斑马鱼模型炎症消退过程中中性粒细胞迁移的漂移扩散分析

摘要

必须从炎症部位移除嗜中性粒细胞以进行炎症。最近在斑马鱼的工作已经表现出中性粒细胞可以远离炎症部位，以及原位模具。调节反向迁移过程的信号具有相当大的兴趣，但仍然是未知的。我们希望在反向迁移期间研究中性粒细胞的行为，看他们是否以相同的方式从引用的时尚中迁离发炎的网站，因为它们的迁移的固有随机组成部分足以解释这种行为。在转基因斑马鱼幼虫中使用中性粒细胞驱动的光电可逆性Kaede蛋白，我们能够在通过尾流量横断生产生的炎症部位特异性地标记嗜中性粒细胞。这些中性粒细胞随时间的位置被观察到使用具有两个单独模型的回归方法来观察并配合：纯扩散和漂移扩散方程。虽然模型假设测试（F-test)表明，数据点可以用漂移-扩散模型拟合，这意味着一个fugetaxis过程，模型的动态模拟表明，中性粒细胞从伤口的迁移更适合用零漂移，“扩散”过程来描述。这对理解反向迁移和炎症部位中性粒细胞滞留的机制具有启示意义。

1.介绍

炎症程序完成后中性粒细胞的命运对急性炎症发作的结果至关重要，并可决定伤口是否迅速愈合或慢性炎症和组织损伤的发展。被招募到炎症部位的中性粒细胞可能会离开炎症部位或死亡原位［1］．最被广泛接受的中性粒细胞处置机制是中性粒细胞程序性死亡或凋亡，随后巨噬细胞摄取和清除(在[2])。最近，还提出了其他路线;中性粒细胞可从炎症部位进入血流(“反向转运”[3.])，通过通过其他组织的迁移(“逆行趋化”或“逆向迁移”[4- - - - - -6])，或消失在炎性渗出物中[7，8］．目前对反向迁移过程的理解在其他地方进行了回顾[9］．不确定性在活的有机体内单个细胞的命运在一定程度上与炎症消退过程中难以跟踪单个细胞有关在活的有机体内．转基因斑马鱼模型正在成为脊椎动物免疫研究的关键模型[10并可对单个细胞和细胞群进行直接成像和跟踪，从而确定它们的命运在活的有机体内．使用转基因系统，其中嗜中性粒细胞表达荧光蛋白kaEDE，显着的是其在暴露于光线上改变荧光特性的能力，我们评估了炎症中性粒细胞的序列作为炎症分辨。虽然其他人已经使用类似的系统来标记免疫细胞群的响应较小的刺激[6，目前还没有关于尾部横断后炎症消退过程中中性粒细胞迁移模式的详细研究。

利用基于漂移扩散方程的动态建模技术，我们检验了以下假说:中性粒细胞被局部产生的前溶解剂引导离开伤口区域，或者中性粒细胞对现有的趋化因子梯度停止响应，并作为随机迁移行为的特征重新分布。

2.方法

2．1．试剂，斑马鱼线和维护

除非另有说明，所有试剂均来自Sigma-Aldrich (Poole, UK)。斑马鱼按照标准规程饲养[11］．的TG（LYZ：GAL4）I252［12),s1999t Tg (UAS:枫)［13在其他地方也有描述。

2．2.显微术，光转换和图像处理

对于共聚焦显微镜，Perkin Elmer Ultra视图VoX人队6 fr激光共焦成像系统(美国珀金埃尔默公司)和倒置的奥林巴斯IX81显微镜,装有六个二极管激光线和一个日本横河CSU-X1旋转磁盘,用于捕获图像14-bit滨松C9100-50电子Multiplying-Charged几个设备(EM-CCD) peltier-cooled相机(滨松光子学INC .),通过适当的过滤器。对于荧光显微镜，使用尼康Eclipse TE2000-U倒置复合荧光显微镜(尼康英国有限公司)和滨松1394 ORCA-ERA(滨松光电公司)。使用Volocity构建5.3.2捕获图像。Perkin Elmer Ultra视图附着在上述显微镜上的光动装置，使用405 nm激光线对Kaede蛋白进行光转换。该设备使用覆盖有荧光荧光墨水(stabo Boss)的玻璃显微镜载玻片(Menzel-Gläzer)作为可感光的基片(根据制造商说明)进行校准。利用40%激光能量对405 nm激光线进行120次光转换。然后将胚胎从琼脂糖凝胶中释放并转移到新鲜E3中。装有胚胎的培养皿被锡纸包裹以防止背景光转换。在指定的时间点，胚胎再次安装和广域荧光z堆。Volocity根据荧光强度、大小和“单独接触物体”特征进行中性粒细胞分割。测定每个荧光细胞在每个时间点的XY位置。

