骨髓增生异常综合征(MDS)是一个异质群体的疾病,造成克隆干细胞疾病,与周边的具体迹象血球减少由于无效造血作用与正常或增加骨髓的细胞结构。MDS的临床表现,当然,结果是高度多样化,和中位数生存从6个月到5年不等(gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba]。MDS一直被认为通过棱镜的造血祖细胞克隆扩张的风险进一步转型为急性髓系白血病(AML)在大约30 - 40%的病人gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba]。尽管存在与一个定义良好的预后预测尺度结构基于细胞学和细胞遗传学实验室参数的疾病和白血病的发展渗透往往非常难以预测。预测急性白血病的问题,反过来,很难选择治疗策略。的临床研究,旨在调查新方法分层疾病进展的风险每年增长。gydF4y2Ba

考虑到免疫系统在MDS的发病机制中扮演了积极的角色,我们可以假设一些免疫参数,例如,调节性T细胞的数量(Treg),可作为预后标准。在某种程度上Treg参与MDS发病机理可以解释这种疾病协会与自身免疫性疾病(gydF4y2Ba 3gydF4y2Ba和肿瘤的转换gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba),考虑到低数量和Treg功能下降导致弱抑制过度的免疫反应,而大量和Treg功能的增加会导致破坏的免疫监测肿瘤的生长。gydF4y2Ba

大部分的链接增加Treg频率进行研究与MDS预后不利gydF4y2Ba 4gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba 7gydF4y2Ba]。尽管这些研究一个类似的结论,获得的数据的数量在MDS Treg相当矛盾,可能涉及不同的样品制备协议和控制策略用于流式细胞术分析(gydF4y2Ba 8gydF4y2Ba]。这种假设是间接证实了在Treg频率差异的同龄健康的捐赠者。gydF4y2Ba

尝试使用功能Treg特征作为MDS预后标准也。Mailloux等人已经证明Treg数量的增加与效应记忆t细胞表型与MDS预后不良,如转型为急性髓系白血病和低生存(gydF4y2Ba 9gydF4y2Ba]。然而,结果可能不是一个预后则可反映一个特定阶段的疾病。gydF4y2Ba

之前考虑到功能性Treg特征作为MDS预后标准,一个人必须考虑的主要监管者Treg分化和功能是FOXP3转录因子(gydF4y2Ba 10gydF4y2Ba]。所以的特性表达式Treg功能应该有一个显著的影响。FOXP3的分子结构,研究的结果已经确定可变剪接在人类四mRNA FOXP3的变异和四个亚型:完整的分子(FOXP3-FL);外显子2删除(FOXP3Δ2);外显子7删除(FOXP3Δ7);同时删除外显子2和7 (FOXP3Δ2Δ7)[gydF4y2Ba 11gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba 13gydF4y2Ba]。在最近发表的评论(gydF4y2Ba 14gydF4y2Ba),梅勒r .详细分析FOXP3可变剪接的生物学和FOXP3亚型的特定功能。功能删除的区域编码外显子的意义是不同的。简而言之,外显子2编码FOXP3域负责绑定ROR的转录因子gydF4y2Ba αgydF4y2Ba和RORgydF4y2Ba γgydF4y2Bat家庭(gydF4y2Ba 15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba 16gydF4y2Ba)确定促炎Th17免疫反应的极化;第7外显子编码序列负责FOXP3二聚作用,及其没有扰乱了Treg抑制功能(gydF4y2Ba 13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba 17gydF4y2Ba]。FOXP3分子缺乏的一个重要特点外显子2和7产品定位在细胞核内优惠:Magg等人已经表明,他们失去了核出口信号(NES)序列位于区域由外显子编码1/2和6/7 (gydF4y2Ba 18gydF4y2Ba]。这组也证明FOXP3表达主要在细胞质中发现天真的CD4细胞活化gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD25gydF4y2Ba^{- - - - - -gydF4y2Ba}T细胞,而CD4主要定位在细胞核中gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD25gydF4y2Ba^+gydF4y2BaTreg [gydF4y2Ba 18gydF4y2Ba]。FOXP3在细胞核定位非常关键的转录激活因子和抑制因子的函数。,因此,我们可以假设FOXP3Δ2抑制函数,主要位于细胞核,是占主导地位的同种型决定Treg功能活动。gydF4y2Ba

