炎症与eb病毒感染是常见的重症肌无力胸腺的功能:在发病机制中可能的角色

文摘

胸腺中起着重要作用在重症肌无力(MG)。我们最近发现的一个持久eb病毒(EBV)感染在某些MG胸腺,结合数据显示,胸腺在大多数患者促炎的状态,支持病毒对MG的发病机制的贡献。本研究的目的是获得进一步的证据intrathymic MG患者的慢性炎症和EBV感染。转录分析低密度阵列和实时PCR显示超表达的基因参与炎症和免疫反应在MG胸腺。实时PCR EBV基因组,潜伏(EBER1, EBNA1 LMP1)和溶解性(BZLF1)成绩单,和免疫组织化学LMP1和BZLF1蛋白质证实积极intrathymic EBV感染,进一步支持了假设EBV可能导致出现MG或延续的自体免疫反应。总之,我们的结果支持炎症的作用和EBV感染MG胸腺的致病特点。

1。介绍

重症肌无力(MG)是一个良好的神经肌肉接头的自身免疫性疾病。在大多数情况下(> 80%),与生产相关的疾病是乙酰胆碱受体的自身抗体(乙酰胆碱受体),而损害神经肌肉传导导致肌肉无力和禁用易疲劳性。次数少、镁与抗体的存在肌肉特定激酶(麝香)受体(1]。剩下的MG病人作为anti-AChR seronegative-are消极和anti-MuSK抗体,虽然他们一定比例(66%)最近发现低亲和力anti-AChR抗体(2]。

大量的数据支持的参与胸腺与乙酰胆碱受体自身抗体MG的发病机制。明显病理改变的胸腺发生在超过80%的AChR-positive患者(1),包括胸腺增生中观察到的50 - 60% AChR-positive病例和变量比例的血清反应阴性的情况下(3- - - - - -5),胸腺瘤出现在10 - 15%的病例。胸腺增生包含b细胞浸润,可以组织成异位生发中心b细胞(GCs)形成毛囊(滤泡增生)或分布在胸腺髓质(弥漫性增生,也称为thymitis) [3]。10到20%的AChR-positive病例有萎缩性胸腺非常相似的年龄组的脂肪组织的数量和上皮和空间渗透B细胞的存在,在某些情况下形成残余岛屿的GCs髓薄壁组织(3,4,6),表明胸腺增生和免疫激活。

AChR-positive MG患者的胸腺包含所需的所有组件的启动和维持自身免疫反应:自身抗原,表达了对纤维肌肉的细胞(7),胸腺上皮细胞(tec) [8),专业的抗原递呈细胞(9),AChR-specific T细胞(10),和浆细胞产生anti-AChR抗体(11]。胸腺介入MG发病机理的迹象,胸腺切除术导致稳定缓解AChR-positive高比例的病人(见[12包括和引用)。

遗传和环境因素都参与了MG的病因。病毒感染的主要环境因素疑似扮演一个角色在自身免疫的发展机制,包括一般的激活宿主免疫系统和分子拟态(13]。在前过程,病原体作为发起人autosensitization主要通过发起一个先天免疫反应,反过来刺激炎症和激活宿主的免疫系统(13]。明显的证据胸腺在大多数MG患者的慢性炎症14,15)是合理的假设,持续的病毒或其他微生物制剂可能导致intrathymic疾病的病因学的机制。我们最近的研究结果表明病毒提供贡献发作或维护的intrathymic MG患者的自身免疫反应(6,16]。在一项研究中,我们发现慢性脊髓灰质炎病毒感染的证据在一些(14.7%)MG患者的胸腺,表明持续病毒,先天免疫反应和慢性炎症刺激,可能是负责免疫学改变和autosensitization胸腺(16]。在另一项研究中,我们发现一个异常积累的eb病毒(EBV)感染的B细胞和浆细胞MG胸腺但不是在正常控制胸腺(6]。我们发现病毒DNA病毒潜伏期和裂解基因mrna和蛋白在大多数研究MG胸腺,指示EBV持久性和复活(6]。自从EBV的独特能力破坏b细胞监管检查点和干扰b细胞分化程序(17,18),我们的发现表明EBV感染可能导致慢性b细胞活化和持续这个器官在MG患者自身免疫反应6]。

在此,我们寻找新的炎症和MG胸腺EBV感染的证据。我们的目标是(a)”来形容MG胸腺在生物学过程相关基因的表达与免疫反应有关,包括基因编码促炎的分子,监管者的免疫反应,和抗病毒药物;(b)获得的进一步证据EBV感染MG胸腺通过扩展搜索EBV存在从17毫克胸腺检查在我们之前的研究6]额外19 MG胸腺。

2。材料和方法

2.1。MG患者胸腺组织,和控制细胞系

MG病人的研究包括病理胸腺胸腺切除术治疗治疗和非病理性胸腺在婴儿和成人心脏手术期间获得cardiopathic科目。书面知情同意了所有患者胸腺切除术和胸腺为研究目的的使用。伦理委员会批准的这项研究是卡洛Besta神经学研究所。

胸腺组织从10 AChR-positive MG患者(患者组1),包括3滤泡增生,与thymitis 3,与胸腺退化(见表41临床特征),分别用于TaqMan低密度阵列(LDA)免疫面板分析。两个非病理性胸腺在0.5和10个月婴儿被用作参考组织在LDA的分析。实时rt - pcr、执行确认LDA数据进行MG胸腺10位病人纳入LDA和额外的17个病人(患者组2,表1),包括6与滤泡增生,6 thymitis,先前与胸腺退化和5,结果阳性intrathymic EBV感染(6];控制,2非病理性胸腺检查lda和额外5 EBV-negative非病理性胸腺(平均年龄31.4±17.3):6)进行了分析。

