汞中毒对B细胞信号体的影响是不同的

摘要

有人认为，环境中接触汞会导致自身免疫性疾病。BCR信号通路的中断与中枢耐受和自身免疫的失败有关，我们之前已经证明低水平的汞^2＋干扰BCR信号。在本报告中，我们使用了多参数磷流式细胞术，以及一种新颖的Overton算法的推广，从一到二维单峰分布，同时监测低水平汞的影响^2＋WEHI-231 B细胞中ERK和BCR信号通路上游元件的激活我们发现，在接触了低水平的汞之后^2＋在美国，只有大约三分之一的电池对这种金属敏感。对于那些敏感的细胞，我们证实了我们早期的工作，即ERK的激活减弱，但现在报告Hg^2＋对Btk酪氨酸激酶的上游影响不大。另一方面，我们发现Syk酪氨酸激酶的上游信号实际上是增强的，B细胞信号体支架蛋白BLNK的上游激活也是如此。

1.介绍

汞是一种有效的免疫毒剂。早期实验表明，接触高或中等水平的汞可通过坏死或凋亡导致免疫细胞死亡。幸运的是，接触高浓度汞的情况不再常见，但仍有很大一部分人继续接触低浓度汞。与高水平接触汞相比，低水平接触汞与免疫细胞死亡无关，而是与以免疫增殖和自身免疫为特征的免疫紊乱有关[1，2]．

如今，在美国，大多数汞暴露是由于食用了被有机汞污染的海鲜。还有报道称，作为大多数加工食品的主要成分，高果糖玉米糖浆通常含有高得惊人的无机汞(Hg)^2＋)和低浓度汞^2＋受辐射影响的情况现已引起关注[3.]．然而，即使从饮食中摄入有机汞，大多数也会相当快地代谢成汞^2＋，因此随着时间的推移，大脑或脾脏等器官中的汞负担通常包括无机和有机物种，即使在接触仅限于有机汞的条件下[4，5]．事实上，对正常人的研究，以及已知意外接触到高水平有机汞的人的研究表明，最终脾脏和大脑中约70%的总汞负担是以无机汞的形式存在的[6，7]．最重要的是，研究结果表明，只接触有机汞的小鼠，汞^2＋作为有机汞代谢的结果，而不是残留的有机汞，是直接介导自身免疫炎症反应的汞物种。换句话说，在自身免疫性疾病和炎症过程中^2＋是活性代谢物[8，9]．

原则上，自身免疫性疾病可能是由于中枢耐受控制的遗传缺陷或环境干扰所致，中枢耐受是免疫系统中和自我反应的未成熟淋巴细胞克隆的机制。在未成熟的B细胞中，B细胞受体(BCR)复合物信号通路对这一过程至关重要[10，11]．事实上，已经证明BCR信号的抑制与B细胞室中中枢耐受性的诱导失败之间存在直接联系，从而导致成熟自身免疫B细胞克隆的增加[12]．暴露于低水平(非免疫抑制水平)的关联在活的有机体内或者触发免疫细胞死亡在体外Hg的)^2＋自身免疫提示Hg^2＋可能以某种方式干扰未成熟B细胞的信号转导通路，从而损害中枢耐受。

whi -231是一种具有良好特征的小鼠B细胞系，具有许多未成熟B细胞的特征。特别是，与成熟B细胞相比，BCR的刺激与有丝分裂和增殖增加相关，WEHI-231在响应BCR刺激的过程中类似于不成熟B细胞的生长阻滞和凋亡[13，14]．我们之前已经证明，WEHI-231暴露在低水平的汞中^2＋干扰BCR信号通路触发生长阻滞和细胞凋亡[15]．此外，在未成熟的B细胞中，BCR信号导致的生长阻滞和凋亡依赖于ERK的激活[16]．我们在WEHI-231中表明，尽管ERK似乎不是一个直接的目标，但汞的低水平暴露^2＋减弱BCR信号传导过程中ERK1/2的激活[17，从而表明Hg^2＋作用于BCR信号转导通路的上游元件，最初抑制ERK激活，随后在BCR参与激动剂配体后抑制生长和凋亡[17]．