考虑可用数据的不一致性Treg的数量,他们的潜在的重要作用MDS病机、和功能表达FOXP3亚型之间的差异,我们不仅决定评估的数量和百分比Treg这种疾病也FOXP3亚型表达水平对MDS患者在疾病的不同阶段。gydF4y2Ba

参加研究的七十六例MDS患者(表gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba)。他们被分为三组:初级(MDS-primary),早期(E-MDS)和晚期MDS (L-MDS)。患者治疗前(病)的任一阶段代表了MDS-primary组。E-MDS和L-MDS团体由病人进行预处理。他们将根据国际预后评分系统(入侵)。使用爆炸比例、核型和血球减少的数量,这个评分系统可靠地估计生存和白血病的风险转换(gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba]。在入侵防御,血球减少被定义为血红蛋白< 10 g / dL,绝对中性粒细胞计数< 1.83 x10gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba/ L,血小板计数< 100 x10gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba/ L。细胞遗传学分类如下:(好正常,- y,德尔(20问),德尔(5 q),可怜的(7号染色体异常和复杂,这被定义为3或更多的异常),和中间(所有其他异常)。经过不同的患者得分小于或等于1.0根据入侵防御(低和intermediate-1风险组)被组装成E-MDS组。进行预处理的患者得分1.5和更多的根据入侵(intermediate-2和高危人群)组装成L-MDS组。MDS-primary组包括21例(14个女性,7人)和年龄中位数为72.0(64 - 76.5)年。E-MDS组包括27例(15位女性,12人),年龄中位数为71.5(64 - 76)年。L-MDS集团包括28例(12女性,16人),年龄中位数为68.5(63 - 73)年。26的同龄健康献血者(15个女性,11人),年龄中位数为72(48 - 79)年,被登记为一个对照组(表时代gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba)。因此,病人特征相似的年龄,性别和年龄与对照组。所有的病人从E-MDS L-MDS组红细胞(RBC)输血相关的。输血负担范围从2 - 3到5 - 6包装RBC单位每月。病人已经接受红细胞输血从4个月到5年。处方前研究L-MDS hypomethylating甚至细胞抑制剂治疗的组。gydF4y2Ba

MDS患者(20%爆炸)的入侵风险18岁和更签署知情同意的形式包含在这项研究。与其他恶性肿瘤患者,患有严重失控cooccurring慢性和复发性疾病,精神疾病患者怀孕或哺乳妇女,使病人无法签署知情同意被排除在外。gydF4y2Ba

研究材料是外周血。血液样本被收集到试管抗凝。细胞被指望血液学分析仪根据传统的技术。分离外周血单核细胞(PBMCs)及其随后的分析进行了在接下来的6小时。gydF4y2Ba

PBMCs被在聚蔗糖密度梯度离心分离(1.077克/厘米gydF4y2Ba^3gydF4y2Ba),悬浮在PBS南BSA为1%和0.01%gydF4y2Ba_3gydF4y2Ba(洗涤和孵化缓冲区),孵化与单克隆抗体(mab)对表面标记在4°C 30分钟。然后细胞被洗permeabilized 40分钟Foxp3固定/透化作用缓冲(eBioscience)方法根据公司的指导方针,再次清洗,孵化90分钟在4°C在黑暗中anti-FOXP3马伯,最后一次清洗,立即使用流式细胞分析仪分析。随着Treg未成年人口,至少2×10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba分析了细胞进入淋巴细胞门,这使人们有可能减少错误。流式细胞术进行了BD FACSCanto™II流式细胞分析仪(正)在标准模式。数据分析使用FlowJo软件(Treestar)。gydF4y2Ba

