2005年至2010年对马达加斯加人、家畜和蝙蝠狂犬病的实验室监测

抽象

背景。狂犬病毒(RABV)至少自19世纪以来就在马达加斯加流行。目标。为了评估狂犬病病毒的循环岛2005至2010年。材料和方法。使用抗原、核糖核酸(RNA)、抗体检测和病毒分离对动物(包括蝙蝠)和人类样本进行RABV和其他lyssavirus检测。结果。测试了437组国内或驯服陆栖野生哺乳动物的大脑中有一半被发现RABV抗原阳性，其中包括341个狗测试的54％。这个比例从26％到整个期间75％。所测试的10名可疑的人类病例九项实验室确诊。RABV循环被证实在采样的38个区的34。无狂犬病病毒RNA在1983年的蝙蝠标本进行检测。尽管如此，在12中50的血清中检测到抗拉各斯蝙蝠病毒抗体精灵dupreanum标本采样。结论。在接种狂犬病疫苗一个多世纪后，狂犬病仍然在马达加斯加流行。

1.简介

狂犬病是由属于埃希11个病毒种类人畜共患疾病Lyssavirus（弹状病毒科），包括狂犬病病毒（RABV），最常见[1- - - - - -3.]。这些病毒是哺乳动物脑膜炎的罪魁祸首。病毒传播到健康的哺乳动物主要是通过被感染哺乳动物的咬或抓(唾液是传染性物质)。蝙蝠被认为是其中10种病毒的天然宿主。然而，狗是人类感染的主要来源。据估计，全世界每年有55 000人死于狂犬病，其中约56%发生在亚洲，44%发生在非洲。在非洲和亚洲，这些死亡导致每年丧失174万残疾调整生命年[4]。当这种疾病被宣布时，没有有效的治疗方法。然而，对于RABV和密切相关的lyssavirus，在接触后尽快使用是一种有效的治疗方法。预防出现症状和死亡，包括伤口局部治疗、注射狂犬病免疫球蛋白(如有)和接种狂犬病疫苗[5]。

lyssavirus存在于除南极洲以外的所有大陆。RABV是最广泛的，在全球广泛分布，只有少数国家(主要是岛屿和半岛)没有这种疾病。马达加斯加，印度洋西南的一个岛屿，不属于这些例外(http://www.who.int/rabies/rabies_maps/en/index.html)。狂犬病毒至少从19世纪开始就在马达加斯加流行。据报道，前法国殖民地的一位管理者的儿子在1896年死于狂犬病，他的死是1898年在马达加斯加建立巴斯德研究所的原因之一。第一次使用狂犬病疫苗进行暴露后治疗是在1902年。自那以后，有几份报告描述了岛上的狂犬病情况[6- - - - - -9]。最后一次调查覆盖了1982年到1991年，显示狂犬病在岛上的5个省肆虐，狗基本上是病毒的载体[9]。我们在此报告过去6年(2005-2010年)由马达加斯加巴斯德研究所的国家狂犬病诊断授权实验室独家开展的实验室监测的结果。

2.材料和方法

2.1。样品

定期检测狂犬病的动物样本包括由兽医、动物卫生官员和技术人员、动物所有者或接触这些动物的人(或亲属)发送的陆地上不会飞行的哺乳动物的大脑、头部或尸体。人类样本包括死后的脑活检或从颈后取出的皮肤活检，通常发送于℃，医院工作人员。一旦在NLR接待，脑组织活检保持在在48小时内处理。皮肤活检保存在- 80℃直到处理。

此外，还对从蝙蝠身上采集的样本进行了测试。它们是在一项寻找与蝙蝠有关的病毒的调查中获得的。样本由保存在病毒传输介质(VTM)中的血清、血凝块和咽拭子组成。它们在12小时内被送到实验室，然后在到达后储存在零下80摄氏度。当磁场远离实验室时，它们被储存在液氮中，然后运送到实验室。检测时，将每个血块在含有30%胎牛血清的细胞培养基(DMEM)中1:10稀释下研磨，3000 rpm离心10 min°C。然后在测试前，用10个上清液或10个咽拭子VTM组成水池。

2.2。RABV抗原检测

狂犬病核衣壳检测采用荧光抗体试验(FAT)，兔IgG抗RABV核衣壳(Bio-Rad, marns -la- coquette, France)，并以脑死后活检为标准[10]。

2.3。RABV RNA检测

RNA是根据由Dacheux及其同事描述的方法从皮肤活组织检查中提取11]。使用TRIzol LS (Invitrogen公司，Carlsbad, USA)从蝙蝠血凝块上清液或蝙蝠咽拭子VTM中提取RNA，并按照制造商的建议，使用TRIzol从大脑活检中提取RNA。

