骨髓增生异常综合征患者外周血中调节性T细胞和FOXP3亚型表达谱gydF4y2Ba

摘要gydF4y2Ba

我们研究了骨髓增生异常综合征患者外周血中调节性T细胞的频率和FOXP3亚型的表达水平，发现在疾病的各个阶段调节性T细胞都显著减少。同时，在未治疗的患者中，我们观察到FOXP3亚型表达的变化（p根据已知的缺乏外显子2的FOXP3分子可能具有更高的功能活性的信息，我们还假设我们的发现可以解释这种疾病中自身免疫性疾病的高风险。gydF4y2Ba

1.介绍gydF4y2Ba

骨髓增生异常综合征（MDS）是一组由克隆性干细胞疾病引起的异质性疾病，其特异性表现为骨髓细胞数量正常或增加的无效造血导致的外周血细胞减少。MDS的临床表现、病程和结局高度多样，中位生存期从6个月到5年不等[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．MDS一直通过造血祖细胞的克隆扩增来观察，在大约30-40%的患者中有进一步转化为急性髓系白血病(AML)的风险[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．尽管存在基于细胞学和细胞遗传学实验室参数具有明确预后结构的预测量表，但疾病的过程和白血病浸润的进展往往是非常不可预测的。而急性白血病的预测问题又使得选择治疗策略变得困难。旨在研究疾病进展风险分层新方法的临床研究数量每年都在增加。gydF4y2Ba

考虑到免疫系统在MDS的发病机制中发挥着积极的作用，我们可以假设一些免疫学参数，例如调节性T细胞(Treg)的数量，可以作为预后的标准。Treg在MDS发病机制中的参与在一定程度上可以解释该疾病与两种自身免疫性疾病的关联[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]及肿瘤转化[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]，认为Treg含量低、功能下降，对过度免疫反应的抑制作用弱，而Treg含量高、功能增加，则会破坏对肿瘤生长的免疫监测。gydF4y2Ba

大多数已进行的研究都将Treg频率增加与MDS预后不良联系在一起[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．尽管在这些研究了类似的结论，对调节性T细胞在MDS的数量而获得的数据是相当矛盾，可能涉及在流式细胞仪分析中使用不同的样品制备的协议和门控策略[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．在年龄匹配的健康供体中，Treg频率的差异间接证实了这一假设。gydF4y2Ba

也有人尝试使用功能性Treg特征作为MDS的预后标准。Mailloux等人已经证明，具有效应记忆t细胞表型的Treg数量的增加与MDS的不良预后相关，如转化为急性髓系白血病和低存活率[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．然而，获得的结果可能不是预后的标准，而是对疾病特定阶段的反映。gydF4y2Ba

在将功能性Treg特征作为MDS的预后标准之前，必须考虑到Treg分化和功能的主要调节因子是FOXP3转录因子[gydF4y2Ba10.gydF4y2Ba］．因此，其表达特征应该对Treg功能有显著影响。在对FOXP3分子结构的研究中，已经确定人类的选择性剪接会导致FOXP3的四种mRNA变异和四种亚型:全长分子(FOXP3- fl);外显子2缺失(FOXP3Δ2);外显子7缺失(FOXP3Δ7);同时缺失外显子2和7 (FOXP3Δ2Δ7) [gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba13.gydF4y2Ba］．在最近发表的检讨中[gydF4y2Ba14.gydF4y2Ba]Mailer R.详细分析了FOXP3选择性剪接的生物学和FOXP3亚型的具体功能。被删除的外显子编码的区域的功能意义是不同的。简言之，外显子2编码负责结合ROR转录因子的FOXP3结构域gydF4y2BaαgydF4y2Ba和RORgydF4y2BaγgydF4y2BaŤ家庭[gydF4y2Ba15.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16.gydF4y2Ba决定了免疫反应中Th17的前炎症极化;外显子7编码负责FOXP3二聚的序列，它的缺失破坏了Treg抑制基因的功能[gydF4y2Ba13.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17.gydF4y2Ba］．FOXP3分子缺乏外显子2和7产物的一个基本特征是它们优先在细胞核内定位:Magg等人已经表明，它们失去位于外显子1/2和6/7编码区域的核输出信号(NES)序列[gydF4y2Ba18.gydF4y2Ba］．本组研究也证实FOXP3主要在幼稚CD4活化后的细胞质中表达gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD25gydF4y2Ba^-gydF4y2BaT细胞，与之相反，CD4细胞主要定位于细胞核gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD25gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba调节性T细胞[gydF4y2Ba18.gydF4y2Ba］．FOXP3在细胞核内的定位对于其作为转录激活和抑制因子的功能至关重要。因此，我们可以假设FOXP3Δ2具有抑制功能，主要位于细胞核，是决定Treg功能活性的主要亚型。gydF4y2Ba