马伯贴上不同的荧光团,gydF4y2Ba 即。gydF4y2BaFITC(异硫氰酸荧光素)、PE(藻红蛋白),APC (allophycocyanin) PerCP-eFluor 710 (peridinin-chlorophyll-protein-eFluor 710),和PE-Cy7 (phycoerythrin-cyanin7)。使用以下的组合马伯eBioscience生产的(同形像控制从同一家公司):CD3-PE-Cy7, CD4-FITC, CD25-PerCP-eFluor710, FOXP3 (PCH101) apc, FOXP3 (150 d / E4) pe。这种技术的特点是特异性的抗原决定基的anti-FOXP3马伯。的PCH101马伯识别FOXP3抗原决定基由外显子编码1;换句话说,所有FOXP3亚型,150 d / E4马伯识别的抗原决定基编码外显子2,即。,FOXP3-FL FOXP3Δ7完全。歧视的控制算法Treg呈现在图gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba 一个gydF4y2Ba,gydF4y2Ba d、e、gydF4y2Ba和所有FOXP3gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞呈现在图gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba 一个gydF4y2Ba,gydF4y2Ba d, fgydF4y2Ba。之前的研究表明,把FOXP3是不可能的gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba人口据FOXP3亚型表达的水平,是有用的估计的比例恰当的总FOXP3的荧光强度gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba人口(gydF4y2Ba 19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba 20.gydF4y2Ba]。因此我们确定的平均荧光强度(MFI) fluorophore-conjugated马伯绑定FOXP3外显子2 (FOXP3外显子2 MFI)和外显子1在所有CD3 (MFI FOXP3外显子1)gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaFOXP3gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞获得参数FI (FOXP3外显子2 /总数)= ((FOXP3外显子2 MFI) / (MFI FOXP3外显子1)](图gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba,f, g),因为它是前面描述的gydF4y2Ba 19gydF4y2Ba]。CD3gydF4y2Ba^{- - - - - -gydF4y2Ba}细胞不表达FOXP3被用作控制的建立非门FOXP3gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞(见图gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba 得了gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

使用非参数统计的统计分析。提供的参数gydF4y2Ba 我gydF4y2Ba(gydF4y2Ba L-HgydF4y2Ba),gydF4y2Ba 我gydF4y2Ba中位数,gydF4y2Ba lgydF4y2Ba下四分位数,gydF4y2Ba HgydF4y2Ba 上四分位数。我们利用克鲁斯卡尔-沃利斯检验分析四组。团体之间的显著差异,我们使用Mann-WhitneygydF4y2Ba UgydF4y2Ba 测试两组比较的量化特征。使用95%置信区间的相对频率提出了X (X1;X2),其中X是一个频率和X1和X2上下置信区间,分别。我们双尾确切概率法用于比较两个独立的二项的比例。一个p值小于0.05被认为是具有统计学意义。数据分析与执行StatSoft Statistica v.12.0。gydF4y2Ba

七十六的验证诊断MDS患者检查按照世界卫生组织分类的造血和淋巴组织肿瘤(2008)(表gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba)。14例难治性贫血(RA),六有一个孤立的删除5号染色体的长臂(德尔(5 q)), 5与环形铁粒幼红细胞难治性贫血(rar), 17有耐火血球减少multilineage发育不良(RCMD), 15个有过剩的难治性贫血爆炸1 (RAEB-1)和19 RAEB-2。48名患者没有核型的变化,和28岁以下染色体异常:6例,德尔(5 q);4个病人,德尔q (7);2例,德尔(20问);2例德尔(Y) 8两条染色体异常,和6有超过三个克隆染色体重排。按照入侵防御所有MDS人口分为低风险病人(19),intermediate-1风险(12例),intermediate-2风险(19)患者和高危人群患者(26)。预防病人除以这一标准在两组(E-MDS和L-MDS)代表如下:低风险、13个病人;intermediate-1风险,患者14;intermediate-2风险,患者10; and high-risk groups, 18 patients. It should be noted beforehand that all the results obtained for the E-MDS and L-MDS groups had no statistically significant differences, so in the text below the significance of the differences is mentioned only in the context of a comparison with the MDS-primary or age control groups. However, we did not join E-MDS and L-MDS groups to emphasize the absence of these differences in our study, despite previous findings linking a poor prognosis of the disease with increased Treg frequencies [ 4gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba 7gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

