没有关联CCR5.rs333多态性与儿童急性淋巴细胞白血病

摘要

急性淋巴母细胞白血病(ALL)是一种恶性疾病，起源于单一的造血前体致力于B或t细胞谱系。通常，这些细胞表达CCR5趋化因子受体，它指导免疫应答对细胞模式，并参与癌症病理生物学。CCR5的rs333基因多态性(Δ32)导致受体表达减少，从而导致细胞运输受损。本研究的目的是调查CCR5.趋化因子受体Rs333在所有的发病机制中的多态性。在79名患者中研究了基因型分布，并在巴西南部的儿童群体中与80名对照受试者进行比较。使用通过与序列特异性引物（PCR-SSP）通过聚合酶链反应扩增的DNA样品进行基因分型。在研究中的任何受试者中未观察到纯合（Δ32/Δ32）缺失。杂合基因型与所有风险无关（或0.7％; 95％CI 0.21-2.32;），也不复发状态（或0.86; 95％CI 0.13-5.48;)．本研究首次证明，CCR5/Δ32基因型频率在ALL组和对照组之间无显著差异，表明该基因变异对ALL易感性和复发风险没有影响。

1.介绍

白血病是最常见的儿童癌症，尽管总体发病率很低。在这一人群中，急性淋巴母细胞白血病(ALL)的发生频率大约是急性骨髓性白血病(AML)的5倍，约占所有儿童白血病诊断的78% [1］．在巴西，国家癌症研究所（印加）2014年估计了9,370例白血病新病例，最高的年龄发生了1 - 4岁[2］．

对于某些ALL病例的侵袭性和治疗反应差的具体生物学和分子机制仍有待阐明。一旦发现趋化因子及其受体是白细胞向炎症部位和次级淋巴器官迁移的必要和选择性介质，它们也在肿瘤的起始、促进和进展中发挥关键作用是合理的[3.，4］．此外，最新研究表明，癌细胞破坏了正常的趋化因子系统，这些分子及其受体成为肿瘤微环境的重要组成部分，并以非常不同的方式发挥促肿瘤作用[5］．

CC趋化因子受体5 (CCR5)属于三聚体鸟嘌呤核苷酸结合蛋白偶联的七跨膜受体超家族，是人类蛋白中最大的超家族[6］．它通过G蛋白发挥活性，并与趋化因子RANTES (CCL5)、MIP-1结合α(CCL3)和MIP-1β(亚兰)7］．该受体参与白细胞向炎症部位的趋化[8]，并在巨噬细胞、T细胞和单核细胞的招募中起重要作用[9］．

CCR5对免疫反应的重要性取决于刺激的类型;此外，在某些情况下，补偿机制覆盖了CCR5表达和功能的缺失。值得注意的是，CCR5可能在免疫反应中发挥的作用远比在免疫细胞交通调节中重要[10］．

研究表明CCR5在基质细胞和造血细胞中的表达有助于肿瘤的转移。例如，CCR5参与软骨肉瘤转移[11]及口腔癌细胞迁移[12］．其表达与多发性骨髓瘤细胞生长、骨髓归巢和骨溶解相关[13］．

阿斯特及其同事[14表明t细胞ALL是一种主要由NOTCH1信号通路异常激活引起的疾病。在这种情况下，重要的趋化因子受体(如CCR5和CCR9)的表达和功能部分由t细胞ALL中的致癌NOTCH1亚型控制，调节原细胞恶性特性和髓外浸润的定位[15］．

此外，CCR5在侵袭性nk细胞白血病向患者肝脏转移中发挥关键作用，导致肝脾肿大和肝衰竭[16，17］．此外，Davies等人[18的G等位基因rs1799987多态性CCR5.在比较b细胞ALL的“最佳”和“最差”危险组时，与A等位基因相比，与更有利的最小残留疾病状态相关，并对预后特征进行了调整。考虑到较低的活动CCR5.在这种多态性存在下的启动子[19，这一证据表明获得性遗传和宿主遗传都影响对癌症治疗的反应。因此，CCR5可能在ALL发病机制和预后中发挥作用。