考虑到Treg的数量、它们在MDS发病机制中的潜在重要作用以及表达的FOXP3亚型之间的功能差异，我们决定不仅评估该疾病中Treg的数量和百分比，还评估MDS患者在不同疾病阶段中FOXP3亚型表达水平。gydF4y2Ba

2.材料和方法gydF4y2Ba

76名MDS患者被纳入研究（表1）gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．他们被分为三组:原发性(MDS-原发性)、早期(E-MDS)和晚期(L-MDS)。治疗前(任何疾病阶段)的患者为mds原发组。E-MDS组和L-MDS组由治疗前的患者组成。根据国际预后评分系统(IPSS)进行分组。使用细胞百分比、核型和细胞减少数，该评分系统可靠地估计生存和白血病转化的风险[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．IPSS中，细胞减少定义为血红蛋白< 10 g/dL，中性粒细胞绝对计数< 1.83 x10gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba/L，血小板计数< 100x10gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba/ L。细胞遗传学分类如下:好(正常，-Y, del (20q)， del (5q))，差(7号染色体异常，复合物定义为3个或更多异常)，中间(所有其他异常)。根据IPSS评分小于或等于1.0的预处理患者(低危组和中危组)组成E-MDS组。根据IPSS评分1.5及以上的预处理患者(中-2及高危组)分组为L-MDS组。mds原发组包括21例患者(14例女性，7例男性)，年龄中位数为72.0(64-76.5)岁。E-MDS组27例，女性15例，男性12例，年龄中位数为71.5(64-76)岁。L-MDS组28例，女性12例，男性16例，年龄中位数为68.5(63-73)岁。26名年龄匹配的健康供体(15名女性，11名男性)，年龄中位数为72(48-79)岁，作为年龄对照组(表)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．因此，患者特征在年龄和性别上相似，与年龄对照组相符。E-MDS和L-MDS组患者均依赖红细胞输血。每月输血量为2-3 ~ 5个红细胞单位。患者接受红细胞输血4个月至5年。本研究是在低甲基化或细胞抑制治疗处方前进行的，即使是在L-MDS组。gydF4y2Ba


团体gydF4y2Ba	MDS-primary,gydF4y2Ba	E-MDS,gydF4y2Ba	L-MDS,gydF4y2Ba	年龄控制,gydF4y2Ba
团体gydF4y2Ba	ngydF4y2Ba= 21gydF4y2Ba	ngydF4y2Ba= 27gydF4y2Ba	ngydF4y2Ba= 28gydF4y2Ba	ngydF4y2Ba= 26gydF4y2Ba

年龄，年gydF4y2Ba	72 (64 - 76.5)gydF4y2Ba	71.5（64-76）gydF4y2Ba	68.5 (63 - 73)gydF4y2Ba	72（48-79）gydF4y2Ba
pgydF4y2Ba	0.53gydF4y2Ba	0.67gydF4y2Ba	0.96gydF4y2Ba	-gydF4y2Ba

性gydF4y2Ba
男性gydF4y2Ba	7 (33.3%)gydF4y2Ba	12 (44.4%)gydF4y2Ba	16 (57.1%)gydF4y2Ba	11（42.3％）gydF4y2Ba
女gydF4y2Ba	14 (66.7%)gydF4y2Ba	15 (55.6%)gydF4y2Ba	12（42.9％）gydF4y2Ba	15 (57.7%)gydF4y2Ba
pgydF4y2Ba	0．56gydF4y2Ba	1gydF4y2Ba	0．41gydF4y2Ba	-gydF4y2Ba

