还原PKC活性诱导红细胞衰老表型

摘要

衰老细胞抗原聚集或裂解带3和外化磷脂酰丝氨酸(PS)在衰老红细胞表面的表达及其在某些贫血中的过早表达的分子机制尚未完全阐明。具有这些表面修饰的红细胞经历巨噬细胞介导的吞噬作用。在本研究中，研究了蛋白激酶C (PKC)亚型在这些表面修饰表达中的作用。抑制PKC30岁 μM rottlerin (R30)和2.3 nM Gö 6976引起衰老细胞标记物外化PS (FACS)和聚集带3 (western blotting)的表达。与此相反，但与文献一致的是，phorboll -12-myristate-13-acetate (PMA)激活PKC也导致了衰老标志物的表达。我们通过证明pma处理的细胞显示PKC活性的降低来解释这一对立，从而模拟抑制。PKC的减少活性可能归因于pma激活的PKC的已知下调，由其膜易位和蛋白水解引起。我们证明了PKC的膜易位在PMA处理的细胞中证实了这一推断。因此PKC的丢失活性通过抑制或下调可引起表面修饰，从而引发红细胞吞噬。

1.导言

人红细胞有一定的寿命细胞表面修饰，如蛋白带3的聚集或分裂和PS的暴露[1- - - - - -3.]这些标记物的时间压缩表达导致贫血患者出现过早的眼睑下垂[4，5］.介导这些衰老表面标记物表达的分子事件已部分在红细胞中描述，主要是在氧化条件下[6，7］.它们似乎再现了有核细胞凋亡中的细胞质事件，如Fas转位到木筏，Fas相关复合物的形成，以及caspases 8和3的激活[8].caspase 3的激活又与带3的断裂有关[9]，在红细胞中产生衰老细胞抗原[10]，并导致氨基磷脂翻转酶活性受损和PS外化[11］.这种在细胞吞噬和凋亡中分子事件的相似性促使我们探索PKC亚型的作用，它在有核细胞的细胞存活和凋亡中具有明显的组织特异性作用[12]，在眼睑下垂中。

PKC是一个丝氨酸/苏氨酸激酶家族，由11个异构体组成，这些异构体对激活的辅助因子需求不同，因此被分为经典(/二酰甘油（DAG）依赖性：，我,二,，)，新颖(依赖DAG的:，，，)，以及非典型(/DAG独立：，，相关激酶)异构体[13］.我们之前已经证明正常的红细胞表达PKC，，，［14］.本研究表明PKC活性在体外降低α导致红细胞中衰老细胞抗原的表达。

2.材料和方法

2．1．化学物质

PMA（第8139页），4-佛波醇12,13-二癸酸酯（4PDD（p8014）、苯基甲基磺酰氟（p7626）、抗带3 N端单克隆抗体（B9277）和抗--actin抗体(A5316)购自Sigma。Rottlerin(557370)、Gö 6976(365250)购自Calbiochem。PKC活性试剂盒(RPN 77)、增强化学发光试剂(ECL plus) (RPN 2132)和辣根过氧化物酶(HRP)偶联抗小鼠IgG (NA 931)均来自GE Healthcare。聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(IPVH 00010)来源于Millipore。Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒I(556547)来自BD Pharmingen。Anti-PKC抗体来自转导实验室的PKC取样器试剂盒（S 85080），胶体金总蛋白染色（170-6527）来自Bio-Rad实验室。P ATP是从印度原子能部辐射和同位素技术委员会获得的。

2．2．生物材料

本研究在获得医院伦理委员会的伦理许可后进行，并在样本采集前填写知情同意书。采用含乙二胺四乙酸(EDTA)球茎静脉穿刺采集外周血5 mL，分离红细胞。健康自愿捐献者(N)世卫组织报告称，该研究没有招募任何健康问题(）.志愿者的年龄从22岁到56岁不等。年龄在20-30岁、30-40岁、40-50岁和50-60岁之间的男女志愿者人数相等。