利用逆转录和半乳糖PCR对Lyssavirus的转录酶基因保守区域进行检测[11]。

2.4。RABV隔离

进行病毒分离以确认狂犬病常规检测动物样本狂犬病毒抗原检测阴性结果。2005年至2007年，在新生小鼠中进行病毒分离[10，然后在细胞培养(Murina神经母细胞瘤细胞系)中分离[12]。

在新生小鼠的病毒分离也用于从蝙蝠采集的样品。

2.5。抗lyssavirus抗体的检测

利用Lyssavirus快速荧光聚焦抑制试验，在Bat血清中检测出RABV、Lagos Bat Virus (LBV)、欧洲Bat Lyssavirus 1型(EBLV-1)、EBLV-2、Mokola Virus (MOKV)和澳大利亚Bat Lyssavirus (ABLV)的抗体[13]。

3.结果

3.1。狂犬病病毒检测的人与国内或驯服野生动物样品

在6年期间，NLR收到461个标本，450动物和11来自人类。大多数动物450个样本来自国内食肉（= 409,90.9%)，包括狗(= 353 78.4%)和猫(= 56岁的12.4%)。我们注意到狐猴，一种马达加斯加特有的灵长类动物，占了动物样本的2%。所有的狐猴都被当作宠物饲养。所有动物都有大脑。此外，还对11例人类疑似狂犬病病例进行了实验室调查。人体标本包括皮肤活检6例，脑活检4例，脑脊液活检1例。14个样品不足，无法进行测试，主要是由于储存不足(见表)1)。

437个动物样本(全部是大脑)中有一半在使用脂肪时呈阳性。所有狐猴样本的测试结果均为阴性。不经常取样的牛和猪，经常被发现呈阳性。被检测的狗中有一半以上被感染1)。这一百分比在26%(12/47)到75%(58/77)之间变化(图)1)。当比较一些特点确诊患狂犬病的狗和未感染狗RABV抽样从2006年到2010年,阳性预测值最高狗怀疑rabies-clinical疾病或不寻常的自发攻击60.6% (95% CI 53.6% - -67.7%),狗咬50.9% (95% CI 44.3% - -57.5%),或狗小于4岁57.3% (95% CI 48.9% -65.8%)(表2)。经检测的10例人间病例样本中有9例呈阳性(见表)1)。一次皮肤活检结果为阴性。

在6年期间，从马达加斯加111个行政区中的38个收到了447份样本。大多数样本(365个;82%)从安塔那那利佛省收到。在38个地区中，有34个地区证实有狂犬病流行(图)2)。该病毒出现在首都安塔那那利佛(155只动物中有59只被感染)。在抽样的38个地区中，有4个地区未发现狂犬病流行。然而，从他们那里收到的样本很少(一个地区6个，其他3个地区各1个)。

3.2。野生动物样本中Lyssavirus和抗体的检测

只采集了两种野生陆生哺乳动物的大脑样本:一个窝(Cryptoprocta猛鲑），马达加斯加最大的哺乳动物食肉动物，和一个屋顶鼠（家鼠)。他们测试了负面的。

从食虫和食果蝙蝠获得的样品的大集合还测试（表3.)。他们（i）期间横向调查寻找在马达加斯加[在2004年和2005年开展亨尼帕收集14]和（ii）一个纵向调查从2005年在Angavobe和Angavokely洞穴进行到2009年该主机马达加斯加稻草色果蝠（精灵dupreanum)(图2)。在这些血液样本和口腔拭子中未检测到lyssavirus rna。所有这些样本在新生小鼠中均未分离到lyssavirus。

28只马达加斯加飞狐的血清(狐鲁弗斯和50只马达加斯加稻草色果蝠(精灵dupreanum)检测了抗溶菌病毒的抗体。分别在5只和1只马达加斯加飞狐体内检测到EBLV-1和LBV抗体。12只马达加斯加草黄色果蝠(24%)体内检测到LBV抗体，滴度从35.2到65不等。未检测到MOKV、EBLV-2和ABLV抗体。

4。讨论

尽管引进一个世纪前在马达加斯加狂犬疫苗的，经常性的正实验室诊断犬类狂犬病的建议，这个人兽共患病留在岛上流行（图1)。2005-2010年期间发现感染RABV的狗的百分比(54%;(185/341)与1959-1991年期间观察到的(57%;(1416/2475)9]。狗可能留在岛上RABV的主要载体。在马达加斯加关联到狗RABV菌株显示出属于世界性谱系[15,16]。有在塔那那利佛，首都RABV循环的证据。塔那那利佛有，在2007- 2008年，狗的密度高于非洲其他许多城市地区，狗人口无限制不遮体，接种狂犬病疫苗，这一特点可能有利于病毒的传播[17]。这种情况可能不仅限于马达加斯加首都，也可以解释该岛狂犬病流行的情况。