Phosphoflow cytometry是一项相对较新的技术，在研究免疫细胞，特别是B细胞磷酸化依赖的信号通路方面已被证明远远优于传统的western blotting技术[18- - - - - -21]．在下面的实验中，我们利用多参数磷流式细胞术在单个细胞的基础上同时量化BCR信号转导通路中几个不同元素的活性。通过捕获汞中多种相关的磷酸化模式^2＋BCR刺激WEHI-231细胞，使我们对Hg的作用机制有了深入的了解^2＋低暴露水平与B细胞中BCR信号转导通路的上游元件相互作用。

2.材料和方法

2．1．试剂

HgCl₂(纯度≥99.5%)从Aldrich Chemicals (St. Louis, MO)获得。

2．2．细胞

WEHI-231细胞来自美国型培养收集(Manassas, VA)。在含l -谷氨酰胺的RPMI 1640 (HyClone, Logan, UT)中维持，并添加10%胎牛血清(FBS, HyClone)， 50μM -巯基乙醇和1X抗生素抗真菌溶液(Mediatech, Herndon, VA)在5% CO的湿化₂的气氛。细胞每周传代两次，浓度为细胞/毫升。用台盼蓝排除法观察细胞活力。

2．3.抗体

小鼠免疫球蛋白mu链多克隆山羊亲和纯化抗体购于mp - biomedical- cappel, Solon, OH。用于磷酸化ERK1/2、Syk、BLNK和Btk细胞分析的荧光标记抗体购自BD生物科学公司(San Jose, CA)。

２.４.Phosphospecific流式细胞术

计数WEHI-231细胞，在无血清RPMI培养基中洗涤，于细胞/mL，有无不同浓度的HgCl₂在聚丙烯管。随后,将细胞加入含有mu链特异性的山羊抗小鼠免疫球蛋白的试管中。细胞在37°C孵育特定时间。刺激结束时(0.5、1、5或10分钟)，加入等体积的4%多聚甲醛，pH 7.4, 37℃孵育10分钟，固定细胞。用Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)稀释细胞，离心成球，在90%甲醇中重悬，然后在冰上孵育至少30分钟以渗透质膜。通过渗透处理后，将细胞制成颗粒，去除甲醇，然后在样品缓冲液(Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水、1%胎牛血清和0.1%叠氮化钠)中洗涤两次。根据制造商的说明，将细胞重悬在含有针对ERK1/2、Syk、BLNK或Btk磷酸化残基的荧光标记抗体的抗体鸡尾酒中。细胞置于冰中孵育1 ~ 2小时，用样品缓冲液洗涤3次。细胞置于4°C的黑暗环境中，直到Beckman-Coulter Cyan ADP流式细胞仪分析。

2．5．数据分析

对于所有实验，每个样本获得10,000个事件，最初使用Sumit (Beckman Coulter;佛罗里达州迈阿密)和/或FlowJo (Tree Star;亚什兰或)软件。使用Excel(微软;和Sigma图(Systat软件;圣何塞，CA)软件。对于任何荧光标记的细胞群，平均荧光指数(MFI)被定义为细胞群的中值荧光强度。

