文摘

血管生成是b细胞的发病机制慢性淋巴细胞白血病(CLL)和高微血管密度被发现在慢性淋巴细胞白血病与不良预后有关。在这项研究中,我们评估患者血清脂联素水平在69年比奈B-CLL阶段,和这些值进行回顾性与骨髓(BM)微脉管面积和血清血管内皮生长因子(VEGF)水平,纤维母细胞生长因子2 (FGF-2),血管生成素,PECAM-1 (CD31),矩阵metalloproteinase-9 (MMP-9) interleukin-8(引发)syndecan-1的百分比 或 慢性淋巴细胞白血病细胞。血清脂联素水平之间的正相关,VEGF ( )不转化为增加的程度BM血管生成( ),FGF-2 ( ),血管生成素( )和CD31 ( )血清浓度。因此,引发( ),syndecan-1 ( )和MMP-9 ( )循环水平不可能反映脂联素浓度。此外,患者脂联素水平较高的有一个更有利的生物形象定义为较低的数字 ( ; ), ( ; )。最后,我们评估的存在在B-CLL细胞脂联素基因表达水平。脂联素基因转录的RMA强度值表示齐次B-CLL细胞低表达,而VEGF成绩单是高度表达一定程度的interpatient可变性。总的来说,这些数据似乎表明,脂联素可以作为抗血管新生因子参与B-CLL。

1。介绍

血管生成是B细胞的发病机制慢性淋巴细胞白血病(CLL)和高微血管密度被发现在慢性淋巴细胞白血病与不良预后相关(1]。一些血管生成生长因子参与慢性淋巴细胞白血病的发病机制。血清血管内皮生长因子(VEGF)和纤维母细胞生长因子2 (FGF-2)在慢性淋巴细胞白血病患者中,升高和VEGF水平高还预测疾病进展早期慢性淋巴细胞白血病(2- - - - - -4]。包括216名慢性淋巴细胞白血病患者的一项研究显示,那些有更高浓度的VEGF受体2 (VEGFR-2)外周血淋巴细胞的生存都很短(5]。血管生成素表达在慢性淋巴细胞白血病细胞和B细胞正常的捐赠者,尽管它的表达式是在B细胞慢性淋巴细胞白血病白血病细胞与正常B细胞(6]。会友et al。7]演示的upregulation缺氧诱导因子- 1α(HIF-1 )在慢性淋巴细胞白血病,这表明局部组织缺氧是慢性淋巴细胞白血病微脉管的另一个重要催化剂扩散。最后,基质金属蛋白酶(MMPs)有重要的作用在血管生成和Bauvois et al。8)发现慢性淋巴细胞白血病患者的MMP-9水平显著高于健康对照组。

,脂肪tissue-derived肽脂联素是由脂肪细胞分泌,模仿许多代谢行为的胰岛素(9]。此外,脂联素是一个监管机构obesity-induced能源体内平衡和发挥作用的胰岛素抵抗和相关并发症(10]。

最近,它已经建立了一个角色脂联素在心血管系统的体内平衡。脂联素激活腺苷酸激酶(AMP-K)内皮细胞,导致增强体内血管生成在小鼠人工基底膜塞和兔角膜化验,并抑制半胱天冬酶3-mediated细胞凋亡在内皮细胞体外培养11,12]。否则,Brakenhielm et al。13)表明,脂联素抑制内皮细胞迁移和增殖的体外和体内neoangiogenesis小鸡胚胎绒毛膜尿囊的膜(CAM)和角膜化验以及血管生成减少和诱导肿瘤细胞凋亡。

目的是探讨脂联素参与血管生成在B-CLL,我们评估患者血清脂联素水平在69年比奈阶段慢性淋巴细胞白血病,和这些值进行回顾性与骨髓微血管面积和血清VEGF水平,FGF-2,血管生成素,PECAM-1 (CD31) MMP-9, interleukin-8(引发)syndecan-1, CD的百分比 或ZAP - 慢性淋巴细胞白血病细胞。最后,我们评估了脂联素和VEGF在B-CLL细胞在基因表达水平。

