补充精氨酸治疗成人镰状细胞贫血的双盲临床试验

摘要

背景．镰状细胞贫血症(SCA)是巴西最普遍的单基因疾病。在SCA中，形成血红蛋白S (HbS)，它改变红细胞的形态。发生血管内溶血，在这一过程中，游离Hb和自由基降解一氧化氮(NO)并释放精氨酸酶，从而降低精氨酸水平。因为精氨酸是NO形成的底物，这种减少导致NO(血管扩张剂)合成的减少。SCA治疗使用羟基脲(HU)维持高胎儿血红蛋白(HbF)水平并降低HbS以避免溶血发作。客观的．目的分析l -精氨酸辅助治疗SCA患者的疗效。设置．国家血液中心Ceará，巴西。方法．这是一项随机双盲临床研究，对象为在Ceará州血液中心持续使用HU的SCA成人患者。该临床研究纳入了25例HU + l -精氨酸(500 mg)患者和25例HU +安慰剂患者。治疗进行了四个多月。进行了实验室检测以确定以下水平:(1)全血计数;(2)亚硝酸盐+硝酸盐;(3)住宅;和(4)网织红细胞。临床实验由血液学家进行。主要观察指标为亚硝酸盐和疼痛。结果．统计分析显示，研究组NO水平增加，疼痛频率也减少，疼痛频率按天、周和月进行测量。安慰剂+ HU组的亚硝酸盐+硝酸盐水平在不同时间内无变化(38.27±17.27 mg/L, 39.49±12.84 mg/L, 34.45±11.25 mg/L, 39.49±12.84 mg/L)，p>0.05)，但在补充L-精氨酸和HU的患者中，M0和M4之间亚硝酸盐+硝酸盐水平显著增加(36.55±20.23 mg/L vs 48.64±20.63 mg/L，p=0.001)、M2和M4(35.71±15.11 mg/L vs 48.64±20.63 mg/L，p< 0.001)。需要注意的是,亚硝酸盐的增加硝酸+水平发生只在第四个月的随访的患者在治疗组,表明至少4个月的补充精氨酸是需要显示这些代谢物在血清的增加。结论．使用l -精氨酸作为镰状细胞贫血的辅助治疗可能作为缓解疼痛的潜在工具，从而改善患者的生活。

1.介绍

镰状细胞贫血(SCA)是一种遗传性疾病引起的β球蛋白基因的点突变的缬氨酸谷氨酸所取代,导致一个新的血红蛋白的合成,血红蛋白S (HbS),形成聚合物在血红细胞低氧张力。它还使膜更加坚硬，从而改变膜的形态和功能[1］．在这种情况下，氧气的运输受到损害，红细胞在内皮壁上沉积，可导致慢性炎症、微循环困难、疼痛、住院和中风[2，3.］．

精氨酸是形成一氧化氮(NO)的必要化合物，一氧化氮是一种有效的血管扩张剂。在SCA患者中发现其水平降低，这可能导致微循环损伤、复发性疼痛和住院。研究表明，随着l -精氨酸可用性的增加，NO的合成也会增加，从而改善微循环和患者的临床状况[2- - - - - -5］．

这是因为l -精氨酸是产生NO的底物。在溶血过程中，精氨酸酶，一种代谢l -精氨酸并有助于降低SCA患者NO浓度的酶被释放。其他研究表明NO是鸟苷酸环化酶的辅助因子，该酶负责鸟苷三磷酸(GTP)转化为环磷酸鸟苷一磷酸(cGMP)。cGMP负责平滑肌和血管肌肉的松弛和血管舒张[6- - - - - -8］．

目前，为了减少溶血发作、疼痛和血管阻塞，SCA治疗使用羟基脲(HU)，它用于维持高胎儿血红蛋白(HbF)水平，从而降低血红蛋白S (HbS)浓度。与羟脲相关的其他积极作用可能归因于一氧化氮。HU生成一氧化氮有多种机制，如过氧化氢酶介导途径、脲酶依赖的形成和辣根过氧化物酶催化的NO生成。最近，HU诱导eNOS (NO内皮合成酶)在内皮细胞中产生NO的作用也得到了证实[9- - - - - -12］．事实上，这种药物已被证明可以有效缓解镰状细胞贫血患者的疼痛，而由羟基脲衍生的NO形成的血管扩张可能是HU可以使这些患者受益的另一个机制[13］．因此，研究补充l -精氨酸是否能增强HU的作用变得很有必要，因为HU作为NO产生的底物起着重要的作用。

在此背景下，本研究的目的是分析使用HU + l -精氨酸作为辅助治疗的患者与使用HU +安慰剂的患者相比，一氧化氮水平(通过亚硝酸盐+硝酸盐水平测量)是否增加。

2.材料和方法

该临床试验是一项随机、双盲和安慰剂对照研究。采用GraphPad棱镜程序将患者随机分组。在Ceará州血液中心(hemce)随访期间，50名临床和分子诊断为SCA的成年男女患者参与了这项研究。根据Ballas(2012)标准，纳入标准包括使用HU和基线数据的成年患者:研究前四周内无疼痛发作和/或并发疾病，如感染和炎症;在研究前的最后2-3天没有住院;研究前4个月没有输血[14］．排除标准为没有SCA的分子诊断、怀孕、存在肾脏疾病、未使用HU以及过去6个月内有输血史。