实时PCR进行EBV DNA和RNA检测胸腺从19 MG患者(患者组3,表1),包括15 AChR-positive MG患者(与thymitis 6与滤泡增生,4,5与胸腺退化)和4个血清反应阴性的MG患者(3与滤泡增生和1 thymitis)。胸腺从2成人健康受试者,此前导致EBV-negative [6),分析了测试的特异性PCR过程在下面描述。

对于每个胸腺,一些片段在10%福尔马林固定的组织病理学分类;其他碎片snap-frozen并存储在−80°C。EBV-positive lymphoblastoid司法院和人类Jurkat EBV-negative t细胞培养在37°C公司5%₂在RPMI 1640 (Euroclone,佩罗,意大利)10%胎牛血清(表达载体,卡尔斯巴德,CA), 2毫米丙酮酸钠(表达载体),2毫米谷酰胺,100 U青霉素和链霉素(所有从Euroclone)和用于控制分子分析和免疫组织化学。

2.2。转录分析

2.2.1。RNA隔离和互补脱氧核糖核酸的合成

总RNA提取了20 - 50毫克的冷冻胸腺片段使用试剂盒方法(表达载体)和DNase对待我(Ambion应用生物系统公司,促进城市,CA)。Random-primed cDNA准备使用上标二世逆转录酶(表达载体)后,制造商的指示。作为一个控制retrotranscription效率,β肌动蛋白基因是放大在同一个样本。

2.2.2。TaqMan低密度阵列(LDA)

互补准备从10 MG胸腺(患者组1)和2控制胸腺免疫分析数组被TaqMan低密度分析,产品编号4342510(应用生物系统公司),包含预先设计引物探针的微流控卡设置特定的90个基因,参与免疫反应(如细胞因子/趋化因子及其受体、转录因子、应激反应、细胞表面受体和信号转导),以及6看家基因(例如,β肌动蛋白和3 -磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)。运行数组,互补脱氧核糖核酸是添加到PCR反应混合液(应用生物系统公司)和加载到8个装样的LDA渠道。每个通道与48井包含12种不同基因的引物探针集测试一式四份。经过短暂离心,数组是运行在升级应用生物系统公司7900年ht实时PCR系统(执行Cogentech,财团基因组技术c / o IFOM-IEO校园,米兰,意大利)。GAPDH是用于正常的结果。为每个目标基因相对表达的计算公式使用作为校准器规范化值获得控制胸腺。

2.2.3。实时rt - pcr

胸腺的碎片的互补脱氧核糖核酸样品准备的病人组1和2,和7控制胸腺,受到实时聚合酶链反应对il - 6、il - 10, IFN-1β干扰素-γ、MxA HLA-DRα基因。预先设计的功能测试TaqMan基因表达分析(应用生物系统公司)使用:化验ID Hs00174131_m1 il - 6;测定ID Hs00174086_m1 il - 10;测定ID Hs01077958_s1干扰素-β;测定ID Hs00174143_m1干扰素-γ;试验对MxA ID Hs00182073_m1;测定ID Hs00740413_g1 HLA-DRα。每个cDNA使用7500快速实时PCR系统放大一式三份(应用生物系统公司)PCR 20卷μL包含10μL TaqMan快速普遍PCR大师混合和1μL (TaqMan基因表达分析从应用生物系统公司(所有)。GAPDH mRNA分析内生控制通过使用TaqMan Predeveloped化验试剂人类GAPDH(应用生物系统公司)。互补脱氧核糖核酸作为没有模板的遗漏的控制。数据分析是相同的方法(在LDA方法)。

2.2.4。统计分析

单向方差分析与Bonferroni事后多重比较测试进行评估的意义差异转录剖析LDA数据。在实时rt - pcr分析,Mann-Whitney测试是用来比较il - 6、il - 10、干扰素-β干扰素-γ、MxA HLA-DRα转录水平控制和MG胸腺。值< 0.05被认为是重要的。GraphPad PRISM 4.0版本(GraphPad软件,圣地亚哥,CA)是用于数据精化和统计分析。

2.3。组织处理EBV检测

2.3.1。DNA和RNA隔离

对DNA和RNA隔离旨在检测EBV基因和转录,snap-frozen胸腺标本捐赠者属于病人组3和2控制胸腺。为每个OCT-included snap-frozen胸腺,总共18串行部分得到使用低温恒温器(Nußloch徕卡微系统公司、德国)交替DNA, RNA隔离,或免疫组织化学。30 -μm部分1、4、7、10、13、16收集DNA提取,30 -μm部分3、6、9、12、15和18 RNA提取,6 -μm部分2、5、8、11、14、17免疫组织化学。

DNA隔离,300年resuspended胸腺部分μg / mL蛋白酶K消化缓冲区,均质与TissueLyser LT(试剂盒,瓦伦西亚,CA)和孵化50°C一夜之间;DNA提取标准phenol-chloroform协议。RNA被使用试剂盒方法分离胸腺部分(表达载体),均化后TissueLyser LT(试剂盒)。RNA完整性检查在溴化乙锭含1%琼脂糖凝胶Tris-borate / EDTA缓冲区。所有的RNA样本DNase对待我(Ambion应用生物系统公司)。DNA和RNA浓度被Nanodrop估计2000 c分光光度计(热费希尔科学、威明顿、德)。