2。材料和方法

2.1。慢性淋巴细胞白血病患者的人群

两个独立的一系列以前未经治疗的比奈阶段慢性淋巴细胞白血病患者进行调查。第一个系列包括69例遵循医学Catanzaro肿瘤科;第二组包括60比奈阶段慢性淋巴细胞白血病患者从合作数据库具体设计了调查慢性淋巴细胞白血病细胞的基因表达分析。

2.2。评估患者血清脂联素水平的特点

选择六十九例基于冷冻血清样本的可用性。他们的平均年龄是64岁(范围、40 - 83),男女比例是41至28日。

2.3。脂联素和其他细胞因子的测量

血清脂联素浓度测定在重复定量夹心酶免疫测定(ELISA)技术(人工脂联素Quantikine比色ELISA, R & D系统,明尼阿波利斯,明尼苏达州,美国)。校准进行了与人类脂联素水平。光学密度在450纳米测量微量滴定板的读者。标准曲线是由策划的对数平均吸光度的标准与细胞因子浓度的对数。浓度是表达 g / mL,变异系数(CV)报告的风琴制造商interassay和intraassay决定范围从6.9%到8.8%,从2.5%提高到4.7%,分别。血清血管内皮生长因子(VEGF)、FGF-2,血管生成素,PECAM-1 (CD31) MMP-9,引发水平测量定量ELISA (Quantikine;R & D系统,明尼阿波利斯,明尼苏达州,美国)。血清syndecan-1浓度测定血清免疫反应性使用定量夹心酶免疫测定(ELISA)技术(贝桑松syndecan-1 ELISA、Diaclone研究、法国)。

2.4。BM测量血管生成

所有的血管都显示在6 - 米的部分4% paraformaldehyde-fixed石蜡包埋切片染色内皮细胞与antifactor VIII-related抗原小鼠单克隆抗体M616 (IgG1;Dako、斯特鲁普、丹麦)和三层biotin-streptavidin前面描述过氧化物酶系统(3]。巨核细胞很少也沾因素VIII-related抗原很容易区分的形态和大小。微血管计数进行评估(4 - 6) 每部分字段(几乎覆盖整个部分)和2部分活检在叠加平方十字线的484点 米 /字段。微血管(即。,capillaries and small venules) were identified as tubes with a single layer of endothelial cells, either without or with a lumen not exceeding 10  m。平面的分值的方法应用于微血管计数只有横向分段占据十字线的交集点。

2.5。zap - 70的检测

单核细胞(跨国公司)在慢性淋巴细胞白血病病例隔离Ficoll-Hypaque (Seromed, Biochrom公斤,柏林,德国)密度梯度离心法,沾CD19-PE和CD3 PE-CY7(美国加州圣地亚哥,正欲),和固定和修复permeabilized &烫试剂(美国加州伯林盖姆Caltag实验室)的浓度 细胞/ 50 l细胞随后被暴露于攻击和FITC - 70马伯共轭(克隆2 f3.2,北部,普莱西德湖,纽约,美国),分析了流式细胞术(正欲FacsCalibur)。一个CD33 FITC (Becton Dikinson) mAb的IgG1子类作为负控制zap - 70 (14]。

2.6。CD-38评价

直接执行immunofluorescent染色CD19 FITC / PE、CD23 PE、CD38 PE, Cy-Chrome (Becton Dickinson & Co .,加州森尼维耳市,美国)。CD19 FITC、CD23 PE和CD5 Cy-Chrome被用来评估慢性淋巴细胞白血病细胞悬浊液的比例;CD38-positive白血病细胞的比例是由三重染色CD19 FITC, CD38 PE, CD5 Cy-Chrome。分析了细胞使用FACS-sort流式细胞分析仪(Becton Dickinson & Co)。