几个地方病或（少数）引入食肉动物（家庭灵猫科和Herpestidae）存在于马达加斯加[18]。到目前为止，对这些物种的疑似动物进行了测试的很少。1例确诊患有狂犬病的人类个案被窝窝咬伤(Cryptoprocta猛鲑)，从该病例获得的菌株被确认为RABV种的一种lyssavirus，在系统进化上与那些在马达加斯加犬中流行的病毒密切相关(数据未显示)。因此，在野生陆地食肉哺乳动物中可能的媒介的问题仍然没有答案。考虑到以消灭岛上狂犬病为目标的狂犬病控制方案，这个问题非常重要。

我们对蝙蝠的广泛调查未能发现任何与这些哺乳动物相关的lyssavirus。我们用来检测溶菌病毒的分子技术被证明是灵敏的、可重复的和可重复的[11]。此外，新生小鼠的病毒分离被认为是敏感的，因为我们从蝙蝠标本中分离出了几种病毒，如马达加斯加草黄色果蝠中的Ife病毒(精灵dupreanum)和达喀尔蝙蝠病毒从彼得斯皱唇蝙蝠(Mormopterus jugularis)(未公开的数据)。北美洲和欧洲蝙蝠群落的活动性感染(检出病毒)发生率较低(0.1至2.9%)，尤其是临床正常蝙蝠[19]。因为我们采样的是临床正常的蝙蝠，而且我们每个地点和每个物种的采样规模最多约为100只动物(除了后续采样的750只动物)，因此，我们在检测lyssavirus时的阴性结果并不令人惊讶。1987年和1988年在马达加斯加的59只小无尾蝙蝠的大脑样本中，Lyssavirus的检测也呈阴性(Chaerephon、)[20.]。有趣的是，我们得到了血清学证据表明，狂犬病病毒有马达加斯加蝙蝠之间传阅。狂犬病病毒LBV已经从非洲稻草色果蝠隔离（精灵helvum)，是该属的第二种，分布在非洲多个国家[21]。我们分离出病毒伊费和来自马达加斯加稻草色果蝠的alpha疱疹病毒[22]。这两种病毒也在非洲麦秆色果蝠身上发现[22,23]。因此，我们高度怀疑马达加斯加存在LBV。因此，接触马达加斯加蝙蝠后应接种狂犬病疫苗。然而，人们应该记住，狂犬病疫苗对属于第二种系统组的lyssavirus(包括LBV)的有效性较低[24]。

我们最近的研究表明，以溶菌病毒聚合酶基因保守区域为目标，并应用于活前或死后皮肤活检(标本比大脑标本更容易收集)的半封闭式PCR可以成功地进行狂犬病诊断[11]。我们提高了暴露后预防中心工作人员对这一操作的意识。从那个时期(2008年)开始，我们接受了狂犬病疑似病例的死后皮肤活检，其中一些病例来自远离安塔那那利佛的地方，比如该国南部海岸的Taolagnaro(数据未显示)。在这6例中，有5例已确认感染狂犬病。这些易于操作和运送到实验室的样本应通过马达加斯加在卫生保健人员中得到更多的推广，以便更好地了解人类狂犬病的流行情况。此外，这个程序也应该在食肉哺乳动物上进行测试，考虑到取样携带触须的皮肤(在这些毛发的基部周围有丰富的神经末梢)。这种方法有助于避免在这些动物的采样中被含有狂犬病毒的生物液体污染，并促进疑似狂犬病动物的采样。

到目前为止，由于经济原因，在马达加斯加的111个行政区中，只有26个设有狂犬病暴露后预防中心。我们仅从其中13个国家收到了疑似狂犬病病例的样本，并证实狂犬病毒在所有这些国家传播。有必要反复确认其在所有26个区的传播，特别是在最近没有狂犬病动物报告的两个岛屿(Nosy Be和Sainte Marie)。应在其他13个区推广抽样，以评估这些中心的针对性。

5.结论

在马达加斯加引入狂犬病疫苗一个多世纪之后，狂犬病仍然是岛上的地方病。到目前为止，通过控制和最终消除犬类狂犬病来预防人类狂犬病仅限于当地的主动行动。马达加斯加同其他国家一样，面临众多公共卫生问题。由于国家收入低和缺乏流行病学数据，这一疾病没有得到优先重视，控制方案无法合理启动。然而,马达加斯加岛,和消除狂犬病及其可持续性应促进引入的风险有限的动物,因此,这些数据的集合(人类和动物监测、狗生态学研究中,动物咬伤,等)应提倡首先试点规模,以验证所使用的工具。随后，数据收集应扩大到全国各地，同时试点狂犬病控制项目(犬疫苗接种、犬群管理、人类接触后预防、教育、信息等)应在试点地区开始，然后推广到全国各地。

承认

The laboratory surveillance received financial support from the Institut Pasteur from Madagascar and the Ministery of Public Health from Madagascar.

参考

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