3.结果与讨论

3．1.WEHI-231 B细胞BCR信号通路中ERK激活的磷特异性流式细胞术分析

在我们之前关于汞对BCR信号转导影响的研究中，我们采用了western blotting技术，表明ERK激活受损[17]．然而，我们认为应用较新的磷特异性流式细胞技术可能会更好地描述汞的影响^2＋BCR信号。因此，我们首先采用磷特异性流式细胞术研究对照WEHI-231细胞中erk1 /2 BCR激活的动力学。ERK1/2是丝氨酸/苏氨酸激酶，在B细胞中是BCR信号转导途径的中心，在BCR信号转导后通过典型苏氨酸/酪氨酸基元的双磷酸化被激活[22]．在图1，如材料和方法部分所述，对WEHI-231细胞进行或不进行抗mu (25μg/mL)刺激BCR。每隔一段时间，用双磷酸化erk1 /2 (anti-pERK)的荧光标记抗体或同型对照抗体检测细胞。然后用磷酸盐特异性流式细胞术检测erk1 /2的活化水平。在图1(一)每个图代表BCR刺激后的不同时间。图中红线为未添加anti-mu的对照直方图，绿线为此时BCR激活细胞的直方图。最初这两条曲线重叠，然后随着erk1 /2在受刺激细胞中被激活而开始分离。最大的分离出现在5分钟标记，之后他们一起移动，因为erk1 /2激活减弱。

由BCR刺激引起的ERK活化动力学可能在图中更容易理解1 (b)．在图1 (b)，对于每个已被抗perk(受激或未受激)探测的细胞的分布，如图所示1(一)的平均荧光指数(Mean Fluorescence Index, MFI)，定义为该分布的中位数荧光强度。然后在每个时间点，绘制出未处理细胞的MFI与BCR刺激细胞的MFI的差异。然后将同样的程序应用于用同型对照抗体探针的细胞，并绘制出抗mu处理的细胞和未处理的细胞的MFI差异。

一般来说，由于检测的细胞数量较多，流式细胞术测定的MFI群体差异往往非常显著。例如，正态分布变量的中位数的标准误差是1.25,在那里σ是分布的标准差，和独立测量的次数。如图所示的分布1(一)(以及在本文的其他数字)σ但由于每个分布代表约10,000个细胞，标准误差约为mfi的1%。

另一种评价图中MFI测量的重要性的方法1 (b)要注意的是，在图1，荧光强度测量与实际荧光信号的对数成正比。因此，MFI中相对较小的变化往往是显著的。通过比较图中所示的直方图1(一)MFI差异如图所示1 (b)，很明显，在2.5 - 15分钟的所有时间点，处理细胞的直方图与对照细胞有显著差异。也就是说，对于本实验来说，至少2个对照组和BCR刺激的细胞之间的MFI差异是有意义的。

数字1结果表明，在WEHI-231中，pERK对BCR抗mu刺激的最大反应发生在约5分钟，之后趋于基线水平。然而在图1我们在25处使用反muμg/mL刺激BCR。这个最初的25μg/mL数据基于我们以前使用该系统的经验[17]．然而，我们使用的抗mu试剂是一种多克隆抗体，在激动剂反应中存在批量变化的可能性。为了确保我们使用了适当浓度的刺激抗体，如图所示2我们研究了最大pERK反应在5分钟作为一个函数的刺激抗体浓度。因此，用不同浓度的抗mu处理细胞5分钟，然后利用图中抗pERK试剂用流式细胞仪检测pERK水平1，或同型对照抗体。然后将每种抗mu浓度的pERK和同型对照染色谱与未使用抗mu处理的细胞的染色谱进行比较，确定并绘制MFI的差异。