2.3.2。实时PCR EBV DNA

实时PCR特定的BamHI-W重复多个拼接(19每个DNA样本)进行。基因组DNA (0.8μ25 g)是放大在最后一卷μL包含12.5μL TaqMan普遍PCR反应混合液(应用生物系统公司),每个引物900纳米和175纳米探针。引物和探针是用于(19]。在50°C以下两个步骤2分钟和10分钟95°C, 50周期在95°C和1分钟1秒60°C是由一个7500快速实时PCR系统(应用生物系统公司)。实时PCR反应是在重复执行,包括没有遗漏的DNA模板控制组成。一个阈值周期(Ct)值的计算通过确定的点荧光超过一个阈值限制(基线)的10倍标准差。定义样本阳性Ct值低于38周期。DNA完整性和扩增效率是被放大的一个片段β从每个DNA制备球蛋白基因。

测试灵敏度和效率的实时PCR鉴定,稀释系列(0.5 - 5×10³巴尔病毒基因组的复制)的DNA分离EBV-positive司法院细胞(20.分析了)一式三份。标准曲线得到自动通过使用7500快的系统软件。消极的控制,DNA来自Jurkat细胞放大。

2.3.3。实时rt - pcr EBV延迟记录

实时rt - pcr检测EBV-encoded小RNA(生)1、EBV核抗原(EBNA) 1,潜伏膜蛋白1 (LMP)记录进行DNase-treated RNA (0.5μ从胸腺部分g)。EBER1 TaqMan PCR引物和探针,EBNA1, LMP1在[19,21]。EBNA1 LMP1引物和探针纳入TaqMan基因表达分析,应用生物系统公司。RNA被放大在最后20卷μL包含5μL 4 x TaqMan快速病毒互译大师混合和1μL EBNA1 TaqMan基因表达分析的LMP1, GAPDH或1.25μ每个引物M和0.18μM探究EBER1从应用生物系统公司(所有)。TaqMan快速病毒互译大师混合(应用生物系统公司)是专为高灵敏度病毒检测和执行反转录PCR都在一个反应。

实时rt - PCR反应是孵化7500快速实时PCR系统(应用生物系统公司)50°C 5分钟和15 95°C,紧随其后的是50周期在95°C 1分钟15秒和60°C。实时rt - pcr反应是在重复执行,包括疏忽没有模板控制组成的RNA。检测GAPDH成绩单(应用生物系统公司)担任控制模板存在的RNA和实时rt - pcr的效率。一个阈值周期(Ct)值计算如上所述EBV DNA检测。定义样本阳性Ct值低于38周期。

测试灵敏度和效率的实时rt - pcr分析,稀释系列(从0.1到10⁵每个反应细胞)的RNA从EBV-positive细胞系获得司法院被放大在存在和缺乏1μg的RNA EBV-negative Jurkat t细胞线。标准曲线得到自动通过使用7500快的系统软件。消极的控制,RNA源自Jurkat T细胞被放大。每个点的标准曲线运行一式三份。PCR产品身份被测序检查ABI 3100基因分析仪(应用生物系统公司)。

2.3.4。实时rt - pcr BZLF1裂解EBV成绩单

检测EBV的裂解成绩单BZLF1, DNase-treated RNA从胸腺获得部分retrotranscribed进random-primed cDNA通过使用上标很互补脱氧核糖核酸合成装备(表达载体)。互补脱氧核糖核酸对应500 ng的RNA与BZLF1-out放大正向和反向引物之前报道(22]。放大了在最后一卷50μL组成1 x PCR缓冲(Finnzyme,埃斯波,芬兰),0.2毫米核苷酸(应用生物系统公司),0.4μM的底漆,1 U DNAZyme (Finnzyme)。在95°C predenaturation一步后5分钟,40周期重复在95°C 1分钟59°C, 1分钟之后,一个扩展步骤7分钟在72°C。对于每一个样本,5μL PCR产品受到实时PCR在20卷μL包含10μL (权力SYBR绿色PCR掌握混合(应用生物系统公司)和0.8μ米每个BZLF1-inn引物(22]和孵化7500实时PCR系统(应用生物系统公司)。作为一个控制retrotranscription效率,β肌动蛋白基因是放大在同一个样本。互补脱氧核糖核酸从司法院和Jurkat细胞系被放大为积极的和消极的控制,分别和PCR产品身份被测序检查ABI 3100基因分析仪(应用生物系统公司)。

2.3.5。免疫组织化学

免疫组织化学进行6 -μ米部分快速冷冻胸腺组织属于病人组3 ()。所有19胸腺与人类CD20抗体特定应用(1:300;克隆L26、Dako斯特鲁普、丹麦)和CD138 (1: 50;克隆MI15 Dako)。部分从8 MG胸腺(4滤泡增生,2 thymitis, 2纷乱的胸腺)为潜在EBV与抗体应用蛋白质LMP-1(即食,克隆CS 1 - 4,同形像IgG1, Dako)和蛋白质裂解EBV BZLF1 (1: 10;同形像IgG2,寿命生物科学公司,西雅图,华盛顿州)。部分与4%多聚甲醛固定和孵化10分钟在甲醇1.5%过氧化氢,消除内源性过氧化物酶活性。对于BZLF1疣状,部分接受0.1% triton X 100 10分钟。阻止非特异性结合,部分在5% BSA孵化1小时。孵化项目与主要抗体进行隔夜在4°C。 Sections were then incubated with DakoCytomation EnVision + System Labelled Polymer-HRP Anti-Mouse (Dako) for 1 hour. Peroxidase reaction was visualized with 3,3′ diaminobenzidine (DAB) plus substrate buffer (Dako). All sections were counterstained with hematoxylin, visualized by optical microscopy (Nikon, Germany), and examined using Image Proplus (Media Cybernetics, Silver Spring, MD). Immunohistochemistry specificity was controlled by omitting the primary antibodies or replacing them with isotype-specific nonimmune IgG (Dako).

