刚果镰状细胞贫血患者的胎儿血红蛋白、含胎儿血红蛋白的红细胞和血液学特征

摘要

高HbF水平和F细胞与镰状细胞病(SCD)发病率和死亡率的降低相关。本研究旨在检测刚果镰状细胞贫血(SCA)患者HbF和F细胞水平，以确定其对SCD表达的影响。人口和方法．采用标准HPLC法测定89例SCA患者(平均年龄11.4岁)的HbF水平。对第二组SCA患者(，平均年龄8.9岁)，并与对照组(，平均年龄5岁)。F细胞通过细胞荧光系统(MoAb-HbF-FITC;削减为0.5%)。结果．HbF的平均值为7.2%5.0，分布不均，大多数患者(76%)HbF < 8%。SCA患者和对照组的f细胞平均值为5.4%7.6(中位数:2.19%;范围0 - 30,3%)和0.5%1.6(中位数0.0，范围0-5.18)。伴有F细胞>4.5%的SCA患者出现较轻的疼痛危象和较高的网织红细胞百分比。结论．刚果SCA患者表现出与SCD严重程度相关的低水平HbF和f细胞。

1.介绍

胎儿血红蛋白(HbF, a2.2)是导致镰状细胞性贫血(SCA)表型异质性的主要因素。一个主要的改善因素是产生胎儿血红蛋白的内在能力;在SCA患者中，升高的水平与发病率和死亡率的降低相关[1- - - - - -3.］.

在正常成人中，HbF在红细胞中呈不均匀分布，范围从0.1到7%不等。在产生较高HbF的红细胞(称为F细胞)中，HbF升高(约为细胞Hb的25%)，并由基因决定[2，4，5］.

在三个主要位点上的遗传变异——11p染色体上的HBB簇、6q染色体上的HBS1L-MYB区和2染色体上的BCL11A区——已经被证明影响HbF水平和疾病严重程度β地中海贫血和SCA。考虑到这些位点，HbF水平仍存在较大的残留差异，提示其他数量性状位点(QTL)调节HBG表达的重要性[4，6］.

SCA患者的总Hb和HbF水平不同βS单倍型:阿拉伯-印度和塞内加尔单倍型患者的值更大，班图或中非单倍型患者的值更小[2，4，6- - - - - -8］.

镰状细胞病(SCD)在撒哈拉以南非洲地区流行率很高，大多数受影响患者居住在那里。刚果民主共和国(DRC)的基因流行率约为25%，约1.7%的新生儿受到影响(每年5万名新生儿)[9］.

刚果患者SCA的表达表现为高死亡率和并发症的严重形式[10］.

据我们所知，没有关于生活在DRC的SCA患者中HbF和F细胞的具体数据报道。因此，我们在此对两组SCA患者中的HbF和F细胞进行初步分析，并与其他血液学参数和临床数据进行相关性分析。

2.人口和方法

所有患者均为SS纯合子，在刚果民主共和国进行了全面的镰状细胞治疗计划，并定期随访。

一项首次量化Lubumbashi稳定SCA患者HbF的研究()和金沙萨()，共89例(男34例，女48例;平均年龄11.4岁±5.4岁)。无患者接受羟脲治疗。

第二项研究涉及42人 SCA患者（23F，24 M、 平均年龄为8.8岁±5.1岁），对照组为47例非SCA患者（26 F、 二十一, M、 在这项研究中，我们评估了F细胞的数量，并将结果与血液学参数和临床数据进行了比较。

使用标准血红蛋白电泳技术(醋酸盐电泳或等电聚焦- ief)结合Itano溶解度试验确定SCA诊断。采用高效液相色谱法测定HbF的含量。

使用先前描述的流式细胞术程序评估HbF表达[11，12略作修改。简而言之，将20微升全血用1 mL冰冻的0.05%戊二醛固定在pH 7.4的PBS漩涡中15秒(s)，然后在室温(RT)下孵育10分钟。用PBS洗涤细胞两次，用0.5 mL冰点0.1% Triton X-100 (Sigma, Milan)在0.1%的PBS (BSA-PBS)牛血清白蛋白中涡旋渗透细胞15 s，并在RT下孵育5分钟。然后用0.1% BSA-PBS洗涤细胞一次，并悬浮在0.5 mL 0.1% BSA-PBS中。