已知rs333在CCR5.，一种常见的32碱基对缺失(Δ32)，导致淋巴样细胞表面这种受体的截断和丢失，在纯合子基因型内质网中完全保留，或在杂合子基因型中表达减少[20.］．的CCR5.研究已经证明了Δ32突变的重要性，特别是在艾滋病毒感染易感性方面[21]，因为CCR5是感染初期的一种辅受体，对艾滋病的发病至关重要[22］．

我们的研究小组已经报道了不同类型癌症中与免疫系统和肿瘤发展相关的多态等位基因变异。然而，并没有相关的数据CCR5./Δ32多态性对所有人群。在此背景下，本工作分析了rs333多态性CCR5.在巴西南部地区的所有患者中。

2.材料和方法

2．1．人类被试

在隆德里纳（Londrina大学）伦敦普拉纳（CAAE 171231134.0000.5231）中批准批准（CAAE 171231134.0000.5231），将个人纳入该研究，由父母从父母与儿童使用的获得的书面知情同意书有关青少年血样。七十九个患者入学，诊断标准是基于Londrina大学血液学系提出的指导方针。通过GBTli协议（巴西儿童白血病治疗方案-99）评估所有患者的复发风险状态，该癌症研究所提出的癌症治疗评估计划，并考虑到诊断年龄，白细胞计数，免疫蛋白酶型，骨髓以外的组织参与，以及对治疗的反应。对照组由80名健康个体组成，不含年龄和性别的肿瘤。

2.2。基因组DNA提取

根据制造商的说明，通过Biopur Mini Spin Plus套件（BioMetrix Diageostica，库里加比）从全血中提取基因组DNA。DNA在50次洗脱 μL MilliQ水和由Nanodrop 2000c分光光度计（Thermo Fisher Scientific Inc.，Wilmington，USA）量化的Limerized，波长为260/280 nm。将最终制剂储存在-20℃并用作聚合酶链反应（PCR）的模板。

2.3。优化CCR5的PCR

在隆德里纳州立大学DNA多态性研究与应用实验室，利用基因组DNA和特异性引物对基因分型方法(rs333)进行了优化CCR5.：底漆有意义: 5 ' ACC AGA TCT CAA AAA GAA 3 '和底漆反义: 5 ' CAT GAT GGT GAA GAT AAG CCT CA 3 ' (GenBank accession AF009962)。采用PCR-SSP法进行CCR5基因分型。使用1.25单位Taq聚合酶(Invitrogen公司，美国卡尔斯bad公司)在Mastercycler梯度热循环仪(Eppendorf, Hamburg，德国)中扩增样本。PCR条件为:94℃变性5 min, 94℃1 min, 58℃1 min, 72℃1 min, 35个循环，72℃延伸10 min。PCR产物(225 bp或193 bp)经聚丙烯酰胺凝胶(10%)分析，硝酸银(AgNO)染色_3.)．

2．4．统计分析

用列联表和Fisher精确检验计算基因型分布和等位基因频率的差异。被认为具有统计学意义的差异。通过计算各基因型的期望频率，并与观察值进行卡方检验，检验Hardy-Weinberg均衡的拟合优度。

3.结果

分布CCR5.两种和对照组的等位基因符合Hardy-Weinberg均衡的假设（)．对照组和ALL患者的平均年龄分别为10.8±5.65岁和8.7±6.20岁，主要来自高加索人群，由于欧洲殖民。

尽管ALL组中男性(53.16%)比对照组(48.75%)略高，但患者和对照组的性别和性别匹配。50例(63.29%)为高复发危险组，29例(36.71%)为低复发危险组。可能观察到的基因型CCR5.rs333多态性如图所示1．

基因分型结果显示两组中均未发现Δ32缺失的纯合子个体。8.75%为CCR5/Δ32杂合子基因型()及7.5% ()。以确定是否有统计学上显著的风险增加的所有发展与进行logistic回归分析(表1)，结果显示，携带一个Δ32变异等位基因的个体并不存在all相关风险。ALL患者中Δ32在rs333位点的等位基因频率与对照组无统计学差异(； ；)．

此外，我们比较了CCR5.根据复发情况将ALL患者分为高危或低危。在5名(7.5%)ALL Δ32携带者中，3人被列为高危患者。然而，两种复发状态之间的相关性研究未达到统计学意义。