注意:gydF4y2BapgydF4y2Ba值相对于年龄对照组(双尾Fisher精确检验性别，Mann-Whitney U检验年龄)。gydF4y2Ba

MDS患者（高达20%的爆炸）在所有18岁及以上签署知情同意书的IPSS风险中，被纳入研究。患有其他恶性肿瘤、患有严重非控制性慢性病和复发性疾病的患者、孕妇或哺乳期妇女以及患有精神疾病导致患者无法签署知情同意书的患者被排除在外。gydF4y2Ba

研究材料为外周血。血液样本被收集到含有抗凝剂的试管中。根据传统技术，在血液分析仪上计数细胞。外周血单个核细胞(PBMCs)的分离和随后的分析在接下来的6小时内进行。gydF4y2Ba

以菲科尔密度梯度（1.077g/cm）离心分离PBMCgydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba)，用1% BSA和0.01% NaN的PBS悬浮gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba(洗涤和孵育缓冲液)，与针对表面标记物的单克隆抗体(MAbs)在4°C孵育30分钟。然后细胞被洗permeabilized 40分钟Foxp3固定/透化作用缓冲(eBioscience)方法根据公司的指导方针,再次清洗,孵化90分钟在4°C在黑暗中anti-FOXP3马伯,最后一次清洗,立即使用流式细胞分析仪分析。因为Treg是一个小群体，至少2×10是这样gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba对进入淋巴细胞门的细胞进行分析，这使得误差减小成为可能。使用BD FACSCanto™II流式细胞仪(Becton Dickinson)在标准模式下进行流式细胞检测。使用FlowJo软件(trestar)对数据进行分析。gydF4y2Ba

用不同荧光团标记的单克隆抗体gydF4y2Ba即。gydF4y2Ba，FITC（异硫氰酸荧光素），PE（藻红蛋白），APC（别藻蓝蛋白），PerCP-eFluor 710（多甲藻素 - 叶绿素蛋白eFluor 710），和PE-Cy7的（藻红蛋白cyanin7），使用了。下面通过制造eBioscience公司MAb的组合使用（同种型对照来自同一公司）：CD3-PE-Cy7的，CD4-FITC，CD25-PerCP-eFluor710，FOXP3（PCH101）-APC和FOXP3（150D / E4） -PE。该技术的特点是抗FOXP3单克隆抗体的抗原表位特异性。所述PCH101的MAbs识别由外显子1编码的FOXP3表位;换句话说，所有的FOXP3同种型，和150D / E4的MAbs识别由外显子2，即，FOXP3-FL和FOXP3Δ7专门编码的表位。对于调节性T细胞的识别的门控算法在图呈现gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，gydF4y2Bad、e、gydF4y2Ba和所有的FOXP3gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba单元格如图所示gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，gydF4y2Bad, fgydF4y2Ba. 先前的研究表明，不可能分割FOXP3gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba根据FOXP3的水平人口亚型表达和来估计总FOXP3适当荧光强度的比率是有用gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba人口 [gydF4y2Ba19.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．因此，我们确定所有CD3中的荧光团共轭mAb的荧光团缀合的mAb的平均荧光强度（MFI）与Foxp3外显子2（Foxp3外显子2mFi）和外显子1（Foxp3外显子1mFi）gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaFoxp3.gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba推导参数FI的细胞（FOXP3外显子2/总数）=[（FOXP3外显子2 MFI）/（FOXP3外显子1 MFI）]（图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba， f, g)，如前所述[gydF4y2Ba19.gydF4y2Ba］．CD3gydF4y2Ba^-gydF4y2Ba不表达FOXP3的细胞作为阴性对照建立FOXP3的门gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞(见图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba得了gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