所有MDS组的绝对数量的白细胞,淋巴细胞和CD4细胞gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba在外周血T细胞减少与年龄对照组相比(表gydF4y2Ba 3gydF4y2Ba对MDS),这是典型的。预防患者(E-MDS和L-MDS组),减少白细胞和淋巴细胞的数量变得更显著的相比,主要的病人。此外,有显著减少CD4的数量gydF4y2Ba^+gydF4y2BaL-MDS组T细胞。然而,与以前公布的数据的数量可能增加Treg MDS的在某些情况下gydF4y2Ba 3gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba 6gydF4y2Ba),我们观察到一个大约两个绝对数量的减少Treg相比,MDS组年龄对照组(表gydF4y2Ba 4gydF4y2Ba)。有必要澄清,只有与CD3细胞gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD25gydF4y2Ba^+gydF4y2BaFOXP3gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba表型被视为Treg。FOXP3的表达,在这种情况下,是由细胞的绑定PCH101马伯(图gydF4y2Ba 1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba e)gydF4y2Ba检测所有FOXP3分子。定量减少Treg白血球减少症的程度成正比,比减少更明显的淋巴细胞和CD4的数量gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞,这一点从图表的绝对数量在MDS患者的外周血细胞群(图gydF4y2Ba 2gydF4y2Ba)。更显著的减少Treg与所有CD4相比gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞是由于减少的百分比Treg CD4之一gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞(表gydF4y2Ba 4gydF4y2Ba)。MDS-primary和E-MDS组,Treg百分比下降显著,表明更高概率的发展中自身免疫性疾病在这些MDS组。一般来说,Treg的数量减少,不管疾病的阶段,反映了细胞的数量总体下降骨髓起源的外围,是一个破坏的迹象在MDS造血作用。gydF4y2Ba

假设扰动的淋巴细胞增殖的造血作用不仅数量也影响细胞的功能,我们调查Treg FOXP3亚型的表达水平,不同的功能属性,正如我们上面所提到的。为此,我们分析FOXP3的MFI外显子2和CD3 FOXP3外显子1gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaFOXP3gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞和计算参数FI (FOXP3外显子2 /总数)中描述的材料和方法。我们发现FOXP3外显子2的MFI MDS-primary组的增加与年龄对照组相比。这种差异外显子2的荧光强度主要MDS患者和健康与捐赠者之间清晰可见的流式细胞术情节反映了外显子1和外显子2 coexpression CD3gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞(图gydF4y2Ba 3gydF4y2Ba)。经过计算的FI (FOXP3外显子2 /总数)参数(表gydF4y2Ba 5gydF4y2Ba)我们发现FOXP3-FL所有FOXP3的比例显著增加MDS-primary组相对于对照组年龄,但治疗后,在E-MDS和L-MDS团体,比恢复正常。因此,减少频率MDS的Treg伴随着FOXP3-FL的相对积累,这FOXP3亚型失衡治疗后消失,尽管Treg的数量保持不变。gydF4y2Ba

我们的研究揭示了频率和可能的减少Treg在MDS的功能活动。我们假设减少Treg MDS患者功能活动与变化的比率FOXP3亚型表达赞成FOXP3-FL。的可能原因相对积累FOXP3-FL Treg无力抑制过度的免疫反应和炎症发展主MDS患者。我们猜测是基于以下。首先,王等人表明,FOXP3可能是暂时性的刺激nonregulatory CD4的表达gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞(gydF4y2Ba 21gydF4y2Ba]。第二,Lundberg等人表明,T细胞受体刺激诱导FOXP3-FL CD4的表达gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞gydF4y2Ba 在体外gydF4y2Ba(gydF4y2Ba 19gydF4y2Ba]。此外,他们已经确定,冠状动脉疾病,慢性炎症疾病之一,与上述FOXP3亚型表达模式中定义PBMCs患者的诊断(gydF4y2Ba 19gydF4y2Ba]。第三,在我们的研究中,FOXP3-FL相对增加的主要治疗MDS患者被废除。换句话说,这个增加是短暂的。gydF4y2Ba

另一个解释可能减少的功能活动Treg不能被排除。它是根据已知信息的功能属性不同FOXP3亚型(gydF4y2Ba 13gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba 18gydF4y2Ba]。假设FOXP3-FL主导模式是内在的Treg MDS治疗患者及其校正与Treg治疗的直接影响,我们可以假设这是改变FOXP3亚型表达决定了Treg的机能活动。gydF4y2Ba

间接的关系Treg功能活动和FOXP3亚型表达数据证实了Treg FOXP3亚型的表达水平在人类胸腺分化(gydF4y2Ba 22gydF4y2Ba),以及在多发性骨髓瘤gydF4y2Ba 23gydF4y2Ba)和慢性炎性肠道疾病(gydF4y2Ba 20.gydF4y2Ba]。类似的技术使用马伯特定第1外显子和外显子2采用这些研究来确定具体亚型表达。在这里我们需要做出重大的评论。在先前的研究中,我们分类Treg亚种群,FOXP3外显子2所示gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba外显子2gydF4y2Ba^{- - - - - -gydF4y2Ba}(gydF4y2Ba 22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba 23gydF4y2Ba)和其他一些调查人员(gydF4y2Ba 24gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba 26gydF4y2Ba]。现在我们认为这是不正确的。在这个讨论中,我们将尝试重新解释这些数据。FOXP3的盖茨正式设置的外显子2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba外显子2gydF4y2Ba^{- - - - - -gydF4y2Ba}细胞,如图gydF4y2Ba 3gydF4y2Ba,增加的百分比FOXP3外显子2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba伴随着细胞的增加相应的渠道反映FOXP3-FL MFI主要表达式。这个事实让我们解释的相对比例的上升FOXP3 FOXP3-FL积累gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞。gydF4y2Ba