的CCR5.按性别对ALL患者和对照组的基因型分布进行分层。亚组分析显示，性别差异的影响无显著性差异CCR5.基因型（女性所有与女性控制，； ，男性ALL和男性对照组，； )．

4.讨论

趋化因子及其受体是免疫活动的关键调节因子，同时也可能在恶性肿瘤中发挥相互冲突的作用。虽然这些受体和趋化因子的大多数组合在癌症中是活跃的，但该领域的许多发现强调趋化因子CCL5及其同源受体CCR5 [23］．

与炎症相关的趋化因子和趋化因子受体基因的基因变异可能与癌症的起始和进展有关[24］．考虑到CCR5/Δ32等位基因频率在世界范围内的显著差异，本研究旨在调查CCR5/Δ32等位基因的遗传变异CCR5.在所有患者和对照组中。

本研究中患者的年龄为ALL的预期年龄，ALL常见于儿童和年轻患者。此外，如前所述，两个样本组主要由来自巴西南部的高加索人组成。然而，由于巴西人口的高度通婚和使用基因标记来正确表征个体的需求[25，26在我国，这些数据还没有被探索与变异分析的关系。

趋化因子和趋化因子受体是可能影响ALL进展和定位的因素[15］．32碱基对核酸缺失CCR5.存在并导致构成第二细胞外环的氨基酸发生移码突变。这种缺失导致蛋白质过早的截断，使其无法转移到细胞膜上，损害细胞表面的表达和配体结合，并导致细胞膜受体缺失，从而可能影响白细胞的转运[27］．

基于此，我们假设CCR5将其配体粘合的能力和将致病性T细胞的信号募集到靶组织中，因此可以赋予所有保护。尽管患者和对照组的CCR5 / CCR5和CCR5 /Δ32基因型的频率没有差异，但是变体基因型对所有易感性没有影响。

这些结果在不同疾病的研究中得到了证实，如利什曼病、乳腺癌、喉癌、甲状腺癌和脑癌，这些研究也发现，在健康受试者和巴西南部人群患者中，这些等位基因的频率没有差异[28- - - - - -30.]和全世界[31.- - - - - -33.］．

密集的多牙化疗方案和风险分层治疗的引入显着提高了所有人的治愈率。当前风险分配模式是不完美的，因为一些孩子被归类为较低风险并用更少的治疗复发治疗，而其他儿童视为更高的风险可能会过度治疗[34.］．在这种情况下，趋化因子受体中的遗传多态性可以预测结果，并且被认为是分层和分配治疗的独立危险因素。

根据GBTLI LLA-99协议定义的临床和实验室诊断结果，超过一半的ALL患者被归类为高危组[2］．当对分层组ALL的基因型数据进行分析时，结果表明Δ32的存在并不影响该临床参数。同样，我们研究组最近的一项研究也没有发现肿瘤抑制因子之间的关联TP53和趋化因素CXCL12多态性和所有复发风险状况[35.］．

5.结论

了解ALL的细胞和分子机制对开发新的血液肿瘤治疗方法至关重要。尽管rs333多态性与CCR5.我们认为，当前的研究必须导致更好地定义宿主-肿瘤关系，特别是关于免疫应答和CCR5和ALL发展的相互关系。考虑到目前病例对照相关性研究的样本量，强有力的结论是不可能的;然而，未来涉及更大病例的研究可能会确定CCR5/Δ32等位基因与ALL发病机制的临床意义的缺失。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

作者想要感谢使这项研究成为可能的志愿者，隆德里纳大学医院和巴西隆德里纳癌症研究所，感谢他们的合作。本研究由Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)， Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)， Fundação Araucária do Paraná， secreia da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior (SETI)，教育基金会Infância e Adolescência (FIA/PR) e秘书处Família e Desenvolvimento社会(SEDS)，以及隆德里纳州立大学本科学习协调(PROPPG-UEL)。

