1。介绍
中性粒细胞炎症项目完成后的命运至关重要的结果集的急性炎症,可以确定是否有及时愈合伤口或慢性炎症和组织损伤的发展。中性粒细胞炎症招募网站离开或死亡
原位(
1]。最广泛接受的中性粒细胞处理机制是细胞程序性死亡或凋亡的嗜中性粒细胞巨噬细胞吸收和清除紧随其后(了
2])。最近,其他路线提出了;中性粒细胞可能远离发炎部位进入血液(“反向轮回”(
3]),通过迁移其他组织(“逆行趋化性”或“反向迁移”(
4- - - - - -
6]),或丢失到炎性渗出物(
7,
8]。当前的理解反向迁移他处的过程(
9]。不确定性的
在活的有机体内单个细胞的命运在一定程度上涉及单个细胞在炎症后的困难解决
在活的有机体内。转基因斑马鱼模型正在成为一个关键模型研究脊椎动物免疫(
10),并允许单个细胞的直接成像和跟踪,和人口的细胞允许决定他们的命运
在活的有机体内。使用转基因系统,中性粒细胞表达荧光蛋白枫,引人注目的能力改变荧光特征对光照,我们已经评估了命运的炎症性中性粒细胞炎症解决。尽管其他人使用一个类似的系统标签响应较小刺激免疫细胞数量(
6),还没有详细研究后中性粒细胞炎症期间迁徙模式的分辨率尾巴横断。
使用动态建模技术基于drift-diffusion方程,我们测试了竞争假设中性粒细胞被proresolution定向远离伤口区域代理当地生产或者停止应对现有的趋化因子梯度和重新分配随机特性的迁徙行为。
2。方法
2.1。试剂、斑马鱼和维护
所有试剂均来自Sigma-Aldrich(英国Poole),除非另有说明。斑马鱼是维护根据标准协议(
11]。的
i252 Tg (lyz: Gal4)(
12),
s1999t Tg (UAS:枫)(
13)行描述。
2.2。显微镜、Photoconversion和图像处理
共焦显微镜,珀金埃尔默超
视图VoX人队6 fr激光共焦成像系统(美国珀金埃尔默公司)和倒置的奥林巴斯IX81显微镜,装有六个二极管激光线和一个日本横河CSU-X1旋转磁盘,用于捕获图像14-bit滨松C9100-50电子Multiplying-Charged几个设备(EM-CCD) peltier-cooled相机(滨松光子学INC .),通过一个适当的过滤器。荧光显微镜,尼康Eclipse TE2000-U倒化合物荧光显微镜(尼康英国有限公司)使用1394 ORCA-ERA滨松(滨松光子学Inc .)。使用Volocity构建5.3.2捕获图像。珀金埃尔默超
视图趋光性设备,与之前描述的显微镜,用于photoconvert枫蛋白使用波长405纳米的激光线。设备是校准使用的玻璃显微镜幻灯片(Menzel-Glazer)覆盖着荧光记号笔油墨(Stabilo老板)作为photobleachable衬底(按照生产厂家的说明书)。Photoconversion执行使用40%的激光能量120波长405纳米的激光线的周期。琼脂糖凝胶的胚胎被释放和转移到新鲜的E3。包含胚胎的培养皿在锡纸包裹,以防止photoconversion背景。时间点显示,胚胎再次安装和宽视野荧光Z-stacks。中性粒细胞在Volocity分割进行了基于荧光强度,大小和“单独的触摸对象”功能。每个荧光细胞的XY位置在每个计算确定。
2.3。中性粒细胞行为的动态模型
中性粒细胞质心坐标的时间出口到Matlab (MathWorks, MA)进行分析。定量地描述中性粒细胞的种群动态,drift-diffusion和pure-diffusion使用简单的随机游走模型的变体([
14)网上看到全部细节补充材料doi: 10.1155 / 2012/792163)。使用参数中确定这些模型,每个模型的行为进行了实验,使用蒙特卡罗模拟程序和模拟细胞群的分布与观测数据。
3所示。结果与讨论
3.1。描述反向迁移过程中体内<斜体> < /斜体>
反向迁移,进入流通或回组织,被描述在斑马鱼模型(
4- - - - - -
6,
15]。为了定义炎症中性粒细胞的命运,我们photoconverted中性粒细胞伤口附近的边缘(约80微米)(图
1(a))在定义时期启动炎症后尾翼横断。延时videomicroscopy上执行一个复合荧光显微镜,在Volocity和单个细胞的位置跟踪。枫蛋白质和其photoconverted形式保持稳定和可检测远远超出这些实验的持续时间(数据没有显示)。
炎症性中性粒细胞展览限制移民离开组织损伤。3 dpf从转基因斑马鱼胚胎表达枫在中性粒细胞受到尾翼横断在麻醉下使用无菌手术刀。4个小时的胚胎被找到。在损伤胚胎4小时后安装在0.5%低熔点琼脂糖对激光共焦成像系统(珀金埃尔默公司)。趋光性的设备被用来photoconvert在场中性粒细胞在尾翼。Photoconversion是根据描述的方法(120 40%波长405纳米的激光能量周期),并执行延时videomicroscopy使用TE2000荧光倒置显微镜(尼康)。(一)合成图像的DIC覆盖红色和绿色荧光通道显示代表斑马鱼尾巴(下图)之前(上图)和之后photoconversion。(b) DIC的蒙太奇图像覆盖的红色荧光通道然后尾翼受伤后时间点表示。photoconverted细胞的再分配清晰可见。(c)为每个嗜中性粒细胞在六个人鱼,从伤口的距离计算中使用的算法Volocity,商议与时间。