10微升细胞悬液与20微升混合μ在0.1%牛血清白蛋白-PBS和70%牛血清白蛋白-PBS中加入1/5稀释MoAb HbF FITC（IQ产品，米兰） μL 0.1% BSA-PBS，室温避光孵育15分钟。用相应亚类的无关小鼠抗体作为阴性对照，测定背景荧光。用0.1% BSA-PBS洗涤细胞一次，立即用流式细胞仪测量(如下所述)。

流式细胞仪分析显示每个样本中F+细胞占红细胞总数的百分比。阳性切断点设定在同型对照染色细胞阴性群体的0.5%以上。

HbF表达也采用Kolmogorov-Smirnov统计检验(-value)，能够客观准确地识别荧光强度的微小差异[13］.和样品被认为是消极的，而那些带有被认为是积极的。

改良的HbF表达评估技术:考虑到之前鉴定F+细胞程序的复杂性，我们采用了第二次流式细胞术来评估F+细胞。这个方法(通常用于描述其它细胞参数,例如耐多药患者急性白血病)的影响使我们测试样品更方便,使用更少和更简单的步骤,和一个精确的识别红细胞的人口流动仪点情节,对于一个特定的分析。此外，这种技术提高了同时分析更多样本的能力。

20微升全血固定(Fix and Perm渗透试剂盒;Caltag实验室)，100个μL在室温(RT)下，避光，静置15分钟;然后用PBS洗涤一次，再用100孵育μL中B和4μMoAb-HbF-FITC在室温下，在黑暗中静置30分钟。最后用PBS冲洗一次，立即用流式细胞仪检测。进行流式细胞分析时考虑的参数与前面描述的技术相同[11，12］.

流仪结果使用FACScan流式细胞仪（Becton Dickinson）在488℃下进行 检测绿色（MoAb HbF FITC）荧光的nm。使用CellQuest软件（Becton Dickinson）进行数据采集和分析。我们测量了50000个事件。红细胞区域通过前向散射信号（FSC）与侧向散射信号（SSC）进行选通。后者使用对数标度（log SSC）进行测量。

将血液学参数（血细胞计数和HbF水平）与非洲SCA患者的其他报告进行比较[14- - - - - -17］.

根据《赫尔辛基宣言》，这些研究由参与机构的地方种族委员会、罗马生物医学学院和CEFA/ Monkole医院批准。

统计分析采用SPSS软件系统(版本12，芝加哥)进行。结果以平均值表示，中位数为标准差(SD)。由学生进行平均数比较分析t-检验，用pearson检验的相关性，用卡方检验或fisher精确检验的分类变量之间的比较(适当时)。

住宅表达式(-值)和F+细胞表示为二分变量(阳性和阴性)。数据分析使用双侧学生的t-检验通过两种不同的分析参数和两种流式细胞技术的平均值所获得的结果之间的相关性，而Mann-WhitneyU-检验测量阳性组与对照组之间观察到的差异。

值被认为具有统计学意义．

3.结果

３．１．病人的人口

在第一项89例SCA患者的研究中，平均HbF%为（中位数5.9；范围1-27.5%），卢本巴希组和金沙萨组分别为7%和7.4%(）.女性HbF值(7.4%，平均年龄10.4岁)高于男性(6.9%，平均年龄9.2岁)，但差异无统计学意义(Mann Whitney检验卡方= 0.018，自由度= 1，= NS)。在3岁以下的儿童中观察到较高的值，但在不同年龄组之间没有观察到统计学差异。

HbF发生率分布不均，主要组(66/89或74%)HbF <8%，其他两组分别为9-13%和14-17%。在全球范围内，69/89的病例中HbF水平低于10%(77.5%)，且差异很大;即使在数值的对数变换后(未显示)，分布模式也不是正态的(图1）.