图1gydF4y2Ba

流式细胞术。使用pbmc的调节性T细胞门控算法gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba的74岁的健康捐赠者。（gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba）PBMC中的淋巴细胞。（gydF4y2BacgydF4y2Ba)建立FOXP3gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba门使用CD3gydF4y2Ba^-gydF4y2Ba已知不表达FOXP3的细胞:CD3gydF4y2Ba^-gydF4y2Ba淋巴细胞中的细胞(gydF4y2BabgydF4y2Ba）;FOXP3(外显子1)的建立gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba门使用CD3gydF4y2Ba^-gydF4y2Ba细胞(gydF4y2BacgydF4y2Ba)．（gydF4y2Bad-EgydF4y2Ba）检测Treg：CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba淋巴细胞中的T细胞(gydF4y2BadgydF4y2Ba）;CD25gydF4y2Ba^+gydF4y2BaFOXP3(外显子1)gydF4y2Ba^+gydF4y2BaTreg在CD4中gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞（gydF4y2BaegydF4y2Ba)．（gydF4y2Baf–ggydF4y2BaFOXP3亚型的表达）的分析：所有的FOXP3gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD4细胞之间gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞（gydF4y2BafgydF4y2Ba)；计算所有FOXP3中的FI（FOXP3外显子2/总数）参数gydF4y2Ba^+gydF4y2Bacells = [(FOXP3外显子2 MFI)/(FOXP3外显子1 MFI)] (gydF4y2BaggydF4y2Ba)．实箭头表示门控算法。虚线双向箭头表示CD3建立的门的对齐gydF4y2Ba^-gydF4y2Ba和CD3gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞。gydF4y2Ba^1gydF4y2Baa.u：任意单位;gydF4y2Ba^2gydF4y2BaPBMCs:外周血单个核细胞。gydF4y2Ba

使用非参数统计进行统计分析。参数表示为gydF4y2Ba我gydF4y2Ba（gydF4y2BaL-HgydF4y2Ba),gydF4y2Ba我gydF4y2Ba是中位数，gydF4y2BalgydF4y2Ba较低的四分位数是and吗gydF4y2Ba是上四分位数。我们使用Kruskal-Wallis测试来分析四组。如果组之间存在统计学意义的差异，我们使用了Mann-WhitneygydF4y2Ba试验比较两组的数量特征。使用95%置信区间X [X1;其中X为频率，X1和X2分别为置信下限和置信上限。我们使用双尾Fisher精确检验来比较两个独立的二项比例。p值小于0.05被认为具有统计学意义。采用StatSoft Statistica v.12.0进行数据分析。gydF4y2Ba

3.结果gydF4y2Ba

76例确诊为MDS的患者，按照世界卫生组织(World Health Organization)的造血和淋巴组织肿瘤分类(2008)进行检查(见表)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．14例患者的难治性贫血（RA），六有5号染色体的长臂的分离的缺失（德尔（5q）的），5曾与环形铁粒幼难治性贫血（RARS），17为难治性血细胞减少与多系发育异常（RCMD），15有难治性贫血伴原始细胞过多1（RAEB-1），并具有RAEB-2 19。48名患者没有核型的变化，和28具有下列染色体异常：6个例，德尔（5q）的;4名患者，德尔（7Q）;2个例，德尔（20Q）;2个例，德尔（Y），8有两个染色体异常和6具有三个以上的克隆的染色体重排。按照IPSS所有MDS人口划分为低风险（19例），中间-1风险（12名患者），中间-2风险（19名患者），和高风险组（26例）。预处理的患者通过该标准在两个组（E-MDS和L-MDS）除以被表示如下：低风险，13名患者;中间-1风险，患者14; intermediate-2 risk, patients 10; and high-risk groups, 18 patients. It should be noted beforehand that all the results obtained for the E-MDS and L-MDS groups had no statistically significant differences, so in the text below the significance of the differences is mentioned only in the context of a comparison with the MDS-primary or age control groups. However, we did not join E-MDS and L-MDS groups to emphasize the absence of these differences in our study, despite previous findings linking a poor prognosis of the disease with increased Treg frequencies [4gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba


参数gydF4y2Ba	MDS患者,gydF4y2BangydF4y2Ba= 76gydF4y2Ba	频率,%gydF4y2Ba

年龄，年gydF4y2Ba	69年(63 - 76)gydF4y2Ba	-gydF4y2Ba
性gydF4y2Ba
男性gydF4y2Ba	35gydF4y2Ba	46.1gydF4y2Ba34.8;57．3gydF4y2Ba
女gydF4y2Ba	41gydF4y2Ba	53.9gydF4y2Ba42.7;65.2gydF4y2Ba
MDS变体(WHO2008)gydF4y2Ba
类风湿性关节炎gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba	14.gydF4y2Ba	18.4gydF4y2Ba9.7;27．1gydF4y2Ba
与孤立相关的MDgydF4y2Ba	6gydF4y2Ba	7．9gydF4y2Ba1.8;14．0gydF4y2Ba
德尔(5问)gydF4y2Ba	5gydF4y2Ba	6．6gydF4y2Ba1.0;12．2gydF4y2Ba
rargydF4y2Ba^2gydF4y2Ba	17.gydF4y2Ba	22.4gydF4y2Ba13.0;31.7gydF4y2Ba
RCMD^3.gydF4y2Ba	15.gydF4y2Ba	19.7gydF4y2Ba10.8;28.7gydF4y2Ba
RAEBgydF4y2Ba^4gydF4y2Ba-1gydF4y2Ba	19.gydF4y2Ba	25.0gydF4y2Ba15.3;34.7gydF4y2Ba
RAEB-2gydF4y2Ba
染色体组型gydF4y2Ba
正常的gydF4y2Ba	48gydF4y2Ba	63.2gydF4y2Ba52.3;74.0gydF4y2Ba
不正常的gydF4y2Ba	28.gydF4y2Ba	36.8gydF4y2Ba26.0;47.7gydF4y2Ba
IPSSgydF4y2Ba
低gydF4y2Ba	19.gydF4y2Ba	25.0gydF4y2Ba15.3;34.7gydF4y2Ba
Intermediate-1	12.gydF4y2Ba	15．8gydF4y2Ba7.6;24.0gydF4y2Ba
Intermediate-2	19.gydF4y2Ba	25.0gydF4y2Ba15.3;34.7gydF4y2Ba
高gydF4y2Ba	26.gydF4y2Ba	34.2gydF4y2Ba23.5;44.9gydF4y2Ba

注意:gydF4y2Ba染色体组型的变化在文中作了描述。gydF4y2Ba^1gydF4y2BaRA，难治性贫血;RARS，难治性贫血伴有环形铁粒幼;RCMD，难治性血细胞减少伴多系发育异常;RAEB，难治性贫血伴原始细胞过多。gydF4y2Ba

在所有MDS组中，白细胞，淋巴细胞和CD4的绝对数量gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba与年龄对照组相比，外周血T细胞减少(见表)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)，这是MDS的典型特征。治疗前患者(E-MDS组和L-MDS组)白细胞和淋巴细胞数量的减少较原发患者更为明显。此外，CD4的数量也显著下降gydF4y2Ba^+gydF4y2BaL-MDS组的T细胞。然而，与之前发表的在某些MDS病例中Treg数目可能增加的数据相比[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，我们观察到，与年龄对照组相比，所有MDS组中Treg的绝对数量大约减少了2倍gydF4y2Ba4gydF4y2Ba).有必要澄清，只有含有CD3的细胞gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD25gydF4y2Ba^+gydF4y2BaFoxp3.gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba表型为Treg。在本例中，FOXP3的表达是通过细胞与PCH101单克隆抗体结合来确定的(图)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Bae)gydF4y2Ba检测所有FOXP3分子。Treg的数量减少与白细胞减少程度成正比，并且比淋巴细胞和所有CD4数量的减少更显著gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞，这在MDS患者外周血细胞群的绝对数量图中很明显(图)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．与所有CD4相比，更值得注意的Treg减少gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞是由于CD4细胞中Treg的百分比下降gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞(表gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．在MDS-初级和E-MDS组中，TREG百分比减少是统计学意义的，表明在这些MDS组中发育自身免疫疾病的较高概率。一般而言，无论疾病阶段，Treg数量的减少反映了周边骨髓起源细胞数量的总体下降，是MDS中断血液血液血液的标志。gydF4y2Ba


团体gydF4y2Ba	白细胞gydF4y2Ba	淋巴细胞gydF4y2Ba	CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaТ细胞gydF4y2Ba

年龄控制,n = 26gydF4y2Ba	6.15 (5.4 - -7.7)gydF4y2Ba	2.0 (1.7 - -2.4)gydF4y2Ba	0.8 (0.6–1.0)gydF4y2Ba
MDS-primarygydF4y2Ba^1gydF4y2Ba, n = 21gydF4y2Ba	4．1gydF4y2Ba（3.0-5.8）gydF4y2Ba	1.6 (1.2 - -2.6)gydF4y2Ba	0.5gydF4y2Ba(0.4 - -0.9)gydF4y2Ba
E-MDSgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba, n = 27gydF4y2Ba	3.1gydF4y2Ba(2.0 - -3.9)gydF4y2Ba	1.2gydF4y2Ba(0.9 - -1.5)gydF4y2Ba	0.4gydF4y2Ba(0.3 - -0.6)gydF4y2Ba
L-MDSgydF4y2Ba^3.gydF4y2Ban = 28gydF4y2Ba	2.6gydF4y2Ba(1.7 - -3.9)gydF4y2Ba	1.1gydF4y2Ba(0.8 - -2.1)gydF4y2Ba	0.4gydF4y2Ba(0.2–0.6)gydF4y2Ba