3所示。结果

3.1。MG胸腺的转录分析

描述MG患者的胸腺转录组基因的表达与炎症和免疫反应,我们初步LDA方法用于一系列小的MG患者,发现基因表达谱的MG胸腺是不同于控制胸腺,描述胸腺条件特点是慢性炎症和活跃的免疫反应,如前所报道(14,15]。从我们的LDA结果,从公布的数据(14,15),我们选择(白介素、干扰素- 6基因γ,HLA-DRαil - 10,干扰素-β和MxA),预计将提供在炎症和免疫反应,通过实时rt - pcr和分析他们的表达更多的MG胸腺和控制,包括EBV-positive MG胸腺和EBV-negative非病理性胸腺(6]。结果证实炎症状态和在MG胸腺免疫反应激活。LDA和实时rt - pcr的结果在下面详细描述。

3.1.1。LDA数据反映炎症状态和MG胸腺的免疫激活

LDA化验中包含的九十个基因被成功放大在MG胸腺和控制。方差分析确定了21个基因的表达是MG和控制样本中显著不同组()。其他基因表达在相似的水平在所有的群体除了其中的一些(如Bcl-2-like蛋白1,细胞死亡的有效抑制剂;血管紧张素ⅱ2型受体属于g蛋白耦合的一种蛋白质受体1家庭参与程序性细胞死亡;CD38、跨膜糖蛋白参与细胞粘附,信号转导,和钙信号)的表达水平低MG胸腺控制相比,虽然差异没有统计学意义。在表2,我们报道LDA数据显著的基因调节的至少一个3 MG胸腺子组与正常胸腺。MG胸腺与thymitis显示最多的调节基因,细胞因子和趋化因子(表的盛行2)。细胞因子之一,IL-6-a知名高度炎症细胞因子与慢性炎症和自身免疫性疾病(23)——最过表达基因在每个MG胸腺组相比正常胸腺,其次是il - 1β促炎细胞因子,主要由髓细胞还参与各种炎症和自身免疫性疾病24)(表2)。转录水平的其他分子能够调节炎症过程,包括集落刺激因子(CSF) 1、IL-7, il - 10, IL-12p35, TNF -α和干扰素-γ也在MG胸腺对控制胸腺(表条件2)。的重要过度IL-10-a Th2-produced细胞因子有抑制属性Th1功能和促进体液免疫反应(25,26)——无论MG胸腺组被认为是(表2)。

在趋化因子、趋化因子受体CXCR3参与招聘和维护激活T细胞在炎症部位(27),在滤泡增生显著调节,thymitis(表2),根据以前的数据(28]。转录水平的咆哮(CCL5),引发,单核细胞化学引诱物蛋白- 1 (MCP),巨噬细胞炎性蛋白- 1 (MIP)α单核细胞趋化因子,是高度过程中产生的微生物感染(29日)-增加每个胸腺MG组(表2)。

我们发现mRNA水平(VEGF-A)——血管内皮生长因子的生长因子调节血管通透性和血管生成30.)——显著调节thymitis而正常胸腺(表2)。

此外,LDA确定upregulation MG胸腺的一些基因参与免疫反应和抗原表达。正如预期的那样,我们观察到的表达增加CD19-marker每个MG胸腺组(表的B细胞2),反映出B细胞的渗透特征MG胸腺(3,6]。转录水平的CD152在MG (CTLA-4)高于正常胸腺,尤其是thymitis。CD152表面分子大多被认为是作为负调节t细胞激活(31日];最近,它已经表明,CD152信号可能发挥作用在抗菌感染赋予效应T细胞的能力迁移到网站的炎症和淋巴结32]。

符合之前的数据15),我们发现MG胸腺HLA-DR的表达水平很高α(表2)和补充部分C3 mRNA水平。

在21日调节基因在MG胸腺,还有两个基因,SMAD家庭成员7 (SMAD7)——核监管机构的转化生长因子-β表达的改变在炎性疾病33)——内皮转换酶1 (ECE)——metalloprotease参与内皮前体细胞的蛋白水解处理34]。

thymitis差异增生,恢复原状的胸腺严重CSF1,咆哮,VEGF-A, CXCR3, CD19, CD86 HLA-DRα,MADH7 mrna在thymitis明显高于纷乱的胸腺;il - 1β和MCP-1 mrna在thymitis显著高于增生;IL-7 IL-12p35, TNF -α干扰素-γ、引发和CD34 mrna,在thymitis显著高于增生和恢复原状的胸腺。

3.1.2。实时rt - pcr显示Upregulation基因参与炎症和MG胸腺抗病毒反应

数据来源于LDA验证在更多的患者(患者组2)由传统的实时PCR和控制。我们选择白介素、干扰素-γ,HLA-DRα基因,被认为是调节炎症反应期间对微生物感染和导致调节MG胸腺LDA(患者组1,表1)。我们也调查了il - 10的表达,它的作用在调节B细胞功能和体液反应(26),I型干扰素-β扮演关键的角色,对病毒感染宿主的免疫反应(25),MxA, I型干扰素的重要中介(35]。