参与研究的患者定期在血红蛋白病诊所接受羟基脲治疗。我们利用他们回来的那一刻执行指令和试验。

在一项随机、双盲试验中，只有主要作者有关于组和各自患者的信息。因此，在出资声明/致谢中没有其他名字。照顾病人的医生是这篇文章的合著者。

患者被分为两组:(1)第一组由25名受试者组成，他们使用胡+ l -精氨酸，剂量为500 mg/天(2)第二组由25名受试者组成，服用胡+安慰剂(淀粉)。HU剂量范围从500到1500毫克/天，在试验期间没有进行修改。在特定时间点获得生物样本:(1)在补充安慰剂或l -精氨酸(M0)前;(2)安慰剂或补充l -精氨酸(M2) 2个月后;(3)安慰剂或补充l -精氨酸(M4) 4个月后。精氨酸的剂量是根据同一组进行的早期研究确定的[5］．试验时间由Ceará州血液中心的临床工作人员确定。由于该机构的治疗方案，不可能使用只使用精氨酸的组。

结果测量是通过亚硝酸盐+硝酸盐水平测量一氧化氮剂量，使用罗氏亚硝酸盐/硝酸盐比色测定试剂盒;用HPLC测定胎儿血红蛋白水平;网织红细胞和全血细胞计数。为了测量疼痛频率，使用时间量表对患者进行分层。该量表将患者分为5个疼痛类别:从不(无疼痛)、每天、每周、每月和每年。就像疼痛评估一样，我们创建了一个量表来测量住院的频率。将患者分为:未住院、5年前住院、3年前住院、今年住院。患者的其他临床和历史资料来自医疗记录。

使用IBM spss21 Statistics进行统计分析。为分析数据的正态性，采用夏皮罗-威尔克检验。对于定量变量的分析，采用Mann-Whitney检验或双向重复测量方差分析。对于分类变量的分析，采用Pearson卡方检验或Fisher检验。的值p<0.05为显著性。

该研究得到了美国联邦大学伦理与研究委员会(Ethics and Research Committee of The Federal University of Ceará)的批准，编号为1.292.517，在巴西临床试验注册中心(Brazilian Registry of Clinical Trials)注册，编号为U1111-1201-6937。患者被要求签署一份知情同意书。

3.结果与讨论

3．1.病人

纳入研究的患者平均年龄为28岁，安慰剂组和治疗组的平均年龄相似。患者以女性为主(52%)，男女比例约为1.1:1。安慰剂组和研究组患者的性别和年龄相匹配。此外，两组间HU的临床表现及治疗时间无差异，说明两组间基线特征相似(见表)1）.试验前HU使用时间2 ~ 180个月，中位数为48个月。在4个月的试验中没有观察到不良反应。根据HU剂量，血清中亚硝酸盐/硝酸盐水平无显著差异(p= 0.643)。

3．2．血液学的参数

在有血液学数据的患者中，安慰剂组和研究组的患者之间没有观察到显著差异，表明与接受安慰剂的患者相比，补充l -精氨酸对评估的血液学参数没有影响(见表)2）.

3．3.亚硝酸盐和硝酸盐的测量及疼痛频率分析

安慰剂+ HU组的亚硝酸盐+硝酸盐水平在3次评价之间没有变化(38.27±17.27 mg/L, 39.49±12.84 mg/L, 34.45±11.25 mg/L, 39.49±12.84 mg/L, 34.45±11.25 mg/L)。p>0.05)，表明安慰剂对亚硝酸盐+硝酸盐水平没有影响。补充L-精氨酸和HU的患者在M0和M4之间亚硝酸盐+硝酸盐水平显著增加(36.55±20.23 mg/L vs 48.64±20.63 mg/L)。p=0.001)、M2和M4(35.71±15.11 mg/L vs 48.64±20.63 mg/L，p< 0.001)(图1）.需要注意的是,亚硝酸盐和硝酸盐含量的增加发生只在第四个月的随访的患者在治疗组,表明至少4个月的补充精氨酸是需要显示这些代谢物在血清的增加。

卡方检验显示，与安慰剂组相比，研究组的疼痛频率有所减少(p= 0.027)。表格3.M4患者疼痛频率降低，表明每天出现疼痛的患者开始每周或每月出现疼痛。有趣的是，疼痛频率的变化与亚硝酸盐和硝酸盐水平的增加相一致，这表明这两个变量之间可能存在联系。

据我们所知，这是首个安慰剂对照、双盲、随机临床试验，在接受基础HU的经典治疗的SCA成年患者中，测试口服l -精氨酸补充4个月的治疗潜力。我们的结果表明，这种关联可能对镰状细胞贫血患者有益，因为在使用HU + l -精氨酸的患者中观察到疼痛频率的降低。这种减少依赖于治疗时间，从血清亚硝酸盐和硝酸盐水平观察，表明疼痛频率和这些代谢物的血清水平之间有很强的关系。