注意:gydF4y2Ba pgydF4y2Ba与年龄对照<0.05;gydF4y2Ba pgydF4y2Ba与年龄对照<0.001;gydF4y2Ba与原发性mds相比，p<0.05。gydF4y2Ba^1gydF4y2Bamds -原发性，原发性骨髓增生异常综合征;gydF4y2Ba^2gydF4y2BaE-MDS，早期骨髓增生异常综合征;gydF4y2Ba^3.gydF4y2BaL-MDS，晚期骨髓增生异常综合征。gydF4y2Ba


团体gydF4y2Ba	Treg 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞/ LgydF4y2Ba	Treg在CD4中的百分比gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞,%gydF4y2Ba

年龄控制,n = 26gydF4y2Ba	29.8 (23.3 - -40.2)gydF4y2Ba	4.1 (3.4 - -4.3)gydF4y2Ba
MDS-primarygydF4y2Ba^1gydF4y2Ba, n = 21gydF4y2Ba	17.0gydF4y2Ba(12.0 - -19.7)gydF4y2Ba	3.2gydF4y2Ba(2.7 - -4.0)gydF4y2Ba
E-MDSgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba, n = 27gydF4y2Ba	13．6gydF4y2Ba(7.9–19.9)gydF4y2Ba	3.1gydF4y2Ba（1.8-4.7）gydF4y2Ba
L-MDSgydF4y2Ba^3.gydF4y2Ban = 28gydF4y2Ba	12.6gydF4y2Ba(8.0 - -17.3)gydF4y2Ba	3.6 (2.8 - -5.8)gydF4y2Ba

注意:gydF4y2Ba pgydF4y2Ba与年龄对照<0.05;gydF4y2Ba pgydF4y2Ba<0.001与年龄对照。gydF4y2Ba^1gydF4y2Bamds -原发性，原发性骨髓增生异常综合征;gydF4y2Ba^2gydF4y2BaE-MDS，早期骨髓增生异常综合征;gydF4y2Ba^3.gydF4y2BaL-MDS，晚期骨髓增生异常综合征。gydF4y2Ba

图2gydF4y2Ba

绝对数量MDS患者和年龄相匹配的健康供者外周血细胞群（10gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba细胞/ L，和Treg：10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞/ L)。注意:gydF4y2Ba pgydF4y2Ba与年龄对照<0.05;gydF4y2Ba pgydF4y2Ba与年龄对照<0.001;gydF4y2Ba^__gydF4y2Ba与原发性mds相比，p<0.05。MDS-primary:原发性骨髓增生异常综合征;E-MDS:早期骨髓增生异常综合征;L-MDS:晚期骨髓增生异常综合征组。gydF4y2Ba

假设作为造血的一部分的淋巴细胞生成的紊乱不仅影响细胞的数量，而且影响细胞的功能，我们研究了FOXP3亚型在Treg中的表达水平，正如我们前面提到的，Treg具有不同的功能特性。为此，我们分析了所有CD3中FOXP3外显子2和FOXP3外显子1的MFIgydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaFoxp3.gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞，并计算参数FI (FOXP3外显子2/total)，如材料与方法中所述。我们发现，与年龄对照组相比，mds原发组FOXP3外显子2的MFI增加。原始MDS患者和年龄匹配的健康供者之间外显子2荧光强度的差异在流式细胞术图上清晰可见，反映了CD3中外显子1和外显子2的共表达gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞(图gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．FI的计算之后（FOXP3外显子2 /总数）参数（表gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)，我们发现，相对于年龄对照组，原发性mds组FOXP3- fl占所有FOXP3的比例明显升高，但治疗后，E-MDS组和L-MDS组FOXP3- fl占所有FOXP3的比例恢复正常。因此，MDS中Treg频率的降低伴随着FOXP3- fl的相对积累，这种FOXP3亚型的不平衡在治疗后消失，但Treg的数量保持不变。gydF4y2Ba


