株的免疫原性更强。在狐狸，它证明了SAD dIND1保护，以防止狂犬病感染动物单次口服剂量后，虽然病毒的中和抗体滴度大于如在先前的实验中观察到与SAD B19病毒口头接种狐狸低。与此相反，臭鼬10接收^7.5FFU SAD dIND1没有开发病毒中和抗体和没有对随后的感染狂犬病的保护。

1.简介

由于狐狸的口服疫苗接种(Vulpes Vulpes）狂犬病疫苗。许多国家在西部和中部欧洲的分销口服狂犬病疫苗（ORV）饵料消除陆生野生动物狂犬病。红狐狸不再是那些诱饵的唯一目标品种;口服接种狂犬病疫苗项目是针对许多不同地区的许多不同的动物物种，全世界。目前可用的商业ORV都复制能力的病毒，因此造成内在的安全风险。疫苗病毒相关的狂犬病病例已报告的目标和非目标物种[1-3]。此外，在人类直接接触重组ORV后也观察到不良反应[4，五]。此外，一些动物物种都难以通过使用现有的产品口服接种狂犬病疫苗。因此，对于更安全的ORV候选人提高了疗效持续的计划已经启动以来的第一ORVs成为市售[6]。考生一组是基于狂犬病毒的基因组进行定点突变。原来，这些努力集中在编码狂犬病毒糖蛋白基因。抗狂犬病毒保护的主要方式是病毒中和抗体的（VNA）产生针对糖蛋白[6]。然而，先天免疫和适应性免疫的其他方面也有助于病毒清除。此外，针对核蛋白细胞介导的免疫和体液免疫，基质蛋白和磷的动物的抗狂犬病保护中的作用尚不明确。由于这些原因，其他狂犬病毒的基因提供可能性的高度减毒的病毒的发展，例如，能力磷蛋白以抵消干扰素的转录活化（IFN）通过用IRF-3 [磷酸化干扰类型17，8]。磷酸化蛋白一个小的内部结构域(aa 176-186)的位点定向缺失，破坏了有效阻止IRF-3激活的能力，从而阻止IFN型1的诱导[9]。甲病毒构建体，SAD dIND1，被开发包含氨基酸176-181的缺失在于已失去其大部分抑制活性在防止IRF-3的活化的磷蛋白。这种结构被证明是后一.C在成年小鼠完全无毒管理[9，强调I型IFN系统可能是在缺乏适应性免疫的情况下能够控制病毒感染的最强大的抗病毒反应[10]。两个水库的野生动物物种的试点实验开始调查SAD dIND1是否比亲株SAD B19更具有免疫原性。两个野生动物物种储评估包括在高度易感红色狐狸和臭鼬（恶臭恶臭）;后者是一种动物物种众所周知的耐火口服狂犬病免疫[11，12]。虽然通过口服途径与SAD dIND1接种狐狸躲过了随后的狂犬病挑战，构建无法保护臭鼬对后续感染狂犬病。

2.材料和方法

2.1。病毒构造

的SAD dIND1构建体如先前所述开发[9使用含有ORV株SAD B19的一致序列的重组狂犬病毒SAD L16。通过位点诱变，删除了磷酸蛋白的176 - 181氨基酸密码子。这些研究中使用的病毒材料在稳定表达t7 RNA聚合酶的BSR t7 /5细胞中使用0.1的MOI进行繁殖[13]。SAD dIND1被认为是一种遗传修饰的生物体（GMO），并且被分类为在德国BSL2病原体。对于这样的转基因动物研究的许可证已经从相应的监管机构（AZ-66230-1501-3，Landesverwaltungsamt萨克森 - 安哈特，德国）。

2.2。攻击病毒

攻击病毒，CVS / USA / TX狼/ 295 / R / 061893，由CDC（USA）获得和最初从狼的唾液腺（隔绝犬latrans)。原来攻击病毒已经接种了一只狐狸，从大脑重新分离后的动物死于狂犬病。该病毒分离物的狐狸传代一次终于从唾液腺重新分离。The foxes and skunks were administered 1.0 mL of the challenge virus (10^5.1MICLD50）在M.咬肌通过肌肉注射路线。