我们发现的一个重要upregulation il - 6在每个MG胸腺组与正常胸腺(图1(一)),证实了LDA的数据。增加il - 10的表达也观察到在所有MG胸腺;特别是,il - 10表达显著增加增生和thymitis情况下(图1(b))。转录水平的干扰素-β明显高于thymitis和恢复原状的胸腺(图1 (c)),而干扰素-γ成绩单在增生和thymitis情况下表达明显上调(图1 (d))。显著增加MxA表达式中检测出每个MG胸腺子群,支持假说进行抗病毒反应在MG胸腺(图1 (e))。HLA-DRα还显示显著upregulation每个MG胸腺病理,再次支持MG胸腺的炎症状态(图1 (f))。

3.2。MG胸腺的描述存在EBV DNA, RNA和蛋白质

确认之前的MG胸腺(EBV感染的证据6),我们研究了胸腺组织从19 MG患者(患者组3,表1)和两个成人健康献血者EBV DNA的存在(BamHI-W重复区域),RNA (EBER1, EBNA1, LMP1 BZLF1),和蛋白质(LMP1和BZLF1)。

3.2.1之上。浸润的B细胞和浆细胞MG胸腺和控制

MG胸腺最初检查存在的B淋巴细胞和浆细胞浸润,为了验证胸腺碎片在调查中包含B细胞/浆细胞潜在EBV阳性。存在淋巴B细胞浸润(GCs扩散或组织)和浆细胞被发现在所有MG胸腺标本检查(数字2(一个)来2 (f));因此,替代部分从这些标本收集用于进一步分析EBV DNA和RNA的存在。

3.2.2。EBV DNA的检测

我们使用实时PCR检测EBV基因(Bam在MG胸腺HI-W重复区域)。我们首先验证实时PCR试验证明它能够检测EBV DNA具有高敏感性和特异性。通过放大稀释系列EBV-positive司法院的DNA细胞(20.),我们得到的标准曲线线性显示范围从0.5到5×10³拷贝/反应,与0.99回归系数(R²)和−3.56坡,对应于90.98%的效率。我们认为,分子系统导致和持续扩增效率高,> 0.5的基因组复制反应可能与一个可接受的水平的量化精度(图3(一个))。β球蛋白基因检测与控制水平在所有MG和控制样本(数据未显示)。EBV基因被发现在12/19(63.2%)的MG胸腺(thymitis增生6/9,2/5,4/5恢复原状的胸腺)但不是在控制胸腺(图3 (b)和表3)和EBV-negative Jurkat t细胞线。

3.2.3。EBV潜伏癌的检出记录

我们使用实时rt - pcr分析潜在EBER1 EBNA1, LMP1成绩单MG胸腺和控制。我们首先验证实时rt - pcr检测通过执行一系列控制实验。通过使用从EBV-positive司法院细胞RNA,我们证明了我们的检测能够检测到目标记录反应在细胞RNA从一个EBV-positive司法院(数字4(一)来4 (c)),但不是EBV-negative Jurkat t细胞线。标准曲线检测的三个目标总是高于0.99和斜率范围从3.22−−3.47,相应的效率高于94%。实时rt - pcr也能够探测到目标细胞RNA从一个EBV-positive司法院的1μg的RNA EBV-negative Jurkat t细胞(~ 100000细胞),表明我们的分子系统可以检测1阳性细胞/ ~ 100000 -细胞。

EBER1(图4 (d)),EBNA1(图4 (e)),和LMP1(图4 (f))记录中发现14/19、15/19和9/19 MG胸腺,分别,但不能控制胸腺(数字4 (d)来4 (f)和表3)。管家基因GAPDH是在所有的标本中发现(图进行了分析4 (g))。

3.2.4。检测裂解BZLF1 EBV成绩单

BZLF1成绩单中检测出16/19 MG胸腺但不是在正常控制胸腺(图5(一个))。在所有MG和控制cDNA标本,看家基因β肌动蛋白是有效地放大(图5 (b))。

3.2.5。检测潜在的LMP1和裂解BZLF1 EBV蛋白质

确认结果的分子分析在蛋白质水平,我们进行了免疫组织化学分析检测LMP1 BZLF1蛋白质,EBV延迟和激活的标志,分别在8 MG胸腺和2控制。在7/8 MG胸腺细胞表达LMP1分析而不是在正常胸腺(图6和表4)。LMP1的免疫反应性主要是发现在GC和增生perifollicular地区(数字6 (e)和6 (f))和髓内浸润在thymitis和恢复原状的胸腺(数字6 (g)和6 (h))。我们发现细胞表达裂解阶段早期EBV大多数MG胸腺蛋白BZLF1胸腺髓质检查(7/8)而不是正常胸腺(数字6(左)来6 (p)和表4),从而表明生产力,不仅潜伏,MG患者的胸腺中EBV感染。

4所示。讨论

本研究证实和扩展了先前的炎症和病毒感染的证据在MG患者的胸腺。

4.1。炎症和活跃的免疫反应描述MG患者的胸腺

先前的分析使用微阵列的基因特征增生性胸腺和实时PCR方法显示记录的大量与炎症和免疫反应显著相关的基因调节相比,MG胸腺增生的控制(14,15]。调节基因包括IFN-regulated基因,MHC II级分子,搞笑的家庭,和B闲暇的基因,其增加反映炎症状态和广义B细胞渗透在MG胸腺增生的14,15]。