团体gydF4y2Ba	FI (FOXP3外显子2/总);gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba

年龄控制,n = 26gydF4y2Ba	0.52 (0.48 - -0.56)gydF4y2Ba
MDS-primarygydF4y2Ba^1gydF4y2Ba, n = 21gydF4y2Ba	0.68gydF4y2Ba(0.59 - -0.75)gydF4y2Ba
E-MDSgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba, n = 27gydF4y2Ba	0．56gydF4y2Ba(0.47 - -0.65)gydF4y2Ba
L-MDSgydF4y2Ba^3.gydF4y2Ban = 28gydF4y2Ba	0.54gydF4y2Ba(0.47 - -0.62)gydF4y2Ba

-primary：原发性骨髓增生异常综合征;gydF4y2Ba^2gydF4y2BaE-MDS:早期骨髓增生异常综合征;gydF4y2Ba^3.gydF4y2BaL-MDS：晚期骨髓增生异常综合征;gydF4y2Ba^4gydF4y2Baa、 u:任意单位。注：gydF4y2Ba pgydF4y2Ba与年龄对照<0.001;gydF4y2Ba与原发性mds相比p<0.05;gydF4y2Ba pgydF4y2Ba< 0.001 rel。MDS-primary。gydF4y2Ba

（一种）gydF4y2Ba

（b）gydF4y2Ba

图3gydF4y2Ba

流式细胞术：反映CD3中FOXP3外显子1和外显子2共表达的等高线图gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba来自PBMC的细胞（小图）和CD3 + 4 + Foxp3 +细胞（大图）gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba(a)年龄匹配的健康供体和(b) MDS原发患者。红色标记的是FOXP3荧光强度的中位数gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba门。gydF4y2Ba^1gydF4y2BaPBMCs:外周血单个核细胞。gydF4y2Ba

4.讨论gydF4y2Ba

我们的研究揭示了在MDS中Treg的频率和可能的功能活动的降低。我们认为MDS患者Treg功能活性的降低与FOXP3亚型表达比例的改变有关，FOXP3亚型表达比例有利于FOXP3- fl。FOXP3-FL相对积聚的可能原因是Treg无法抑制原发性MDS患者的过度免疫反应和炎症。我们的推测是基于以下几点。首先，Wang等人证明FOXP3可以在受刺激的非调节性CD4中瞬时表达gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞[gydF4y2Ba21.gydF4y2Ba］．二，伦贝格等人。表明T细胞受体刺激在CD4中诱导Foxp3-Fl表达gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba［gydF4y2Ba19.gydF4y2Ba］．此外，他们已确定，冠状动脉疾病，慢性炎症性疾病中的一个，与上述相关联的FOXP3同种型中的患者的PBMC所定义的表达模式与此诊断[gydF4y2Ba19.gydF4y2Ba］．第三，在我们的研究中，治疗消除了原发性MDS患者中FOXP3-FL的相对升高。换句话说，这种增长是短暂的。gydF4y2Ba

不能排除Treg功能活性可能下降的另一种解释。它是基于关于不同FOXP3亚型功能特性的已知信息[gydF4y2Ba13.gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba18.gydF4y2Ba］．假设FOXP3- fl主导模式是MDS中Treg固有的，治疗患者中其纠正与治疗对Treg的直接影响有关，我们可以假设是FOXP3亚型表达的改变决定了Treg的功能活性。gydF4y2Ba

Treg功能活性和FOXP3亚型表达之间的关系间接地被人类胸腺分化期间Treg中FOXP3亚型表达水平的数据所证实[gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba]，以及多发性骨髓瘤[gydF4y2Ba23.gydF4y2Ba]慢性炎症性肠病疾病[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．这些研究采用了类似的技术，使用特异于外显子1和外显子2的单克隆抗体来确定FOXP3亚型的表达。在这里我们需要做一个重要的评论。在我们之前的研究中，我们将Treg亚群划分为FOXP3外显子2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba外显子2gydF4y2Ba^-gydF4y2Ba［gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23.gydF4y2Ba就像其他一些调查人员所做的那样[gydF4y2Ba24.gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba］．现在我们认为这是不正确的。在本讨论中，我们将尝试重新解释这些数据。FOXP3外显子2的门被正式设置gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba外显子2gydF4y2Ba^-gydF4y2Ba单元格，如图所示gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，增加Foxp3外显子2的百分比gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞伴随主要在信道反映FOXP3-FL表达的增加在相应的MFI。这一事实使我们能够解释的比例上升为FOXP3-FL在FOXP3相对积累gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞。gydF4y2Ba