3．2．与反mu相比，低浓度的汞^2＋仅微干扰BCR信号通路中ERK和Syk的活性

酪氨酸激酶Syk是ERK上游BCR信号通路的重要组成部分。在BCR信号转导过程中，已知ERK的激活依赖于Syk的激活，并且，与ERK一样，Syk的活性通过酪氨酸磷酸化而增加[22，23]．在以后的实验中，我们将观察汞的影响^2＋因此，为了控制目的，我们测量了由Hg诱导的激活ERK和Syk (pERK和pSyk)的水平^2＋，单独，在没有特异性BCR信号的情况下，通过与BCR结合的anti-mu诱导。分别用(0μ2.5 g / mL,μg / mL, 5μg / mL) Hg^2＋，和，在不同的时间点加入汞^2＋，用不同荧光标记的抗perk和抗psyk染色。我们之前已经证明用浓度为5μg / mL HgCl₂处理10分钟会导致细胞汞负担^2＋大概是1毫微克/10⁷而这种细胞负担最大程度地影响BCR信号传导[17]．我们通过碘化丙啶的吸收测定在体外Hg^2＋对WEHI-231细胞(NS)无毒性，但相似在活的有机体内Hg^2＋负担对小鼠脾细胞没有毒性[24]．利用磷特异性流式细胞术同时检测pERK和pSyk。在10分钟标记时，在一些未用汞处理过的细胞上加入抗mu^2＋．5分钟后，在15分钟标记时，同样用磷特异性流式细胞术检测这些细胞的pERK和pSyk。未处理的细胞也用同型对照标记pERK和pSyk抗体，并用流式细胞术检测。

pERK和pSyk的结果如图所示3(一个)和3 (b)，分别表示为用磷特异性抗体标记的细胞与用相应的同型特异性对照标记的细胞之间MFI的变化。用抗-mu刺激的细胞在15分钟时显示为单条图，以与用汞处理的细胞区分开来^2＋，显示为线图。相对于抗mu诱导的BCR信号，Hg^2＋单独对ERK或Syk几乎没有影响。

3．3.汞含量低^2＋WEHI-231细胞在BCR介导的信号转导过程中，减弱ERK的磷酸化，增强Syk和BLNK的磷酸化，但对BTK的磷酸化影响不大

接下来我们研究了汞的影响^2＋在BCRERK的上游信号。BCR信号传导是一个复杂的过程，至今仍未被完全了解。然而，人们普遍认为，在抗原与BCR复合物结合后不久，多分子簇形成开始，随后B细胞受体信号体的组装[23，25]．在大多数情况下，信号体的结构完整性是由BLNK支架蛋白固定的，其结合其他信号体成分的能力是由特定BLNK残基的酪氨酸磷酸化介导的。这些残基是Btk、Lyn和Syk激酶的底物，在自催化的方式下，这些激酶的活性水平，特别是Syk，反过来在一定程度上受到它们是否与BLNK结合的调控[23]．

磷特异性流式细胞术的优点之一是它能够同时监测单个细胞中磷酸化依赖的信号通路中的多个元素。相应的数据4(一)- - - - - -4 (d)将WEHI-231细胞与汞或不与汞共孵育^2＋静置5分钟，然后用反穆刺激或不刺激。定时固定细胞，同时用多色磷特异性流式细胞术检测活化ERK (pT202/pY204)、Syk (pY436)、Btk (pY551)和BLNK (pY84)的水平。在每个plot中，细胞已与Hg预孵育^2＋与没有的细胞相比较。结果用加入抗mu后，有或未经抗mu处理的细胞MFI随时间的变化来表示。

数字4(一)表明汞^2＋减弱BCR信号转导过程中实现的正常ERK信号4 (b)表明汞^2＋实际上增强了塞克信号的强度。另一方面，BTK似乎不受影响，如Hg^2＋似乎对BTK反应的幅度或动力学没有任何明显的影响。最后，像Syk一样，BLNK的磷酸化被Hg增强^2＋．

虽然数据4(一)和4 (b)表明汞^2＋分别抑制和增强ERK和Syk的活化，很难分辨是否存在动力学上的差异。来评估汞^2＋改变了BCR信号过程中ERK或Syk激活的动力学，我们重新绘制了图中的数据4(一)和4 (b)在数据4 (e)和4 (f)．在图4 (e)我们绘制了未经Hg预处理的ERK和Syk(对照)细胞的MFI变化(在抗mu处理或未处理的细胞之间)^2＋．从图中可以看出，在控制条件下，ERK活化的动力学与Syk活化的动力学是相一致的。在图4 (f)我们画了相同的变量;只是这一次我们使用了接触汞的细胞的结果^2＋．这里很明显，尽管Hg^2＋暴露可能降低ERK反应的幅度(磷酸化)而增加Syk反应的幅度(磷酸化)，暴露对BCR信号转导过程中两种激酶激活之间的相位关系影响不大。