2.7。基因表达

T细胞、NK细胞和单核细胞被从PBMNC CLL患者CD3、CD56、CD16, CD14单克隆抗体(mAb)治疗(美国加州圣地亚哥,正欲)其次是磁珠(山羊Anti-Mouse免疫球蛋白g D ynabeads Dynal生物技术ASA,奥斯陆,挪威)。B细胞的纯度是评估通过流式细胞仪测定的比例CD5 / CD19 CD23三重积极的B细胞在悬浮。得到了纯化正常外周血B细胞从六个正常的捐助者。总RNA分离使用试剂盒试剂(生命技术公司,罗克维尔市,医学博士,美国),然后使用RNeasy纯化总RNA隔离设备(美国加州试剂盒,瓦伦西亚)。人类基因组杂交,制备biotin-labeled cRNA GeneChip U133A数组(Affymetrix Inc .,加州圣克拉拉,美国)和扫描的芯片(7 g扫描仪,Affymetrix公司,圣克拉拉,加州,美国)进行了根据制造商的协议。图像进行分析使用Affymetrix GeneChip操作软件(GCOS) 1.4,和探针水平数据被转换为表达式值使用健壮的Multiarray Bioconductor函数平均(RMA)过程中,完美匹配值的背景调整使用quantile-quantile标准化和规范化,如前所述[14]。表达数据的60 B-CLLs专有数据库存入国家生物技术信息中心的基因表达综合(地理;http://www.ncbi.nlm.mih.gov/geo),可通过地理系列加入GSE11038数量

2.8。统计数据

斯皮尔曼相关系数,Mann-Whitney测试和修正 c测试被用于比较组。

3所示。结果

3.1。慢性淋巴细胞白血病患者脂联素浓度

比奈一期患者血清脂联素水平介于1.1和22.0之间 5.88 g / mL(中位数 g / mL)。在健康的时代,sex-matched控制中值为5.4 克/毫升(范围1.2 - -11.8 g / mL)。总的来说,没有区别可以发现在慢性淋巴细胞白血病患者和健康对照组(Mann-Whitney测试, )。有趣的是正常对照组或慢性淋巴细胞白血病患者身体质量指数(BMI) 30公斤/ 。

3.2。脂联素与其他血管生成因素之间的相关性

为了评估潜在的血管生成脂联素在慢性淋巴细胞白血病,我们与其他血管生成因素的相关性分析。血清脂联素水平反映了VEGF浓度( ; ;参见图1);然而,这样的一个协会并没有转化为增加患者骨髓血管生成的程度更高的脂联素水平。患者在27个可用的数据我们没有展示任何微脉管区域之间的联系和脂联素( )。类似的行为观察FGF-2 ( ),血管生成素( )和CD31 ( )的血清浓度没有变化的函数脂联素的水平。因此,引发( ),syndecan-1 ( )和MMP-9 ( )循环水平不可能反映脂联素浓度。


图1
血清脂联素和VEGF水平之间的相关性。分析代表一个重要的直接相关( ; )。
3.3。脂联素在慢性淋巴细胞白血病、生物形象

考虑到CD的转录特征 慢性淋巴细胞白血病细胞的VEGF水平CD相比高出2 - 3倍 细胞(15),我们寻求CD38-expression与脂联素浓度之间的相关性。血管生成活性低脂联素也反映在逆相关性CD38和脂联素( ; ;参见图2)。此外,患者脂联素水平较高的有一个更有利的生物形象定义为一个较低的ZAP -的数量 细胞( ; )。


图2
血清脂联素水平之间的相关性和百分比CD38-positive B-CLL细胞。分析代表一个显著的负相关( ; )。
3.4。评价脂联素在慢性淋巴细胞白血病和VEGF基因转录

我们发现脂联素的存在在B-CLL细胞在基因表达水平。脂联素基因转录的RMA强度值表示B-CLL均匀低表达的细胞(图3(一个))。同样的不适用VEGF成绩单是高度表达一定程度的interpatients可变性(图3 (b))。

(一)
(一)
(b)
(b)
图3
脂联素的绝对RMA强度值(ADIOQ) (a)和VEGF (b)记录在60 B-CLL病人通过微阵列分析评估。

4所示。讨论

在这项研究中我们没能证明proangiogenic B-CLL脂联素的作用。事实上,脂联素和血清VEGF水平之间的正相关关系在这样的病人不转化为增加其他参数参与血管生成,如BM微脉管,FGF-2血清浓度,血管生成素,引发,syndecan-1, CD31、MMP-9。