２．３．红细胞悬液的制备

在EDTA灯泡中采集的血液样本允许红细胞沉淀。去除上清血浆后，用洗涤液(10 mM Tris pH 7.6, 150 mM NaCl)洗涤3次，分离红细胞，每次1500 rpm, 4℃离心15分钟。

2.4.用PKC激活剂和抑制剂治疗红细胞

红细胞(10⁸所有修饰剂(最终浓度为1.6%，因为它是抑制剂/激活剂处理组的最高浓度)的二甲基亚砜(DMSO)溶剂在37°C孵育20分钟，1PKC经典亚型和新型亚型的M pma激活剂，1米4PMA的PDD生物非活性结构类似物，30 M rottlerin (R30) PKC抑制剂(抑制经典亚型),,和新颖的亚型和在使用的浓度，但不是非典型异构体PKC,或)该治疗组由10个样本组成，用于初步评估PKC在带3聚集和PS外化中的作用，以及评估PKC的膜易位. 确认PKC的作用α在衰老标记物的表达中，在另外10个与DMSO或2.3孵育的样品的红细胞中检测到带3和外显PS的聚集 nmgö6976-PKC特异性抑制剂．用修饰剂处理后，细胞被分离。

2．5．PS外化分析

小份细胞（1×10⁷)用修饰剂处理的对照组和未处理的对照组用annexinV FITC标记，以检测红细胞上的PS暴露。根据制造商的说明，使用annexinV FITC凋亡检测试剂盒进行标记。在Becton Dickinson FACS Calibur流式细胞仪上进行数据采集，并使用Cell Quest软件进行分析。每个样本采集10000个事件。测定每个治疗组门控人群中膜联蛋白V阳性红细胞的百分比，并与阴性（未标记）对照组进行比较，阴性对照组对每个样本进行检测。

2.6. 免疫印迹法红细胞裂解物的制备

在等量低渗溶液(10 mM Tris pH 7.6, 1 mM EDTA, 20g/mL PMSF)，由Dodge等人描述[15].在15000℃下对裂解物进行离心后 每分钟15转 在4°C下，在Sorvall RC-5C离心机的SS-34转子中，将上清液作为细胞溶质部分回收，并使用洗涤缓冲液（10）将含有膜骨架（称为“膜”）的颗粒洗涤三次 mM Tris pH值7.6150 嗯 氯化钠，20 μg / mL PMSF)。膜和胞质馏分在−70°C下保存直至使用。蛋白质的估计采用改良的Lowry方法[16］.

2.7。带3的检测和PKC的移位

红细胞膜蛋白（60 G)和胞质蛋白(120g)经DMSO和修饰剂处理后的细胞，在10% sds -聚丙烯酰胺凝胶上分离，然后电泳转移到PVDF膜上[17］.膜蛋白印迹用抗带3抗体检测。蛋白-抗体复合物进一步与抗小鼠IgG-HRP反应，并采用ECL + western blotting检测系统自动检测hrp标记抗体的结合情况。重复印迹法检测抗体-肌动蛋白，并对记录的信号进行评估，以确定负载相等。对于数量不足以进行重复印迹的样品，用带3抗体染色的印迹进行胶体金染色，以评估蛋白的等载量。Western blot检测DMSO、PMA和4处理的细胞的膜蛋白和胞质蛋白PDD用PKC检测抗体评估PKC易位从胞质溶胶到细胞膜，蛋白-抗体复合物的检测与带3相似。

2.8。PKC活性测定全细胞裂解液的制备

红细胞(1-3 × 10⁹)在1 mL冷细胞裂解缓冲液(50 mM HEPES pH 7.6, 150 mM NaCl, 10%甘油，1% Triton X-100, 1.5 mM MgCl)中裂解₂5 mM EGTA, 1 mM leupeptin, 2 mM PMSF, 10g/mL抑肽酶，10 g/mL胃抑素、1 mM原钒酸钠和1.5 mM氟化钠)。将混合物冷冻15分钟。100000 g旋转30分钟。在贝克曼TL-100超离心机中上清中加入等体积的甘油，置于−70℃保存至使用。