3．4．汞的影响分析^2＋单细胞水平上BCR信号转导过程中ERK和Syk的激活

虽然我们之前已经指出，磷特异性流式细胞术的优势之一是它可能允许在单个水平上分析信号事件，但在图中完成的分析中，我们没有利用这一点4．在图4我们减少了从流式细胞术中获得的复杂的原始数据集，从而只用四个数字来描述不同的细胞群，这四个数字是与ERK、Syk、BTK和BLNK磷酸化特异性抗体结合相关的mfi。汞的影响^2＋对BCR信号转导的影响基本上是通过在不同处理的细胞群中比较这些数字来确定的。然而，最初的数据缩减到小额信贷机构意味着数字4本质上是一种群体水平的分析，而类似的结果原则上可以使用西方印迹技术获得，尽管难度大得多，而且可能不太精确。

在图5我们分析了汞的影响^2＋但为了保存单个细胞的信息，必须放弃最初减少到mfi的过程。相应的图5(一个)是关于pSyk的2参数直方图(y-axis)和pERK (x-轴)为未处理过汞的WEHI-231细胞的对照群体^2＋或anti-mu。在这里，表达任何特定的pSyk, pERK值对的细胞数量与该区域图的密度成正比。因为图4说明反mu的最大反应(pERK或pSyk)发生在刺激后5分钟，如图所示5 (b)结果显示抗mu作用5min后WEHI-231细胞的2参数(pSyk, pERK)直方图。最后图5 (c)是用抗mu处理5分钟但也用Hg处理过的细胞的直方图^2＋．每个直方图被划分为象限，并表示每个象限中细胞种群的百分比。

在图5(一个)我们已经调整了象限设置，以便将97.03%的对照组人口描述为，,只有0.18%，．利用相同的象限设置，在反mu刺激5分钟后，这个变化到73.06%，和5.18%，．正如我们在图中所确定的4当细胞被汞中毒时^2＋，在抗mu刺激BCR后，未中毒细胞的pSyk和pERK的谱线被改变。这反映在图中5 (c)．BCR刺激后，为Hg^2＋中毒细胞在每个象限中的细胞百分比与未中毒细胞的百分比没有显著差异，但大部分分布似乎向较高的pSyk值和较低的pERK值移动。

通常在流式细胞术中，以单一荧光强度为特征的细胞群显示为一维直方图。为了分析在不同实验条件下产生的移动种群频率，经常使用奥弗顿算法将这些一维直方图彼此相减[26]．在我们的例子中，我们想分析汞的影响^2＋在BCR刺激后，细胞内pERK和pSyk水平同时发生的群体转移已经被可视化为二维直方图。虽然我们使用的是二维直方图，就像一维直方图一样，Hg的影响^2＋可以通过减去非中毒细胞的直方图进行分析(图5 (b))， Hg^2＋喝醉了的细胞(图5 (c))．

为了完成这个减法，我们将奥弗顿算法从一维推广到二维。结果如图所示5 (d)图中的离散区域已经根据右边的图例进行了编码。正数表示汞柱中细胞数过多的区域^2＋BCR刺激后，暴露人群相对于非暴露人群，而负值代表相反。这些数字的绝对值与绝对值差成正比，无论是正的还是负的。在一维的欧弗顿算法中，总阳性细胞数被求和，这个数除以总总数，定义为阳性细胞的百分比。用一个类似的程序，我们发现，在图中5 (d)在美国，汞中毒人群中有37.6%的细胞被指定为“阳性”细胞。