我们之前已经展示了血清VEGF浓度增加和现代预后因素之间的联系在b细胞慢性淋巴细胞白血病(16]。使用高速细胞排序和随后的基因表达图谱,胡椒et al。15]研究了纯化的转录特征CD 和CD 从慢性淋巴细胞白血病患者和子集CD38的VEGF水平增加了2 - 3倍+细胞。逆循环的脂联素水平之间的相关性和CD38或zap - 70表达,观察到在这项研究中,表明B-CLL患者血清脂联素水平可能不那么咄咄逼人的表现型。

最后,评估脂联素和VEGF基因转录,我们演示了一个齐次低B-CLL细胞脂联素基因的转录表达,而VEGF成绩单和一定程度的高度表达interpatient可变性。这些结果表明,白血病细胞的作用是非常有限的生产循环脂联素的水平。相反的两个脂联素受体1 (AdipoR1)和AdipoR2 mRNA表达的高度(慢性淋巴细胞白血病细胞14]。脂联素对细胞增殖的影响是否可能是最有可能的脂联素受体介导还在慢性淋巴细胞白血病和其他模型目前还不清楚(17]。

血管生成是由分子之间的平衡,有积极的和消极的监管活动,导致血管生成开关的概念,这个概念依赖于增加生产一个或更多的积极的监管机构的血管生成(18]。内皮细胞营业额在健康成年人机体低,静止被维护的主要在血管生成刺激内源性血管生成抑制剂的影响。在病理情况下血管生成可能引发不仅proangiogenic生产过剩的因素,但也的差别,对这些基因的抑制因素。B-CLL,赞成的平衡和抗血管新生因素似乎在其发病机制有重要作用。凯et al。19]表明B-CLL细胞表达支持,抗血管新生的分子,和Shanafelt凯(20.)观察,比proangiogenic FGF-2和反血管增生血小板反应蛋白- 1 (TSP-1)与治疗的时间。结扎TSP-1受体似乎诱导caspase-independen CLL b细胞凋亡的死亡,即使发生这些细胞cocultured自体骨髓基质细胞和成纤维细胞,因此这表明血管生成开关与b细胞慢性淋巴细胞白血病的临床进展。

在这项研究中提出的数据似乎表明,抗血管生成治疗因素b细胞脂联素可能参与慢性淋巴细胞白血病。我们的数据是符合这些发表的Bora et al。21),表明脂联素作为抗血管新生小鼠模型的蛋白质激光脉络膜新生血管形成,抑制VEGF mRNA的表达和蛋白质的脉络膜的组织。最后,从et al。22]表明,脂联素抑制VEGF-stimulated人类冠状动脉内皮细胞迁移通过营地/ PKA-dependent信号,对监管的作用和重要影响血管过程中脂联素与糖尿病和动脉粥样硬化相关。

良好,血管生成表型结果从积极和消极监管机构之间的不平衡因素,这样的贡献“古典”和/或“模”血管生成因素可能发挥不同的作用在血管生成表型的定义23]。在这种背景下,脂联素可以被视为一个“模”的血管生成因子。的详细知识的作用机制和表达以及交互的新“非经典的“内源性血管生成的监管机构与他们的受体将提供新见解,对未来发展至关重要的化合物,它可以调节这些新活动“非经典的“内源性监管者和可能潜在的抗肿瘤活性。事实上,肿瘤和其他血管生成病态利用冗余机制,诱导血管生成,和中和的多种因素,包括“古典”和“模”监管机构可能需要抑制肿瘤的生长。临床医生angiogenesis-modulatory属性的识别常见的药物是重要的血管生成抑制疗法的发展和未来的应用。

确认

支持部分MIUR(普林斯顿2007),罗马,意大利和基金会Cassa di Risparmio di普利亚,意大利巴里。