2.3。动物

圈养繁殖的动物从不同的商业来源获得;狐狸从英足总。波兰Phu Foxpol和荷兰AGHIA鸟类公司的臭鼬。通过植入微芯片(UNO BV, Zevenaar，荷兰)对动物进行识别。接种过疫苗的狐狸被单独饲养在笼子里，笼子设在IDT动物屋的隔离单元内。接种过疫苗的臭鼬被成群地关在一个隔离单元中，直到挑战来临，每只臭鼬都被单独关起来。对照组动物被关在外面的笼子里，直到注射了挑战病毒后，它们也被转移到隔离室内的单独笼子里。狐狸一天喂一次，水随便给。狐狸得到新鲜的商业食品，毛皮动物，(Schirmer & Partner, Doehlen [D])。这些臭鼬被喂食商业干宠物食品，每天两次(100克= 25克猫粮(Drei-Mix, Miehlitz KG) + 75克狗粮(Good deal, Voro-Dog Vertrieb, Enger)，每只动物每天一次用5克维生素混合物代替水浸泡(Multivit, Inropharm GmbH Furstenzell)。 The skunks were also fed fresh fruit daily. The animals were observed at least once a day. After challenge, the animals were observed more frequently, and, on onset of CNS-related clinical signs, the animals were euthanized with T61 intracardial, 0.3 mL per body weight kilogram (Intervet Deutschland GmbH, Unterschleissheim [D]), after sedation with a ketamine 1.0–2.0 mL 10% (WDT eG, Garbsen [D])-xylazine [Xylariem, Riemser Arzneimittel, Riems [D]) mixture.

动物的住房条件满足在德国动物福利法规定的条件，§2及2a和GV-SOLAS公约（学会实验动物科学）的建议。所有的实验按照德国动物福利法案§8a，ABS开展了。1和2.f.

2.4。疫苗接种

Eight adult foxes were vaccinated with 1.5 mL SAD dIND1 using different doses and routes of administration (Table1)。动物用2只控制动物SAD dIND1给药后62天挑战在一起。攻击后五十天，所有存活的动物实施安乐死。采集血样在第0天（接种前），28，58，和疫苗接种后112。在与不同的候选疫苗的剂量依赖性研究，3周臭鼬10接收^7.5采用直接口服灌胃法，45天后与2只对照组动物进行挑战。在接种疫苗后5、28、42和57天收集了臭鼬的血样。所有动物在使用SAD dIND1和采血时均给予镇静。

2.5。测定

2.5.1。FAT / IHC

狐脑样品中抗原狂犬病病毒的存在下使用如由Dean等人描述的荧光抗体试验（FAT）检查。[14]。将臭鼬海马标本固定在4%磷酸盐缓冲甲醛中，进行石蜡包埋和免疫组化(IHC)处理，对之前描述的方法进行了轻微修改[15]。臭鼬海马已被证明是非常适合于这些目的[16]。

2.5.2。RFFIT

采用快速荧光聚焦抑制试验(RFFIT)检测采集的血液样本是否存在狂犬病VNA [17]，与该方法的修改由Cox和施奈德[描述18]。在测试之前，血清样品在56均热灭活30分钟℃。为了计算滴度，在狂犬病病毒的浓度降低50％在体外通过使用逆插值（SAS软件9.2）的计算。The rabies VNA titers were converted to international units (IU) by comparison with international standard immunoglobulin adjusted to 0.5 U/mL, which served as a positive control.

3.结果

所有接种了SAD dIND1的狐狸，无论剂量和给药方式如何，都在致命挑战中存活，并在挑战50天后实施安乐死。与此同时，两只对照动物在挑战后10天和11天出现狂犬病感染临床症状后实施安乐死。在两种动物的脑内均检测到狂犬病抗原。所有接受SAD dIND1血清转换的狐狸的VNA滴度大于0.5 IU/mL的任意阈值(表)2)。狂犬病VNA抗体水平显示剂量和通路依赖反应。与狐狸相比，SAD dIND1没有给予臭鼬足够的免疫力来防止感染后的挑战暴露。不幸的是，臭鼬的小样本量进一步减少。一只接受了SAD dIND1的臭鼬被排除在外，因为它在观察期间患上了严重的皮炎，被安置到另一个隔离单元。经免疫组化证实，其余4只动物均死于狂犬病。2只对照动物和2只接种动物在挑战后第13天出现中枢神经系统紊乱的临床症状后实施安乐死。在观察期间，接受SAD dIND1治疗的臭鼬均未出现可检测到的狂犬病VNA(见表)3)。挑战后，无论是对照动物的VNA的检测水平，同时接受SAD dIND1两个动物保持阴性。