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超过500小时的观察,没有见过photoconverted粒细胞离开鱼从伤口进入循环,或通过循环迁移到一个遥远的网站。中性粒细胞被迁移网站的伤害从伤后8小时(图
1(b))。Photoconverted中性粒细胞迁移离开网站可以看到受伤的16个小时延时(补充电影1网上doi: 10.1155 / 2012/792163)。在现病史4,中性粒细胞人口累积在受伤的地方,但在延时的时间人口的中性粒细胞似乎蔓延到周围组织。情节的每一个细胞从伤口边缘的距离与时间显示一个独特的中性粒细胞运动模式:中性粒细胞似乎是约束自己的行为,从伤口逐渐增加他们的平均距离,速度低于其最高速度将允许(图
1(c))。这些发现和其他组织之间的差异(
6)有许多可能的解释,包括使用不同的启动子,不同的协议,受伤和标签系统。
3.2。峰值后还在招募中性粒细胞炎症
在哺乳动物炎症,在炎症反应的早期中性粒细胞流入停止,至少在兔肺炎模型(
16]。中性粒细胞枫模型允许我们区分中性粒细胞的行为出现在网站的炎症过程中这些细胞的行为被招募。图中的蒙太奇
1只显示红色photoconverted中性粒细胞。延时期间,图像也使用过滤器集优化绿色荧光。绿色中性粒细胞识别细胞,不在现场受伤的现病史4。这些细胞的行为表明,中性粒细胞还招募了炎症的损伤(图4小时后
2)。没有绿色的中性粒细胞在网站看到受伤的4因为所有在场的细胞photoconverted的快乐指数。有绿色的中性粒细胞的积累现场受伤的现病史现病史6至14。这后,绿色的中性粒细胞的数量在现场受伤的瀑布。在哪里可以看到单个细胞,随着时间的推移,中性粒细胞炎症期间积累的模式可以准确地确定。这种技术增加了敏感性检测哺乳动物labelled-cell技术相比,继续涌入,这也许可以解释的差异从兔肺炎模型,涌入不再检测到起始的炎症发作后不久
17]。
在高峰炎症,新中性粒细胞招募受伤的网站。使用蒙太奇照片产生的延时数据图
1(b)和补充电影1,使用GFP filterset成像,显示中性粒细胞受伤的招聘网站同期内。可以看到绿色的中性粒细胞积累现场受伤的6至14小时后受伤。
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3.3。中性粒细胞积极迁移(“漂移”)向一个伤口
随机游走模型通常用于生物学描述个人和群体的运动动力学(
14,
18),尤其是对细胞运动模式(
19- - - - - -
21]。在短时间尺度中性粒细胞展览相关的随机游走行为。然而,这些当地的衰减随时间变化的相关性。之间的时间我们的数据观测大于典型的嗜中性粒细胞持久性倍(
22),因此我们可以忽略这些本地相关性并应用一个简单的随机游走模型(
18]。识别任何全球定向偏差明显的中性粒细胞的运动,简单的随机游走模型应用于聚合数据。活动招募中性粒细胞的趋化性的贡献及其反向(fugetaxis)检查通过建立所有的中性粒细胞的位置在4小时后尾翼横断并使用drift-diffusion方程模拟他们的行为。Non-photoconverted中性粒细胞检查来确定中性粒细胞的行为不是在伤口网站photoconversion时。拟合drift-diffusion方程数据集对中性粒细胞的点对象,问他们是否表现得像简单的粒子重新分配随机(“扩散”)或是否存在一个元素活跃的运动朝向或远离化学梯度(趋化性或fugetaxis)。方程(完整描述补充数据)生成一个值漂移系数,为非零值反映了积极而不是纯粹的随机迁移。漂移的估计时间和平均细胞之间的线性关系距离伤口(图
3)。6个独立的实验中,系数估计的价值从0.11到0.95不等
μm / min(表
1)。正如所料,在所有情况下细胞群展示活动转向伤口,符合迁移由趋化现象的过程。
估计模型的漂移系数drift-diffusion描述细胞迁移到伤口。
| 数据集 |
漂移系数(std dev)。 |
| (1) |
−0.85 (0.13) |
| (2) |
−0.95 (0.06) |
| (3) |
−0.11 (0.02) |
| (4) |
−0.32 (0.02) |
| (5) |
−0.48 (0.08) |
| (6) |
−0.37 (0.06) |
| 所有的数据 |
−0.35 (0.03) |
积极Nonphotoconverted中性粒细胞迁移到伤口。(a)随时间变化意味着细胞距离的伤口nonphotoconverted(绿色)中性粒细胞,观察到每个主题1 - 6(黑线)。覆盖在每个图是平均距离的预测得到的线性模型用于描述初始漂移(红线)。观察的时间测量从一开始就开始损伤后4小时。主题6中的细胞计数(右下角)很低,有时零附近的数据集,这解释了缺失的部分。(b)数据和模型相结合对所有科目。