在第二项研究中，使用第一种标准的流式细胞术计数含有HbF (F细胞)的红细胞，结果是平均%。42份SCD标本中F+细胞的SD值(中位数:2.19%;范围0.00 - -30.3%)。的意思是价值。SD为0.21±0.007(中位数:0.33;范围0.07 - -0.57)。在47个对照组中，F+细胞的平均%±SD为(中值:0;范围0-5.18%)，平均值-值±SD为0.024±0.034（中位数：0；范围0-0.15）（图2）.

F+细胞%与-值对整个人群具有高度显著性（).SCD患者和对照组的F+细胞百分比和-value也非常显著(对于F+单元格%和值)。

采用Fix&Perm流式细胞仪技术对样本进行评估，结果显示F+细胞的平均%SD为8.67%，13.48（中位数：4.63；范围0-57.75%），而价值。SD为0.19。0.17(中值:0.15;范围0 - 0.7)。

比较两种流式细胞术，F+细胞值有很强的相关性(；)和值参数(；）.SCA患者中40/42(95%)的值高于0.5%的临界值，而对照组中只有12/47(25.5%)的值高于临界值。

% F细胞的种群分布是不均匀的，即使对数值进行对数变换后也呈现非正态分布(图)3.）.年龄<12岁的患者比年龄较大的患者表现出更高的数值:组1和组2的平均值分别为3.7和4.7，而组3的平均值为1.91）.

３．２．%F细胞与血液学参数及临床问题的比较

我们发现戊二醛法细胞计数系统的结果与临床和生物学数据之间没有显著的相关性;但在Fix & Perm方法中，F细胞率>4.5%的患者血管阻塞危象数量显著减少()，而网织红细胞数量显著升高(）.

我们没有观察到不同年龄组的血液学参数(Hb, MCV, MCH和MCHC)之间的显著差异，尽管> - 18岁儿童的RDW值较高(见表)1）.

我们患者的血液学参数与其他非洲SCA患者的血液学参数的比较见表2．

4.讨论

血液学特征和SCA的临床严重程度是可变的，并受环境和遗传因素的影响，包括存在α-地中海贫血、Hb F水平的变化以及与β球蛋白基因(14］.Bantu或CAR单倍型被认为是与临床严重SCD和器官损害相关的主要危险因素[7，18，19］.大多数生活在中非和刚果民主共和国的SCA患者携带CAR单倍型[20］.

HbF在红细胞镰状化和SCD临床严重程度中的保护作用是明显的。HbF水平已成为镰状细胞疼痛和死亡率的重要预后因素;%HbF > 10%已被建议作为降低临床严重程度的阈值水平[5，6，19，21，22］.

关于携带CAR单倍型的SCA患者HbF水平的不同研究报告的水平值从2%到10.8%不等，但通常小于10%[14，18，19，23，24］.迄今为止，在生活在刚果民主共和国的刚果SCA患者中没有HbF水平值的报告。在我们的研究中观察到的7.2% HbF的平均值证实了CAR单倍型患者的HbF水平小于10%，这是允许红细胞镰状化保护作用的最低水平[2，19］.尽管最近的研究证实，由于X-linked QTL (Quantitative Trait locus)的存在，成年女性的HbF和F Cells值高于男性，但我们没有发现患者的Hb水平与性别或年龄相关的显著差异[4，6］.Mouele [16在邻国刚果布拉柴维尔也报告了类似的数据。

Nagel等人[19提示5岁以上SCA患者HbF水平依赖于位置为- 158g的C-T突变γG的启动子γ珠蛋白基因(被称为Xmn I-Gγ(网站)23］.他们还发现，G型肝炎发生率组中HbF的平均水平分别为6.4%和12.4%γ< 38%和Gγ分别> 38%。缺失的存在或缺失并不会改变这些观察结果。CAR单倍型患者的G值较低γ珠蛋白基因表达与其他非洲单倍型（塞内加尔型和贝宁型）的比较[19]这种多态性与红细胞生成应激和继发于无效红细胞生成或溶血过程的红细胞质量增加以及含有HbF的红细胞前体的优先存活有关，如在β-地中海贫血和镰状细胞性贫血[4，6，24］.