参考文献

1. M. Belson, B. Kingsley, and a . Holmes，“儿童急性白血病的风险因素:综述”，环境健康展望第115卷第1期1，页138-145,2007。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
2. 印加人，2014年估计:巴西的癌症发病率， INCA，里约热内卢de Janeiro，巴西，2013。
3. F. Balkwill，《癌症与趋化因子网络》自然评论癌症，第4卷，第4期。7、2004年。视图:谷歌学术搜索
4. J. Vandercappellen, J. Van Damme, S. Struyf，《CXC趋化因子及其受体在癌症中的作用》，癌症的信号，第267卷。2，页226 - 244,2008。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
5. D. Aldinucci和A. Colombatti，“炎症趋化因子CCL5与癌症进展”，炎症介质， 2014年第1期，文章编号292376,12页，2014年。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
6. C. J. Raport, J. Gosling, V. L. Schweickart, P. W. Gray, and I. F. Charo，“RANTES的一种新的人类CC趋化因子受体(CCR5)的分子克隆和功能特性，MIP-1β, MIP-1α”,生物化学杂志号，第271卷29，页17161 - 17166,1996。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
7. M. Samson, O. Labbe, C. Mollereau, G. Vassart，和M. Parmentier，“一种新的人类cc趋化因子受体基因的分子克隆和功能表达”，生物化学第35期11，页3362-3367,1996。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
8. P. prost, A. Wuyts和J. van Damme，《趋化因子在炎症中的作用》，临床与实验医学第26卷第2期4，页211-223,1996。视图:谷歌学术搜索
9. P. Spagnolo，E.A.Renzoni，A. U. Wells等，“C-C趋化因子受体5基因变异与肺病中的肺病，”美国呼吸和重症监护医学杂志第172卷第1期6，页721-728,2005。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
10. e。Weiss, A. Schmidt, D. Vobis等，“foxp3介导的cd95l表达抑制使调节性T细胞能够抵抗激活诱导的细胞死亡。”免疫学杂志，卷。187年，没有。4，pp。1684-1691,2011。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
11. C.-h.唐，A. Yamamoto，Y.-t.林，Y.-c。Fong，和T.-w.TAN，“基质金属蛋白酶-3中的CCL5 / CCR5途径中的基质金属蛋白酶-3的参与”生化药理学，第79卷，第5期。2，页209-217,2010。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
12. J.-Y。壮族,W.-H。Yang H.-T. Chen et al.，“CCL5/CCR5轴促进人类口腔癌细胞的运动，”细胞生理学杂志号，第220卷。2，第418-426页，2009。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
13. E. MENU，E. de Leenheer，H. de Raeve等，“CCR1和CCR5在宿主中的作用和多发性骨髓瘤的生长和骨质溶血性病变的发展：5TMM模型的研究，”临床和实验转移，第23卷，第2期。5-6，页291 - 300,2006。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
14. J. C. Aster, W. S. Pear，和S. C. Blacklow，“白血病中的Notch信号”，《病理年刊:疾病机制》，第3卷，第587-613页，2008。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
15. L. Mirandola, M. chiriva - interni, D. Montagna等人，“Notch1通过控制cc趋化因子受体5和9调控T细胞急性淋巴细胞白血病中的趋化和增殖。”病理学杂志第226卷第226期5, pp. 713-722, 2012。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
16. H. Makishima, T. Ito, N. Asano等，“趋化因子受体表达在侵袭性NK细胞白血病中的意义”，白血病第19卷第2期7，页1169-1174,2005。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
17. H. Makishima, T. Ito, K. Momose等，“侵袭性nk细胞白血病中的趋化因子系统和组织浸润”，白血病的研究第31卷第1期9，第1237-1245页，2007。视图:谷歌学术搜索
18. S. M. Davies, M. J. Borowitz, G. L. Rosner等人，“b -前体急性淋巴细胞白血病儿童最小残留疾病反应的药物遗传学:来自儿童肿瘤学小组的报告，”血号，第111卷6, pp. 2984-2990, 2008。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