在目前的研究中,我们使用LDA方法描述10 MG胸腺转录组的患者(患者组1)的胸腺增生的组织病理学特征,thymitis,胸腺退化,non-MG正常胸腺。

LDA, TaqMan定量PCR微流控系统的基础上,代表了一种有价值的方法为敏感和定量基因表达分析,使高通量筛选功能基因组学通过同时分析多个基因的mRNA表达人体组织(36]。LDA技术允许我们分析90个基因的mRNA属于不同生物类别,包括基因参与炎症和免疫反应。所有目标记录被发现在MG胸腺和控制。然而,21个基因调节MG胸腺相比(表控件2):(a)促炎细胞因子,能够激活免疫细胞,(即抗病毒特性。、il - 6、il - 1β、脑脊液、IL-7 IL12p35, TNF -α和干扰素-γ);(b)细胞因子、趋化因子和迁移所涉及的分子,自导,淋巴细胞在生物的生存的炎症或感染(即。、il - 6、咆哮、引发MCP-1 MIP-1α、CXCR3和CD152);(c) B-cell-related基因和基因相关的或潜在的相关抗原表示和体液反应(即。il - 10, HLA-DRαC3、CD19和补充组件)。

促炎细胞因子的表达达到最高thymitis情况(表中的值2)。众所周知,大多数的这些细胞因子在协同工作,促进炎症和免疫反应在宿主防御,特别是对病毒感染(25]。有些是强有力的炎症分子主要参与急性炎症(即。、il - 6、il - 1β肿瘤坏死因子-α和CSF);其他主要参与建立慢性炎症,促进体液和细胞免疫反应(即。IL-7, il - 10、il - 12和干扰素-γ)[25]。Upregulation il - 6和趋化因子的咆哮在MG相比正常胸腺符合先前的研究表明,这些基因在MG tec异常过表达在基底条件(37)或(il - 6)刺激时脂多糖(LPS) (38),主要的toll样受体激活剂(TLR) 4已知调节MG胸腺(39]。il - 6是一个著名的促炎剂与病理监管功能在T和b细胞的生长和分化40];咆哮已经观察到调节T细胞的迁移transepithelial [41]。因此,超表达的il - 6和咆哮可以支持外周淋巴细胞的迁移胸腺和他们的生存,导致病理改造的典型腺毫克(37]。超表达的il - 10(表2)也是致病相关的,如细胞因子il - 10是一个B-cell-related调节炎症过程,决定了抗体反应通过影响B细胞活化,增殖,分化26]。血清中il - 10被发现调节的MG患者免疫吸附后,表明这种细胞因子可能与免疫球蛋白合成或再合成过程在MG (42]。此外,它已被证明通过希伯EBV感染信号能够诱导B淋巴细胞il - 10的表达,这个细胞因子可以作为自分泌生长因子(43]。因此,观察il - 10 upregulation可能也解释了之前观察intrathymic EBV感染MG胸腺(6),与B细胞异常描述这个MG患者的器官。

干扰素-γ是一个展览的II型干扰素抗病毒性质和能力强,加强对有核细胞MHC I和II类表达式(25]。在我们的LDA数据,干扰素-γ和HLA-DRα调节在MG胸腺(表吗2),支持一个抗病毒反应和局部炎性环境。增加表达MHC II级分子曾观察到勒Panse和他的同事们(15)的结果表明,这些分子的超表达MG胸腺增生的并不是直接相关的B细胞数量增加,但可能是由于促炎MG胸腺的状态。

我们的转录组分析显示也引发的过度表达,MCP-1, MIP-1α(表2);这些都是炎症趋化因子与先天免疫反应和作为白细胞趋化因子(29日];他们的表情是在MG胸腺高于控制(表2),这表明他们可能涉及招聘T细胞和B细胞的异常。趋化因子受体CXCR3,开车的迁移和自导激活T细胞在炎症性网站27),在增生和thymitis(特别是调节表2)确认以前的观测增加CXCR3的表达式及其配体干扰素-γ诱导的胸腺蛋白10 MG患者(28]。

MG患者的胸腺微环境是有利于异常T细胞迁移进一步支持的观察,CD152的表达(CTLA-4)和CD86配体相比,MG胸腺提高到控制(表2)。CD152分子通常被认为是一种消极监管机构的t细胞激活(31日];然而,最近的一项研究表明,CD152信号不仅沉默T细胞但赋予他们迁移到网站的感染能力和二级淋巴器官(32),通过移植CCR7在T细胞的表达32]。因此,CD152的高表达水平在MG胸腺可能由于浓缩CCR7 + CD152 + T细胞发炎MG胸腺内由于趋化因子表达在专门的淋巴管,例如,其配体CCL21 [44]。VEGF-A的增加,生长因子调节血管通透性和血管生成30.),和ECE metalloprotease涉及内皮前体细胞的蛋白水解处理34),可能与异常淋巴细胞相关招聘和血管生成过程发生在MG胸腺(44]。

我们LDA数据显示CD19的表达增加,B细胞的标志,在每个MG胸腺子群,从而反映出存在显著的B细胞渗透MG胸腺;这些结果与以往从勒Panse和同事获得微阵列数据15]。

我们还发现补充组件相比,MG C3 mRNA水平上升到正常胸腺(表2),与先前的观察一致持久补充攻击AChR-expressing在MG胸腺上皮细胞和肌肉的细胞增生性胸腺;这种攻击可能负责自身抗原表达水平增加树突细胞维持自身免疫反应(45]。