4.讨论

野生动物在环境中传播orv的一个主要问题是，包括人类在内的非目标物种有可能接触到这些疫苗病毒。第一代病毒减毒后的安全性问题导致了不同重组疫苗载体表达狂犬病毒糖蛋白;如牛痘病毒、人腺病毒5型、伪狂犬病毒、犬疱疹病毒、犬腺病毒2型等[19-24]。一些复制能力的载体是基于人类病原体，因此也并非没有风险，特别是考虑到免疫功能低下者的。遗憾的是，复制缺陷型的构建体等的E1缺失的人腺病毒5型表达狂犬病毒糖蛋白口服给药后不诱导可检测的狂犬病VNA [25]。必须达到的平衡被构建病毒递送系统，该系统被完全衰减到使其安全和防止复制和还具有足够的病毒特性，其允许吸收到允许细胞和蛋白质生产，以诱导免疫应答。的一些这些重组构建体的另一重要限制是预先存在的免疫性的载体病毒，严重损害其效力[的干扰26-28]。预存免疫力的病毒载体的病毒不会对高度减毒狂犬病毒结构非常重要。因此，几个狂犬病毒的构建物已选择或开发以及他们为狂犬病疫苗的潜在用途进行测试，其中包括在磷定点缺失或它的完全缺失[结构29-31]。例如，去除动力蛋白轻链8结合位点基序的显着减少病毒转录和复制在中枢神经系统[32]。另一种策略是使基本磷的表达依赖于翻译和转录不[33]。SAD dIND1结构使用了一种不同的方法，旨在诱导免疫动物改善先天免疫反应。位点定向诱变引入的缺失干扰了病毒抑制IFN诱导的对策[34]。增强的抗病毒的宿主反应在接种小鼠I.C.证实与SAD dIND1或与亲本菌株SAD L16。虽然与SAD L16接种的所有小鼠死于狂犬病，所有SAD dIND1接种动物存活[9]。口服疫苗的候选必须是安全的和有效的，优选地赋予终生免疫，单个诱饵后食用[35]。尽管所有接种了SAD dIND1疫苗的狐狸都能完全抵抗狂犬病毒的侵袭，但VNA低于提供含10的诱饵的狐狸^6.3疫苗株SAD B19的FFU [36]。The geometric mean titre of 27 foxes was 43.5 and 33.9 IU/mL 60 and 110 days after the animals had consumed a SAD B19 vaccine bait, respectively. The difference in VNA titre is more notable considering that the administration of the SAD B19 vaccine was by bait consumption instead of by direct oral gavage for SAD dIND1. The lower VNA titres observed in the SAD dIND1 vaccinated animals could have been a result of the IFN Type 1 induced shift towards a Th1 immune response [7]。然而，它更可能是狂犬病毒糖蛋白的抗原呈递细胞减少病毒生长和抗原呈现。IFN的诱导增加了SAD DIND感染的细胞将导致限于病毒扩散，因为未感染邻近细胞已被放置到“抗病毒”状态通过抗病毒IFN的表达刺激的基因通过IFN信号传导途径[10]。从小学感染的细胞释放的狂犬病毒在这些细胞中复制效率低下。不幸的是，SAD dIND1没有引起在臭鼬VNA的检测水平，因此没有动物诱导的针对攻击的保护性免疫反应。SAD dIND1诱导狂犬病VNA的能力相比，SAD B19疫苗株降低也显示在臭鼬。在与SAD B19 7臭鼬receiving10的前安全性研究，3^7.9在接种疫苗296天后，所有3只动物均有可测量的狂犬病毒VNA (>5.0 IU/mL)水平[37]。从本研究中可以得出结论，在SAD dIND1反应中IFN的产生增强，可产生较强的抗病毒效果，优于公认的I型IFN的免疫刺激作用。为了使高减毒复制活性病毒，作为一种有效的狂犬病疫苗候选口服疫苗，包括条纹臭鼬，必须提高其免疫原性。这可以通过改变删除区域来实现，从而可以调节对IRF-3激活的抑制作用。例如，另一种缺乏氨基酸的磷酸蛋白(SAD dIND2)对IRF-3激活的抑制作用较低，而不是176-181 (SAD dIND1)。9]。因此，可以认为，在感染的主机SAD dIND2，有较少的IFN 1型感应随后导致更显着的病毒传播和抗原呈现。然而，SAD dIND2是在对比SAD dIND1小鼠没有完全无毒[9]，再次强调在确定安全性和疗效之间的微妙平衡的困难。

致谢

作者要感谢球队在动物屋（IDT）的动物和实验室工作人员在不同的实验室诊断照顾。此外，他们要感谢纳丁哈根多夫制备病毒储存和Martina里德尔的有关文件发表意见。A. R. Fooks被部分由英国环境，食品和农村事务部（Defra资助SEV3500）和EPIZONE（卓越欧盟网络的流行性疾病诊断和控制-FOOD-CT-2006-016236）资助。这项工作是由教育和研究的德国联邦卫生部（批准号。01KI1016A）进一步支持。

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