19. D. H.M.Mcdermott，P.A.Zimmerman，F.Guibiabard，C.A.Kleeberger，S.F. leitman和P.M.Murphy，“CCR5启动子多态性和HIV-1疾病进展”《柳叶刀》第352期9131，第866-870页，1998。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
20. M. Chelli和M. Alizon，“CCR5趋化因子受体截短形式的反式显性负作用的决定因素”，生物化学杂志第276卷第2期50，页46975-46982,2001。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
21. E. M. V. Reiche, M. A. E. Watanabe, A. M. Bonametti等，“巴西南部人群中健康献血者、HIV-1暴露的血清阴性和HIV-1血清阳性个体中人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1) CCR5-Δ32缺失的频率”，国际分子医学杂志第22卷第2期5，第669-675页，2008。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
22. A. P. Galvani和J. Novembre，“CCR5-Delta32 hiv耐药突变的进化史”，微生物和感染，第7卷，第5期2，页302-309,2005。视图:谷歌学术搜索
23. P. Weitzenfeld和A.本Baruch，“趋化因素系统，其CCR5和CXCR4受体，作为癌症个性化治疗的潜在目标”癌症的信, 2013年。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
24. C. Kucukgergin, F. K. Isman, S. Dasdemir等，“趋化因子和趋化因子受体基因变异在膀胱癌易感性和临床病理特征中的作用”基因，第511卷，第5期。1，页7-11,2012。视图:谷歌学术搜索
25. V. R. Arruda, C. E. Grignolli, M. S. Gonçalves等，“来自巴西的不同种族群体中谷胱甘肽s -转移酶mu (GSTM1)和theta (GSTT1)缺失等位基因纯合性的流行:与环境致癌的相关性?”临床遗传学第54卷第5期3, 1998。视图:谷歌学术搜索
26. F. C. Parra, R. C. Amado, J. R. Lambertucci等人，《巴西人的颜色和基因组祖先》，美国国家科学院的诉讼程序号，第100卷。1，页177-182,2003。视图:谷歌学术搜索
27. J. S. Maier-Moore, C. A. Cañas, G. Tobón等，“CCR5 delta 32多态性(rs333)与哥伦比亚人的干燥综合征或1型糖尿病无关，”临床免疫学第一四八卷第一百四十八期2, pp. 206-208, 2013。视图:谷歌学术搜索
28. S. M. Muxel, S. D. Borelli, M. K. Amarante等人，“Paraná，巴西北部HLA-DRB1高加索人群中CCR5 delta 32多态性的关联研究”临床实验室分析杂志第22卷第2期4，页229-233,2008。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
29. K. Brajão de Oliveira, E. M. Vissoci Reiche, H. Kaminami Morimoto等人，“巴西皮肤利什曼病人群中CC趋化因子受体5 delta32多态性分析”皮肤病理学杂志第34卷第3期1，页27-32,2007。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
30. M. N. Aoki, A. C. D. S. do Amaral Herrera, M. K. Amarante, J. L. do Val Carneiro, M. H. P. Fungaro, M. A. E. Watanabe，“CCR5和p53密码子72基因多态性在乳腺癌发展中的意义”，国际分子医学杂志，第23卷，第2期。3，第429-435,2009。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
31. N. Degerli, E. Yilmaz和F. Bardakci，“在土耳其人群中，CCR5基因的Δ32等位基因分布及其与某些癌症的关系，”临床生物化学第38卷第2期3，页248-252,2005。视图:出版商网站|谷歌学术搜索
32. K. Guleria, S. Sharma, M. Manjari等人，”p。TP53和CCR5的R72P、PIN3 Ins16bp多态性32名北印度乳腺癌患者，”亚太癌症预防杂志，第13卷，第2期7, pp. 3305-3311, 2012。视图:谷歌学术搜索
33. A. Zafiropoulos, N. Crikas, A. M. Passam, and D. A. Spandidos，“CCR2-64I和CXCL12-3a在散发性乳腺癌发展中的重要参与，”医学遗传学杂志号，第41卷。5, p. 59,2004。视图:谷歌学术搜索
34. D. T. Teachey和S. P. Hunger，“预测儿童急性淋巴细胞白血病复发风险”英国血液学杂志，第162卷，第162号5, pp. 606 - 620,2013。视图:谷歌学术搜索
35. a . de Lourdes Perim, R. L. Guembarovski, J. M. Oda等，“CXCL12和TP53基因多态性作为巴西儿童急性淋巴母细胞白血病(ALL)易感性标记”，分子生物学报告，卷。40，不。7，pp。4591-4596,2013。视图:谷歌学术搜索

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