2.9。PKC活动的估计α

根据制造商的说明，使用PKC酶分析系统测定PKC活性-³²在pkc特异性底物中测量p标记的ATP(每次反应在镁缓冲液中45000±20000 cpm)μ五十） （DMSO-和PMA处理的红细胞）与Ca孵育^2＋和脂质(作为混合物试剂盒中的磷脂酰-L-丝氨酸和佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-醋酸盐）。通过液体闪烁计数法测量肽底物中标记ATP的掺入。活性表示为pmol磷酸转移/min/mg蛋白质。

2.10。统计分析

用不同修饰剂处理的红细胞中观察到的PS外化的比较用指定数量样品的平均值±标准误差(SE)表示(n)，并由任何一对进行分析t-如图所示，使用SPSS软件版本15进行测试或Wilcoxon签名等级测试。

3.结果与讨论

我们之前已经证明了PKCα是血红细胞中唯一依赖于dag的pma激活的PKC亚型，而PKC，,是对PMA无反应的非典型亚型[14］.因此显著增加(；在PMA激活PKC后表达外化PS的细胞中(图1(一))可以归因于PKCα．这与pkc诱导PS外化的文献报道一致[18，19]以及它对PKC的归属α［20.].在用4αPDD是PMA的生物非活性结构类似物，表达PS的细胞百分比保持不变。PMA对能带3聚集的影响不明显(图)1 (b)）.

PKC致病作用的结论α我们在抑制实验中观察到PS外化的激活是不同的。优先抑制PKCα通过使用30μM-罗特林抑制PKCα非典型亚型，,被80-100抑制米(21］.红细胞样本() 30M rottlerin，显著的PS外部化(；Wilcoxon符号秩检验)(图1(一))，以及9/10样本中观察到的频带3的聚集(如图所示)1 (b)）.PKC的作用α两种衰老标记物的表达证实了抑制作用(图)1 (c)和1 (d))在2.3 nM Gö 6976处理的红细胞中，可特异性抑制PKC［22].根据报告的数据，这些观察结果具有重要意义[23衰老红细胞PKC活性的丧失。

Liu等人还报告了以异构体非特异性方式激活（PMA）或抑制（rottlerin）PKC的药物产生类似反应的情况[24].我们通过PKC降低10–30%来解释这种对立α活动(图2(一个)在…的面前^2＋和DAG（仅激活PKCα与对照组相比，PMA处理过的细胞中的红细胞中。我们发现活化的PKC易位α(图2 (b))在pma处理的细胞中，已知该细胞通过钙蛋白酶介导的蛋白水解引起它们的下调[25］.在DMSO或4处理的样品中未观察到易位αPDD。在不合成蛋白质的红细胞中，下调会导致可激活蛋白的永久丢失，从而模拟抑制的情况。因此，我们重新定义了PKC缺失导致pma介导的红细胞外化PS表达的机制α由于分子的下调而不是活化而产生的活性。

因此，我们首次报告PKC的缺失由于抑制或下调活性导致两种红细胞衰老标记物的表达，这两种标记物可以介导红细胞吞噬作用。数字3.强调了文献报道的PMA介导的红细胞老化分子事件方面的这一发现提供的见解。

4.结论

因此，PKC亚型在细胞存活和有核细胞凋亡中具有独特的组织特异性作用，也可介导眼睑下垂。而文献报道了PKC/PKC的激活作用α在外化PS的表达中，我们证明了PKC的缺失α抑制或激活相关下调引起的活性不仅可导致外化PS的表达，还可导致聚集带3的表达。因此，该研究揭示了导致两种细胞表面修饰表达的分子事件，这两种修饰可触发红细胞吞噬。

致谢

这项研究得到了塔塔夫人纪念信托基金的资助和ACTREC的额外资金，以完成PKC抑制实验。孟买SIES学院的Namrata Gosar Dedhia女士作为该项目的实习生参与了这项工作。作者感谢ACTREC流式细胞仪设施的Shymal Vetale小姐和Rekha Gaur女士在流式细胞仪实验和分析中的帮助。

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