确认LDA建议的MG胸腺炎症状态数据,我们进行了6个基因的实时PCR分析,选择中扮演关键角色对感染的炎症和宿主防御反应,在总共27毫克(患者组1和2)和7控制胸腺。这些基因是il - 6、il - 10,干扰素-γ,HLA-DRα,此前分析LDA和干扰素-β和MxA。干扰素-β选择搜索行动的证据MG胸腺的I型干扰素,像这种类型的干扰素在宿主对病毒感染的免疫反应中扮演关键角色和广泛参与自身免疫条件(46];MxA研究,因为它是一个重要的中介天生的I型干扰素的抗病毒反应(35]。

实时PCR分析确认upregulation il - 6、il - 10、干扰素-γ,HLA-DRα在MG胸腺与控制(图1)。有趣的是,干扰素,β和MxA基因也在MG胸腺,支持进行抗病毒的假说,在毫克病理组织炎症反应。超表达干扰素-γ和干扰素-β是与之前的数据相一致14]显示,大量的I型和II型IFN-induced基因显著调节相比,MG胸腺增生的控制。以前转录概况分析胸腺治疗和steroid-treated MG患者显示炎症状态减少在治疗(47];特别是,I型IFN-induced基因的表达,但不是II型IFN-induced基因,是标准化的,这表明炎症downmodulation类固醇发生通过I型IFN-pathways [47]。胸腺转录组分析通过LDA和实时PCR突显出广义胸腺MG患者的炎症状态,增加炎症基因的表达被观察到患者即使对皮质类固醇在胸腺切除术(表2,病人组1和2)。这表明炎症条件不完全消失或维护后免疫抑制治疗。然而,steroid-untreated病人的数量我们分析较低(2/10患者LDA和5/27实时PCR分析);因此,还需要进一步的研究来理解是否能够减少免疫抑制治疗MG intrathymic促炎的条件和建立其他基因,是否除了我IFN-induced基因型47),进行标准化。

转录的总体结果分析证实,MG胸腺的特点是慢性炎症状态。这个状态是否病毒感染事件的结果仍有待澄清。我们之前的研究显示,增加表达的TLR先天免疫系统的四个成员MG胸腺thymitis和胸腺退化(39),一起发现脊髓灰质炎病毒持续感染的MG患者的胸腺(16),强烈支持作用的病毒感染和先天免疫系统的激活触发事件的炎症和intrathymic autosensitization毫克。

4.2。在MG胸腺EBV感染是常见的

在我们之前的研究中,我们演示了活跃的非肿瘤的17/17 MG胸腺EBV感染调查,无论胸腺病理,而没有证据表明EBV感染被发现在6控制胸腺从成人健康受试者6]。具体来说,MG胸腺的分析,我们发现(a)的高频EBV-infected B细胞原位杂交的埃伯斯和潜在的免疫组织化学(EBNA2, LMP1 LMP2A)和溶解性(BFRF1、BMRF1 gp350/220, p160) EBV蛋白质;(b)的表达潜在的(EBNA1 LMP2A)嵌套PCR反应和溶解性(BZLF1)基因的互补;(c)存在EBV DNA的实时PCR特定LMP1基因(6]。

在目前的研究中,我们解决EBV感染的特征是否通过扩展我们的搜索EBV-associated MG胸腺核酸和蛋白质的额外19 MG胸腺(患者组3)。我们之前决定运用不同的分子方法的使用(6),为了验证我们是否也同样能够检测EBV DNA和RNA在MG胸腺(见部分2)。

符合我们之前的结果(619个MG胸腺),调查显示(表EBV感染的迹象3)。EBV DNA检测在12/19 MG胸腺(图3和表3);EBV潜伏或裂解成绩单(通常两个)在场,除了一个(MG12), MG胸腺,而没有感染的迹象被发现在两个非病理性控制(图4和表3)。EBV的1毫克样品(MG12) -成绩单,但是窝藏浸润B细胞,免疫组织化学检测EBV DNA基因组,这表明EBV感染的程度这个胸腺标本可以低(或局限于一些细胞)。

叫做EBER1 EBV-encoded RNA表达高水平在EBV-infected细胞延迟(17,18];大多数MG患者积极EBER1(图4),与我们之前的研究结果一致,用原位杂交的埃伯斯允许我们确定一个高比例的EBERs-positive细胞大部分MG胸腺无论胸腺病理检查(6]。这里,实时rt - PCR检测EBER1的应用程序,以及使用独立的实时PCR检测来检测EBV DNA, LMP1, EBNA1,强烈确认证据EBV在MG胸腺延迟。

建立潜伏感染EBV使用四个不同延迟基因项目(第三延迟,第二,我和0),每个特征的一组病毒基因的表达提供激活,成长,和生存信号感染B细胞(17,18]。在这项研究中,我们发现在MG胸腺EBNA1,这是表示在所有EBV延迟程序,和LMP1表达延迟三世(或增长计划)和延迟二世(或者默认的程序)。在我们之前的研究6),我们也寻找LMP2A(转录和蛋白质),表示在延迟三世和二世和EBNA2(蛋白质),第一个延迟蛋白质合成的天真的B细胞在感染后,表示只有在延迟III(或增长计划)(17,18]。我们发现LMP2A,而EBNA2很少被检测到,只在少数几个MG胸腺细胞,可能新感染的细胞(6]。这些以前的结果,加上这里介绍,似乎表明,EBV主要使用延迟二世建立MG胸腺的潜伏性感染。