研究表明，染色体11p上的三个主要位点HBB簇、染色体6q上的HBS1L-MYB区域和染色体2p上的BCL11A的遗传变异会影响患者的HbF水平和疾病严重程度β地中海贫血症及SCA [4].最近的一项研究表明，所有三个主要HbF基因座对坦桑尼亚SCA患者都有显著影响；2号染色体上BCL11A基因座的相关性最强[25］.

我们认为，在我们的研究中观察到的值可能是由于Gγ班图单倍型患者珠蛋白基因表达[19］.对比其他非洲SCA患者报道的HbF值，Omoti描述的尼日利亚患者HbF值较低，分别为2.17±1.81%和4.7±2.9% [15]还有法鲁西和奥拉通吉[26]，分别是[16报告的价值%在邻国刚果共和国的SCA患者中。

在非洲SCA患者中观察到的差异可能是由于不同年龄组人群比例、地中海贫血基因的共遗传特征，或控制F细胞数量和患者临床状态的其他遗传成分[21，24］.由于HbF在SCA患者中已被证明在4-6年时是稳定的[6，19]， > ~ 4岁稳定状态儿童HbF值比较。

不同人群中HbF和F细胞的水平差异很大；这种变异性并非源于单个基因座，HbF持续性被视为一种数量性状（QT），取决于多个基因与一个小的环境成分一起表达[4］.

在正常成人中，F细胞百分比在0.5%到7%之间变化，而在SCA患者中，F细胞百分比的范围更广[21].我们没有刚果SCA患者的局部参考值，但40/42（95%）患者和12/47（25.5%）对照组显示的值高于临界点（0.5%）。一些SCA患者和对照组显示的值较高（图2)可能是由于如其他研究所述，胎儿血红蛋白(HPFH)伴随遗传持久性[21］.在我们人群中观察到的% HbF和F细胞分布广泛，可能是由于本研究样本量小，也可能是由于遗传因素(α-地中海贫血和QTL性状)和环境因素(疟疾，感染)。据报道，大多数生活在刚果民主共和国的SCA患者伴有慢性炎症状态[27会导致溶血状态。正如刚果SCA患者高网织红细胞数量所表达的那样，溶血可能在疟疾和其他感染性并发症引起的“红细胞生成应激”中发挥作用[28］.需要进一步的研究来评估这一假设。

在其他地方，F细胞率和%HbF以及一些红细胞指数(如MCV和Hb)之间有显著的相关性报道[5，21]在我们的研究中，我们发现除了网织红细胞百分比外，F细胞与其他血液学参数之间没有显著相关性。

虽然对来自不同非洲国家的SCA患者的血液学参数进行比较显示出差异，但从全球来看，SCA非洲患者的Hb值(<8 g/L)和%HbF值(<10)较低。这些数据可以解释携带非洲基因的SCD患者表型的严重程度β^年代单体型。

尽管HbF %和F细胞率的个体差异很大，但这两个参数将被用作监测对羟脲(一种降低SCD严重程度的药物)等药物的反应的工具[4，6，21］.

5.结论

尽管本研究存在一些局限性，但我们提供了新的数据，突出了刚果患者HbF水平低和SCA临床严重程度，可用于比较不同地理区域和遗传背景的非洲患者。此外，两种流式细胞技术用于F+细胞定量的比较结果具有显著的统计学相关性。为了证实其可靠性，我们应该进一步使用更简单、更快的Fix & Perm技术来测量SCA中F+细胞的数量。此外，对撒哈拉以南不同SCA患者的全基因组研究将有助于理解HbF和F细胞在镰状细胞病表型和复杂的生理病理过程中的复杂作用。

利益冲突

两位作者没有利益冲突。

致谢

提交人感谢Paul Telfer(英国伦敦玛丽女王大学伦敦皇家医院)对文章进行了修订，感谢Lukusa David先生提供了统计方面的协助，感谢Monkole医院中心实验室的技术人员提供了帮助。

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