根据公布的数据，在胸腺中的分化期间，表达Foxp3-F1的Treg前体的百分比下降，因为它们在双阳性CD25中成熟了65％gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba胸腺细胞增加到33%gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba调节性T细胞[gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba］．一种新的解释让我们认为FOXP3-FL在CD4中占优势gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD25gydF4y2Ba^+gydF4y2BaFoxp3.gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD3以胸腺细胞和FOXP3Δ2为主gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD25gydF4y2Ba^+gydF4y2BaFoxp3.gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba胸腺细胞。因此，人胸腺Treg的功能成熟伴随着FOXP3Δ2的积累。gydF4y2Ba

FOXP3Δ2的进一步积累很可能伴随着肿瘤疾病。例如，之前我们已经证明多发性骨髓瘤原发患者外周血中Treg的数量增加了两倍[gydF4y2Ba23.gydF4y2Ba］．FOXP3Δ2在Treg中积累，即使在Treg数量正常化后缓解期仍维持，伴随这种增加[gydF4y2Ba23.gydF4y2Ba］．这些数据表明FOXP3Δ2参与了多发性骨髓瘤的发病机制，并且可能比FOXP3-FL具有更高的功能活性。gydF4y2Ba

在慢性炎症性肠疾病（IBD）的研究获得FOXP3Δ2的高功能活性的另一种间接确认[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．最初，作者假设IBD中免疫反应的Th17极化可能是由于FOXP3Δ2不能结合ROR而积累了只表达FOXP3Δ2的TreggydF4y2BaγgydF4y2Ba然而，FOXP3Δ2相对于FOXP3-FL的表达模式在肿瘤中没有差异gydF4y2Ba固有层gydF4y2Ba克罗恩病和非特异性溃疡性结肠炎患者与非IBD对照组的比较。在IBD中Treg数量和Th17极化普遍增加的背景下，FOXP3Δ2积累的缺失表明伴随的炎症与该亚型无关。因此，FOXP3Δ2增加的机会当抑制免疫反应时，细胞核内的积聚比不能限制IL-17表达更为显著。gydF4y2Ba

在讨论结束时，有必要澄清我们和早期获得的数据的差异在MDS中的TREG金额之间。除了样品制备方案和流式细胞术策略的差异之外，我们还可以不同地评估结果。我们没有试图将在我们的研究中的特雷格人群中的个体波动联系起来，这些疾病预后也呈现出已有的IPSS评估系统将患者分成群组。因此，我们已经证明了所有群体，包括主要患者的趋势，朝着数量的减少和可能的Treg职能减损。早期获得的结果无疑表明疾病预后较差，而Treg数量的增加，但更有可能是特定情况而不是一般趋势。这些差异可以通过疾病的异质性来解释在常规的MDS的常见名称下，这些疾病由于在改变的骨髓利基中受损的血流病毒患者而受到二次免疫缺陷的常见。发育发育不良的性质导致骨髓起源细胞之间的明确相互作用，尤其是与免疫系统相关的相互作用，决定了疾病的发病机制和临床症状。这些疾病的载体由分化阶段最初受到影响的决定。有可能对MDS发病机制的机制的详细研究将导致患有特征临床特征和结果的个体疾病。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

我们发现CD4细胞中Treg细胞的绝对数量和百分比都有所下降gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba所有MDS患者外周血中的T细胞。在未经治疗的患者中，Treg数量的减少伴随着FOXP3-FL的相对积累，这可以反映炎症的存在和Treg功能活性的下降。这些观察结果可以解释该疾病中自身免疫性疾病的高风险，并有助于进一步了解Treg和FOXP3亚型在MDS发病机制中的作用。gydF4y2Ba

数据可用性gydF4y2Ba

用于支持本研究发现的数据可由通讯作者要求提供。gydF4y2Ba

的利益冲突gydF4y2Ba

提交人声明有关本文的出版物没有利益冲突。gydF4y2Ba

致谢gydF4y2Ba

这项研究得到了Celgene国际控股公司的支持。gydF4y2Ba

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