亚硝酸盐和硝酸盐是NO代谢的稳定产物，可用于定量。它们存在于血样和尿样中。亚硝酸盐和硝酸盐的测定被认为是评价体内NO合成最适当和最实用的方法。本研究采用的比色法基于Griess反应，即通过分光光度法测定NO的稳定分解产物，间接测定NO的含量，和［15］．

不可能包括未接受HU治疗的组，因为进行治疗的医院是在治疗伴有HU的SCA患者。然而，在同一城市的另一家医院进行的一项早期研究中，有可能确定患者的平均亚硝酸盐/硝酸盐水平为25.63 mg/L，远低于我们的研究指标[16］．

本课题组前期研究表明，HU联合l -精氨酸患者亚硝酸盐水平升高;然而，我们没有评估l -精氨酸对这些患者疼痛频率的影响[5］．Lopez等人(1996)研究表明一氧化氮代谢产物水平与伴有血管阻塞危象的SCA患者的疼痛评分呈负相关，提示NO在疼痛中的作用[17］．另一项使用吸入NO的研究也显示吸入NO的SCA患者的疼痛评分降低，加强了他们在缓解疼痛中的作用[18］．2013年，Morris等人(2013)在一项随机安慰剂对照试验中使用口服或静脉注射l -精氨酸盐酸盐作为NO来源，证明SCA患儿阿片类药物使用减少了54%。在同一项试验中，研究人员观察到，与安慰剂组相比，实验组儿童的疼痛评分有所下降[19］．Cox等人(2018)表明，与基线时的相同测量相比，儿童中精氨酸和瓜氨酸治疗在内皮功能测量方面确实显示出益处[20.］．

我们的结果与之前发表的数据一致，表明使用l -精氨酸可以减少镰状细胞贫血患者疼痛的频率，表明它是改善这些患者生活质量的潜在工具。这可能部分是由于血清中亚硝酸盐和硝酸盐的含量增加，这反映了NO的增加，而NO是SCA患者中已知缺乏的一种与疼痛相关的血管扩张剂[16，21］．

尽管很少有研究使用l -精氨酸作为SCA中NO的来源，但许多研究已经表明NO的好处。例如,据报道,没有可以从精氨酸产生的血管内皮,能够调节正常血管语气和抑制血小板活化,止血剂激活,VCAM-1等和粘附分子的表达,这是一个标记的内皮细胞激活与绑定α4β镰状红细胞中存在的粘附分子[22，23］．镰状红细胞与内皮细胞的黏附反过来也与血管阻塞事件的开始和传播有关，这在之前的研究中已经证实，该研究使用了体外黏附试验或大鼠体外灌注模型[24］．此外，NO已被证明会降低SCA中中性粒细胞对血管内皮的粘附特性，这是血管阻塞危机发展的一个重要事件[25，26］．

此外，Villagra等人(2007)也报道了西地那非，一种磷酸二酯酶5抑制剂，已知可增强no介导的信号，能够减少血小板激活，由于血小板活化可能在镰状红细胞粘附到血管内皮细胞中发挥重要作用，因此支持基于no的治疗方法的作用[27］．有趣的是，在稳定状态的SCA患者中，发现血小板活化水平升高，而在血管阻塞危机期间，这种升高甚至更大[26］．综上所述，这些报告表明，来源无关的NO可以通过作用于参与血管阻塞危象发生的几个细胞成分而使镰状细胞病患者受益。在这里，我们使用l -精氨酸作为NO的来源;l -精氨酸是一种安全有效的氨基酸，据报道有镇痛作用，可能是SCA患者治疗的有益补充[19］．

最近的研究表明，NO的分解产物，亚硝酸盐和硝酸盐，可以在体内循环产生NO，这是这种气体的另一种来源。这一过程主要发生在缺氧条件下，依赖氧的NOS酶的活性受到抑制[28］．在这种背景下,我们推测,精氨酸可以补充,除了作为衬底NOS-dependent通路没有生产,增加亚硝酸盐和硝酸盐的供应函数作为一个存储池,可在低氧条件紧张,没有生产例如血管阻塞危象时发生的情况。一氧化氮水平的升高不仅可以预防血管阻塞危象，而且可以减弱甚至解决它们。值得注意的是，在我们的研究中，接受HU + l -精氨酸补充的患者没有出现疾病并发症。

4.结论

总之，我们的数据表明，NO代谢产物水平的增加与SCA患者疼痛频率的降低之间存在密切关系，这支持在这些患者的治疗中使用l -精氨酸作为辅助剂。这些数据首次证明了成年SCA患者的这种关系;然而，需要更多的研究和更长的随访，以评估长期补充l -精氨酸的安全性和有效性。

数据可用性

这些数据可在巴西临床试验注册中心的网站上获得www.ensaiosclinicos.gov.br rg / RBR-2t56nz /．

的利益冲突

我们声明没有利益冲突。

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