2．3.中性粒细胞行为的动力学模型

中性粒细胞质心坐标及时出口到MATLAB（MATHWORKS，MA），进行分析。为了定量描述简单随机步道模型的中性粒细胞，漂移扩散和纯扩散变体的群体动态（[14详情请参阅补充资料，网址为doi: 10.1155/2012/792163)。利用这些模型中确定的参数，每个模型的行为通过蒙特卡罗程序进行模拟，并将模拟的细胞种群分布与观测数据进行比较。

3.结果与讨论

３．１．描述了逆向迁移的过程在活的有机体内

在斑马鱼模型中已经描述了反向迁移，要么进入循环，要么回到组织中[4- - - - - -6，15］．为了确定炎性中性粒细胞的命运，我们在伤口边缘附近(约80微米)进行光转换(图)1(a)尾鳍横断引起炎症后的特定时期。。然后在复合荧光显微镜上进行延时视频显微镜，并在Volocity中跟踪单个细胞的位置。Kaede蛋白和它的光转换形式保持稳定和可检测的时间远远超过这些实验(数据未显示)。

在超过500小时的观察中，没有发现光转化的中性粒细胞离开鱼的伤口，进入血液循环，或通过血液循环迁移到遥远的地方。中性粒细胞在损伤后8小时左右从损伤部位移出(图)1(b))。在16小时的时间内，可以看到光转化的中性粒细胞从损伤部位移走(补充电影1可在网上找到http://dx.doi.org/10.1155/2012/792163)．在4hpi时，中性粒细胞密集地聚集在损伤部位周围，但随着时间的推移，中性粒细胞群体似乎扩散到周围组织。每个细胞到伤口边缘的距离随时间变化的图显示了一种独特的中性粒细胞运动模式:中性粒细胞的行为似乎受到了限制，逐渐增加到伤口的平均距离，速度低于其最大允许速度(图)1(c))。这些发现与其他研究小组的不同之处[6有许多潜在的解释，包括使用不同的启动子，不同的伤害方案和不同的标记系统。

３.２．炎症高峰期后中性粒细胞继续被招募

在哺乳动物炎症反应中，中性粒细胞内流在炎症反应早期停止，至少在兔肺炎模型中[16］．中性粒细胞Kaede模型使我们能够区分存在于炎症部位的中性粒细胞的行为与那些细胞的行为在被招募的过程中。图中的蒙太奇1仅显示红色光电旋转中性粒细胞。在延时期间，还使用针对绿色荧光优化的滤波器组进行图像。鉴定的绿色嗜中性粒细胞是4 HPI损伤部位不存在的细胞。这些细胞的行为表明，损伤后四小时仍然募集到炎症部位（图2)．在4hpi的损伤部位没有看到绿色的中性粒细胞，因为所有在场的细胞都被光转化了。从6hpi到14hpi损伤部位有绿色中性粒细胞的聚集。随后，受伤部位的绿色中性粒细胞数量下降。通过观察单个细胞，可以准确地确定炎症过程中中性粒细胞的积累模式。与哺乳动物标记细胞技术相比，该技术在检测持续内流方面具有更高的敏感性，这可能解释了从兔子肺炎模型中看到的差异，在炎症发作开始后不久内流就不再检测到[17］．