EBV的裂解基因,我们分析了直接裂解基因BZLF1早期,合成一个反式激活因子蛋白质调节早期溶解性基因的表达(17,48]。符合我们之前的结果(6],BZLF1记录被发现在大多数(16/19)的病理检查胸腺但没有控制(表3和图4),表明生产MG胸腺中病毒感染可能会导致新感染事件和MG胸腺内EBV感染的传播。

我们证明我们的实时PCR分析可以检测EBV成绩单在RNA提取从一个司法院EBV-infected细胞(数字3和4)。不过,我们无法发现所有病毒转录分析MG胸腺调查,尽管所有患者阳性至少一个成绩单。所建议的半场结束和他的同事们(49),这可能是由于这一事实的RNA提取碎片质量活组织检查的组织样本不能完全与可行的相比,高度复制lymphoblastoid细胞包含的多个副本EBV基因和显示高转录活性。此外,成功检测EBV核酸在一个高度异质的细胞群,这是一个功能的人体组织,可能很难实现(49]。

在蛋白质水平证实分子分析的结果,我们进行免疫染色LMP1和BZLF1潜伏性和溶解性标记(表4)。在我们之前的研究(6),我们发现了许多LMP1-expressing胸腺髓质细胞MG胸腺增生,thymitis,地区和胸腺退化,对应于淋巴浸润和(增生)gc(图6)。LMP1中没有检测到正常胸腺(图进行了分析6)。在同一个组织,免疫组织化学还透露的存在在每个MG胸腺细胞积极BZLF1群但没有控制胸腺(图6)。LMP1和BZLF1蛋白中没有检测到2的8 MG胸腺分析(LMP1在MG11和BZLF1 MG13),在相应的记录也没有检测到。

大部分的检查(12/19)的患者接受免疫抑制治疗前胸腺切除术(表1)。剩下的7例,6 (MG1的MG3, MG5, MG8, MG9,和MG13)只被乙酰胆碱酯酶抑制剂治疗和一个(MG4)治疗。我们发现EBV感染的证据也在这七个患者的胸腺,因此建议intrathymic EBV失调不是免疫抑制治疗的结果。然而,我们不能排除,免疫抑制药物可能会放大一个既定intrathymic EBV感染。

总之,这里的结果提出加强EBV的想法是涉及intrathymic MG发病机理。EBV感染可能导致自身免疫反应在MG胸腺的维护导致慢性B细胞活化,促进生存和扩张autoreactive B细胞克隆。是否活跃intrathymic EBV感染是一个主要的事件在MG或一个底层intrathymic过程的结果,导致循环EBV-infected细胞的吸引力和EBV复活在MG胸腺需要澄清。EBV感染的高发人群中发病率和低MG表明,其他因素(遗传或环境,或者两者兼而有之)必须干预与EBV导致毫克。可能是先前存在的炎症状态可能是必要的殖民胸腺的EBV-infected B细胞和随后的重新激活这些细胞,进而长期EBV感染本身可能发挥作用在维持慢性炎症intrathymic MG创建一个恶性循环。

5。结论

炎症是一个重要的贡献者的开发和发展自身免疫性疾病的因素。转录分析的结果,通过确认之前的数据显示炎症和活跃在MG胸腺免疫反应,强烈支持创建一个地方促炎州是胸腺MG患者的致病特点。

我们假定一个长期建立胸腺炎症可能是至关重要的,上下文中的基因诱发背景,建立机制导致MG自身免疫包括表示“self-epitopes”;upregulation MHC基因,I型干扰素,促炎细胞因子、粘附、costimulatory分子的抗原递呈细胞”;以及不断启动autoreactive T细胞(13)(图7)。在MG胸腺持久病毒存在的证据,来自我们的最近的研究(6,16),表明最初的病原体感染可能负责观察炎症在MG胸腺签名和随后的自身抗原致敏。特别是,我们最近发现(6),确认和强化,积极EBV感染intrathymic MG患者的B细胞组件表明EBV感染,炎症,可能是一个关键步骤在intrathymic MG发病机理。炎症引起的内源性或外源性(例如,微生物感染)危险信号可能驱动胸腺的殖民化EBV-harbouring B细胞和随后EBV复活(图7)。持久EBV感染本身可能有助于保持长期发炎胸腺微环境。在胸腺发炎,EBV可能促进B细胞的破坏公差检查站和导致autoreactive B细胞克隆的扩张(图7)。EBV感染从而可以解释自身免疫反应可以延续在MG胸腺,因为EBV可能是能够使B细胞产生乙酰胆碱受体抗体。

通过添加新的证据表明炎症和EBV感染作为MG胸腺的共同特征,我们的发现可能有相关治疗的影响:他们加强目前的治疗方法的基本原理,特别是抗炎药物使用和胸腺切除术移除的感染,同时也建议未来MG原理预防和治疗措施,如EBV疫苗接种(50]或监管的现有EBV感染抗病毒药物的使用。

利益冲突

作者都没有任何财务利益冲突。

确认

作者感谢教授答:Lanzavecchia(生物医学研究所,Bellinzona,瑞士)的礼物EBV-positive司法院lymphoblastoid细胞系。他们感谢意大利协会反对肌无力(目的:Associazione Italiana Miastenia e Malattie Immunmodegenerative)对金融支持。这项工作也由欧盟第七框架计划FIGHT-MG(批准号242210)和意大利卫生部每年的研究经费(RC2010 / LR5和RC2011 / LR5)。

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