我们以前已经证明了WEHI-231 B细胞的中毒与低和无毒水平的汞^2＋(1 ng / 10⁷细胞)对ERK的直接影响很小。然而，在这些水平的汞^2＋干扰BCR信号转导，使ERK的激活减弱[17]．这些早期的实验依赖于western blot分析。图1、3(a)中的磷流式细胞术结果，4(a)完全支持这些先前的发现。因为在未成熟B细胞中BCR信号的抑制与成熟自身免疫B细胞克隆的增加之间存在直接联系[12]，在一定程度上WEHI-231 B细胞可以作为未成熟B细胞的模型，Hg^2＋ERK活化的衰减表明Hg^2＋中毒可能使一些自我反应的B细胞克隆逃避中枢耐受，并在成熟时导致自身免疫或自身免疫性疾病。

事实上，在这些实验和我们之前的工作中汞的含量都很低^2＋似乎对ERK的直接影响不大，提示Hg的靶标^2＋是ERK的上游，通过ERK上游BCR信号转导通路的至少一部分元件的信号也应该减弱。Syk就是其中一个可能的因素。它是BCR信号转导通路中作用于ERK上游的一种中央酪氨酸磷酸激酶，因此对于BCR信号的完整性和自我反应的未成熟B细胞克隆的最终消除是必要的[22，23]．我们对Syk在Hg中的活化的早期分析^2＋用western blot技术检测WEHI-231 B细胞是否中毒^2＋中毒减弱了Syk的激活[17]．然而，利用磷流式细胞术(图4 (b))现在很清楚地显示出Hg^2＋增强Syk的激活。

除了Syk，我们还研究了BCR信号转导通路中ERK上游的另外两个元件BLNK和Btk的磷酸化。BLNK是对B细胞信号体结构完整性非常重要的支架蛋白，它是BCR抗原参与的结果[23，25]．在BCR信号转导过程中，酪氨酸激酶Syk、Btk和Lyn对各种BLNK酪氨酸残基的磷酸化对信号体的正常形成和成熟是必要的，因为各种信号体成分专门识别并结合这些磷酸化基元(主要通过SH2结构域)[25]．由于Btk活化本身与酪氨酸551的磷酸化有关[27]，采用磷流式细胞术检测BLNK和Btk活性，以确定Hg的影响^2＋在BCR信号转导过程中对其活性的影响(图4 (c)和4 (d))．我们发现Hg^2＋在BCR信号转导过程中对Btk的激活作用不大，与Syk类似，BLNK的磷酸化作用明显增强。考虑到BLNK是Syk的底物，这是意料之中的。

另一方面，发现Syk的活化增强，而ERK的下游活化被Hg减弱^2＋有点令人惊讶，尤其是考虑到我们早期对T细胞的研究。BCR信号与T细胞受体(TCR)信号有很多共同之处。特别是，在T细胞中，TCR交联导致ERK的短暂激活，很像B细胞中BCR交联导致ERK的激活。我们发现T细胞中汞含量很低^2＋在TCR信号转导过程中ERK活化减弱[28]．在T细胞中，依赖于TCR的ERK激活依赖于Syk同源物磷酸酪氨酸激酶ZAP-70的上游激活。然而，在T细胞中，我们发现ERK被Hg衰减^2＋与ZAP-70和BLNK的支架蛋白同源物LAT的衰减有关[29]．

虽然数据4 (c)和4 (d)显示在BCR信号转导过程中，Hg^2＋ERK激活的依赖性衰减与Syk激活的增强相关，这些实验只说明了种群水平上发生的事情。问题是，这种相关性是否严格存在于细胞水平。利用用于生成Figure的相同数据集4,数据5(一个)- - - - - -5 (d)特别是利用磷流式细胞术同时检测单个细胞的Syk和ERK活性来回答这个问题。数字5(一个)是绘制对照组细胞中pSyk与pERK活性水平的二维直方图，而Figure5 (b)在被抗igm最大程度刺激的细胞中绘制pSyk与pERK的活性图。的比较数据5(一个)和5 (b)表明大多数细胞(约90%)通过增加Syk和ERK活性对BCR刺激产生反应。