发布的数据显示,在胸腺分化,Treg前体的百分比表达FOXP3-FL拒绝成熟double-positive CD25的65%gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba胸腺细胞阳性CD4的33%gydF4y2Ba^+gydF4y2BaTreg [gydF4y2Ba 22gydF4y2Ba]。一个新的解释允许我们认为在CD4 FOXP3-FL占主导地位gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD25gydF4y2Ba^+gydF4y2BaFOXP3gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba胸腺细胞CD3 FOXP3Δ2主导gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD25gydF4y2Ba^+gydF4y2BaFOXP3gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba胸腺细胞。从而Treg人类胸腺的功能成熟伴随着FOXP3Δ2的积累。gydF4y2Ba

进一步积累FOXP3Δ2最有可能伴随肿瘤疾病。例如,以前我们演示了数量增加两倍的Treg多发性骨髓瘤患者外周血的主要(gydF4y2Ba 23gydF4y2Ba]。Treg FOXP3Δ2积累,保持甚至Treg数量标准化后的缓解,同时增加(gydF4y2Ba 23gydF4y2Ba]。这些数据表明,FOXP3Δ2参与多发性骨髓瘤的发病机制,可能有一个比FOXP3-FL更高的机能活动。gydF4y2Ba

高机能活动的的另一个间接确认FOXP3Δ2得到研究慢性炎症性肠病(IBD) (gydF4y2Ba 20.gydF4y2Ba]。最初,作者认为Th17极化IBD免疫反应的可能是由于Treg表达的积累只FOXP3Δ2因为FOXP3Δ2无法绑定RORgydF4y2Ba γgydF4y2Bat。然而,没有区别的表达式模式相对于FOXP3-FL FOXP3Δ2是见过的gydF4y2Ba 固有层gydF4y2Ba克罗恩氏病和非特异性溃疡性结肠炎患者和non-IBD控制。一般的背景下的数量增加Treg Th17极化在炎症性肠病,没有FOXP3Δ2积累表明,伴随炎症并不与此同等型相关。因此,FOXP3Δ2积累的机会在细胞核是更重要的比无法抑制免疫反应限制IL-17表达式。gydF4y2Ba

最后讨论,有必要澄清我们之间的差异和早期获得的数据在MDS Treg数量。可能,除了样品制备的不同协议和流式细胞术策略,我们评估结果不同。我们没有尝试链接个人Treg人口的波动也出现在我们的研究中使用的疾病预后,但可用的入侵防御评估系统将病人分成组。因此,我们已经证明了这一趋势常见的团体,包括主要的患者,对减少的数量和可能Treg的功能障碍。早些时候获得的结果无疑表明贫穷疾病预后与Treg数量增加,但更有可能是一个特定的情况下,而不是一个大趋势。这些差异可以解释为异质性的疾病在MDS的共同名字往往表现为继发性免疫缺陷由于受损改变骨髓造血作用的利基。的性质发展发育不良,导致破坏的定义良好的骨髓来源的细胞之间的相互作用,特别是那些与免疫系统有关,决定了疾病的发病机理和临床症状。这些障碍是由什么决定的向量分化阶段最初受到影响。可能机制的详细研究MDS发病机制将导致一个孤立的个人疾病特点临床特征和结果。gydF4y2Ba

我们展示了绝对数量的减少和Treg中CD4的百分比gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba外周血中T细胞的MDS患者。在未接受治疗的患者,Treg数量减少伴随着相对积累FOXP3-FL能够反映炎症的存在和减少Treg的机能活动。这些观察可以解释在这个疾病和自身免疫性疾病的高风险将有助于进一步了解Treg的角色和MDS中FOXP3亚型的发病机制。gydF4y2Ba