3.3。中性粒细胞积极迁移（“漂移”）朝向伤口迁移

随机步行模型通常用于生物学，以描述个人和人群的运动动态[14，18]，特别是细胞运动模式[19- - - - - -21］．在较短的时间尺度上，中性粒细胞表现出相关的随机游走行为。然而，这些局部相关性会随着时间的推移而减弱。我们的数据观察间隔时间大于典型的中性粒细胞持续时间[22]，因此我们可以忽略这些局部相关性，应用一个简单的随机漫步模型[18］．为了识别中性粒细胞运动中任何明显的全局方向偏差，应用简单随机行走模型来聚合数据。通过建立所有中性粒细胞在尾鳍横断后4小时的位置，并使用漂移扩散方程模拟它们的行为，研究了中性粒细胞的主动募集(趋化性)及其反向募集(逸散性)的贡献。检测非光转换中性粒细胞，以确定在光转换时不在伤口部位的中性粒细胞的行为。将漂移扩散方程拟合到数据集上，将中性粒细胞视为点对象，并询问它们的行为是否像简单的粒子随机重新分布(“扩散”)，或是否存在向或远离化学梯度(趋化性或逸散性)的积极运动元素。方程(补充数据中的完整描述)生成漂移系数的值，其中非零值反映了主动而不是纯粹的随机迁移。从时间和细胞距离伤口的平均距离之间的线性关系估计漂移(图)3.)．在6个独立的实验中，系数估计的值在0.11到0.95之间μm / min(表1)．正如预期的那样，在所有的病例中，细胞群都表现出向伤口的积极漂移，与趋化过程指导的迁移一致。

3．4．中性粒细胞从伤口的迁移最好用零漂移“扩散”过程来描述

对尾鳍横断后4小时，光转换时出现在伤口部位的光转换细胞进行了同样的分析(表)2)．图中比较了漂移扩散和纯扩散模型拟合情况4．数学测试适合的两个模型表明drift-diffusion模型安装更好的与数据,但我们警惕drift-diffusion模型可能出现的可能性比由于更好的二次符合模型真正的能力,比简单线性符合噪声数据。使用模型数据比较了漂扩散和纯扩散模型的中性粒细胞随时间的预测分布，得出了一个戏剧性的结果:漂扩散模型的细胞群模式随着时间的推移远离伤口(图)5，红线)，与观察数据相反，其中模式保持接近伤口(图5，黄条）。纯扩散模型精确地捕获了这种定性行为，更准确地反映出随时间的观察到中性粒细胞的分布（图5这表明，随机再分配可能最好地描述了炎症消退过程中中性粒细胞的行为模式。

对于这些研究中使用的较大伤口，我们的数据支持炎症消退过程中中性粒细胞的随机重新分布。然而，为了明确证明这一点，将需要更先进的建模技术。对于较小的伤口，可以采用不同的原则。先前的研究表明，离开伤口的中性粒细胞与到达伤口的中性粒细胞遵循相同的动力学，具有相同的速度和方向[15］．然而，这些数据依赖于直接离开伤口的轨迹的预先选择，考虑到整个细胞群，可能会给出不同的研究结果。

这种方法使用每个中性粒细胞的静态点数据;另一种方法是使用单独的轨迹数据来研究动态。这种方法已被应用于活细胞中的蛋白质[23，24),并在活的有机体内黑素瘤细胞轨迹[25］．需要注意的是，当考虑细胞轨迹作为一种幼稚的方法可能错误地表示轨迹方向的短期相关性为偏差迁移。此外，为了识别轨迹，需要更快的观察采样，这必须与整个实验运行时间相平衡。

虽然纯扩散模型似乎适合数据，但它一致地低估了与伤口相邻的光电衰减的数量，表明一些细胞在伤口部位处主动保留。完全解决这将需要开发包含多种模型的系统，以反映在单个人群中存在的中性粒细胞行为的动态组合。

4.结论

从这一分析中，我们得出结论，在炎症反应中调节中性粒细胞数量的两个关键的中性粒细胞迁移行为——中性粒细胞进出伤口——在性质上是不同的过程。中性粒细胞被积极地招募到损伤部位(“漂移”)，但当炎症消退时，它们的移动更好地模拟为随机再分配(“扩散”)。这对我们理解在疾病状态下中性粒细胞是如何留在炎症部位有意义。

致谢

作者感激地承认这项工作得到了英国工程和物理科学研究理事会(EPSRC)的支持;欧洲研究理事会高级研究员奖;MRC高级临床研究员(S.A.R.)(参考编号:G0701932);及MRC中心补助金(G0700091)。显微镜研究是由威康信托基金资助的MBB/BMS光学显微镜设备(GR077544AIA)。

补充材料

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