数字5 (c)被抗igm刺激的细胞的pSyk和pERK直方图是否如图中所示5 (b)但它也被汞所陶醉^2＋．同样，大多数细胞似乎仍然对如图所示的抗igm有反应5 (b)，但分配似乎微妙地转向较低的pERK和较高的pSyk水平。这当然和Figure是一致的4这表明在人口水平上Hg^2＋平均而言，中毒导致pERK明显降低，pSyk水平升高。评估汞的影响^2＋在细胞水平上，我们使用了一个广义的Overton算法来减去图中的直方图5 (b)从图中可知5 (c)，得到图5 (d)．

当减去一维直方图时，通常只显示得到的阳性细胞的一维直方图。但是对于图中二维减去的直方图5 (d)我们展示积极的一面和消极的一面。我们将直方图上的阳性区域(用更亮的颜色表示)解释为Hg中更密集的细胞位置^2＋在BCR信号诱导后中毒群体的数量比对照群体的数量多。同样，柱状图的负区域(用较暗的色调表示)表示由于汞的存在而变得人口较少的细胞位置^2＋中毒。它们本质上代表了柱状图的区域，作为Hg的结果，单元格(在控件中)将从这些区域移动^2＋曝光。

在图5 (d)，阳性区和阴性区分离良好，阳性区pSyk较高，pERK较低。这一发现支持了Hg在细胞和种群水平上的观点^2＋中毒细胞抑制ERK活性与增强Syk活性相关。值得注意的是,在图5 (d)我们发现37.6%的细胞“阳性”。在这种情况下，我们将正面解释为只有37.6%的汞^2＋与对照组细胞相比，中毒细胞对BCR交联抑制ERK和增强Syk激活有反应。剩下的62.4%的汞^2＋中毒的WEHI-231细胞通过增强pERK和pSyk对BCR交联反应，就像它们没有暴露于汞一样^2＋．

总的发现是Hg^2＋乍一看，增强Syk的激活，同时又减弱ERK的下游激活，这让人有点困惑。然而，最近的一份报告表明，在B细胞中有两种功能上和拓扑上截然不同的ERK激活途径[16]．尽管两者都依赖Syk作为上游元素，但不久之后它们就分道扬镳了。第一个是之前描述的B细胞常见的途径[22，23，但假设该通路主要在成熟细胞中可操作。该通路的激活被认为会启动细胞增殖。第二个ERK激活途径被描述并假定在未成熟的B细胞中主要活跃。这条通路与细胞凋亡和克隆缺失有关。这两条途径的主要区别在于，第二条途径依赖于BCR介导的Icrac钙电流。如果Hg^2＋是通过干扰Icrac通道的上游调节剂来抑制钙信号，那么通过该途径的ERK激活可能仍然会减弱，即使通过Syk的上游信号增强。无论如何，Hg^2＋最初与B细胞靶点或Syk上游靶点相互作用，可能包括Icrac通道。

4.结论

WEHI-231 B细胞暴露于低水平汞后^2＋时，BCR启动的信号转导发生改变。单细胞水平分析显示ERK的激活被抑制，Syk的上游激活增强，BLNK的磷酸化增加。另一方面，Btk的激活不受影响。由于WEHI-231是未成熟B细胞的模型，抑制这些细胞中ERK的激活表明低水平暴露于汞^2＋也可能干扰初级未成熟B细胞的中枢耐受。我们认为中枢耐受性的干扰可能是低水平汞中毒与自身免疫性疾病的机制之一。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院的资助:ES019228 (AR)。感谢Raymond Mattingly博士对这篇论文的仔细阅读和深思熟虑的建议。

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