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3.4。中性粒细胞迁移从伤口更好的描述一个零点漂移,“扩散”的过程
同样的分析photoconverted细胞出席的伤口photoconversion时,4个小时后尾翼横断(表
2)。Drift-diffusion pure-diffusion模型适合比较图
4。数学测试适合的两个模型表明drift-diffusion模型安装更好的与数据,但我们警惕drift-diffusion模型可能出现的可能性比由于更好的二次符合模型真正的能力,比简单线性符合噪声数据。使用建模数据比较中性粒细胞的预测分布随着时间的推移,通过应用drift-diffusion与纯扩散模型做了一个戏剧性的结果:drift-diffusion模型的细胞群模式从伤口(图
5红线),与观测数据,模式仍然接近伤口(图
5、黄酒吧)。pure-diffusion模型准确地捕捉到这定性行为,更准确地反映了观察中性粒细胞分布(图
5蓝线),这表明随机分配最好描述中性粒细胞的模式行为在炎症决议。
估计系数的drift-diffusion模型和pure-diffusion模型细胞迁移距离伤口(标准差在括号中给出)。一个
F以及值> 5表明drift-diffusion模型应该首选pure-diffusion模型。
| 数据集 |
Drift-diffusion模型 |
Pure-diffusion模型 |
F以及 |
| 漂移系数 |
扩散系数 |
扩散系数 |
| (1) |
0.25 (0.05) |
−4 (10) |
27 (2) |
38 |
| (2) |
0.27 (0.07) |
23日(15) |
56 (4) |
28 |
| (3) |
0.19 (0.05) |
13 (10) |
32 (3) |
14 |
| (4) |
0.21 (0.05) |
32 (11) |
54 (3) |
14 |
| (5) |
0.35 (0.07) |
−8 (14) |
55 (4) |
82年 |
| (6) |
0.27 (0.03) |
−7 (6) |
31日(2) |
145年 |
| 所有的数据 |
0.26 (0.02) |
8 (3) |
41.8 (0.10) |
267年 |
炎症性嗜中性粒细胞的行为可以安装pure-diffusion和drift-diffusion模型。细胞(a)的均方距离与时间伤口的photoconverted(红色)数据集1 - 6的中性粒细胞。还显示在每个情节都是适合相对应的线性模型和零点漂移pure-diffusion drift-diffusion模型(蓝线)和(红线)。(b)数据和模型相结合对所有科目。
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模拟揭示了一个pure-diffusion模型是一个更好的适合真正的数据。drift-diffusion模型(红色线)对应于漂移(0.26
μ8.0米/分钟)和扩散(
μm / min)和pure-diffusion模型(蓝线)对应于扩散(41.8
μm / min)模拟1000次。模拟被用来产生一个分布的空间分箱数据模型。细胞分布空间的平均值是红色和蓝色线所示,分别为(伤口的距离)。覆盖在这些相应的直方图表示(黄色)的数据(结合超过所有的鱼)。直方图箱宽度100
μm和集中在50岁
μm - 950
μ从伤口。pure-diffusion模型显示了正确的定性预测的细胞分布而drift-diffusion模型预测,人口模式远离伤口随着时间的推移,与观测数据。
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在这些研究中使用的大伤口,我们的数据支持随机分配的中性粒细胞炎症期间解决。然而,要明确证明这将需要更先进的建模技术。对于较小的伤口,可以申请不同的原则。先前的研究已经表明,中性粒细胞留下伤口遵循相同的动力学与到达,拥有相同的速度和方向(
15]。然而,这些数据依赖预选跟踪直接留下伤口,给不同的结果,研究考虑整个人口的细胞。
这种方法为每个嗜中性粒细胞使用静态点数据;另一种方法是使用个人跟踪数据研究动态。这种方法被应用到蛋白质在活细胞
23,
24),并
在活的有机体内黑色素瘤细胞跟踪(
25]。护理时需要考虑细胞跟踪作为一个天真的方法可以在跟踪方向偏向迁移misrepresentshort-term相关性。此外,识别跟踪需要更快的抽样观测必须平衡总实验运行时。
虽然pure-diffusion似乎适合的数据模型,它一直低估photoconverted细胞的数量剩余毗邻伤口,暗示一些细胞正在积极保留伤口部位。完全解决这个问题需要系统包含多个模型的开发,以反映的动态混合嗜中性粒细胞行为呈现在一个人口。