文摘
背景。结肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤。它已经发现Farnesoid X受体(FXR)具有必要的监管作用近年来在multitype癌症。然而,其监管机制在结肠癌显然没有被探索。本研究旨在探讨FXR的分子调控机制和其下游基因在结肠癌的恶性发展。方法。的mRNA和蛋白表达FXR在结肠癌细胞以定量实时聚合酶链反应和免疫印迹。FXR的影响对结肠癌细胞的生物学功能是衡量Kit-8细胞计数,集落形成,transwell化验。下游靶基因预测了FXR的生物信息学分析,发现与细胞氧化磷酸化有关。FXR之间的绑定关系及其下游基因脱氢酶/还原酶成员9 (DHRS9)是通过荧光素酶报告实验和染色质免疫沉淀反应试验验证。氧化磷酸化的变化检测到免疫印迹和耗氧速率的决心。FXR的影响/ DHRS9轴对结肠癌细胞的恶性进展被救援实验进一步证实了。结果。FXR在结肠癌组织和细胞underexpressed,和overexpressing FXR可以抑制结肠癌细胞的恶性行为。此外,DHRS9 FXR的下游基因,FXR / DHRS9抑制结肠癌通过抑制氧化磷酸化的恶化。此外,促进FXR表达在结肠癌细胞可以部分逆转生物功能变化引起的沉默DHRS9表达式。结论。FXR抑制氧化磷酸化,抑制结肠癌细胞的恶性进展通过针对DHRS9。
1。介绍
结肠癌是一种常见的恶性肿瘤。根据美国癌症协会公布的统计数据,人类结肠癌的发病率和死亡率是10.2%和9.2%,分别为(1,2]。公布的数据显示,国际癌症研究机构(IARC)世界卫生组织,全球结肠癌的新病例在2020年超过了114万,和580000例死于这种疾病3]。随着人们生活方式的改变,结肠癌的发病率正在上升不断在发展中国家4,5]。虽然在结肠癌治疗取得突破性进展,先进的结肠癌的预后仍不满意,因为远处转移和复发6]。结肠癌是一个连续的分子发病机制多步过程,和理解结肠癌的发病机制是至关重要的发展更好的预后和治疗策略。
Farnesoid X受体(FXR)是一种胆汁酸受体(7,8]。研究表明,胆汁酸是人类恶性肿瘤的发病机理有关,包括肝癌、胃癌和食道癌9- - - - - -11]。人类流行病学和动物研究已经证明,结肠癌的风险强烈与粪便胆汁酸浓度(12,13]。FXR表达水平高在肾、肝、肾上腺,但相对较低的脂肪和心脏(14,15]。FXR结合DNA (FXR响应元素)和参与胆汁酸的规定和葡萄糖代谢相关基因(16- - - - - -18]。此外,越来越多的证据证实,FXR是人类肿瘤发生的一个重要组成部分19,20.]。贝利et al。21]发现结肠息肉FXR mRNA水平降低,并减少在结直肠癌更重要。同时,过度的FXR可以抑制肠道细胞的异常生长和大肠癌的发展22]。然而,FXR的确切机制在结肠癌的发展需要进一步阐明。
作为一个短链脱氢酶/还原酶家族的成员,脱氢酶/还原酶成员9 (DHRS9)被认为是与新陈代谢的视黄醇(23]。Soref et al。23)第一特征DHRS9在气道上皮细胞的酶活性和Jette et al。24]后来透露,DHRS9 mRNA主要是用冒号表示,低水平。先前的研究已经证实,DHRS9参与all-transretinoic酸的生物合成(ATRA) [25]。由于ATRA是肿瘤发生的一个关键角色,据推测DHRS9与肿瘤发生和发展相关(26]。研究已经证实DHRS9的重要抗肿瘤活性及其在各种癌症的治疗作用[25,27- - - - - -30.]。视黄酸生物合成的缺乏被认为是一种机制导致大肠癌腺癌的发展,我们假设可能有相关性DHRS9表达的失调和结肠癌的侵袭性。然而,协会DHRS9表达与结肠癌的恶性进展还没有探索。
在当前的研究中,我们确定FXR在结肠癌的表达及其在结肠癌的恶化作用,我们进一步探讨其目标基因DHRS9和分析DHRS9-associated氧化磷酸化机制,从而提供更充分的理论依据FXR / DHRS9调节结肠癌的发展。
2。材料和方法
2.1。生物信息学方法
mRNA表达数据(正常:41,肿瘤:480)结肠癌收集通过癌症基因组图谱(TCGA) (https://portal.gdc.cancer.gov/)。mrna表达的差异(DEmRNAs)是通过微分分析通过使用“刨边机”包, 。目标转录因子通过文献综述被发现。目标的潜在目标基因下游转录因子被MotifMap预测数据库(http://motifmap.ics.uci.edu)和GTRD数据库(http://gtrd.biouml.org/ !),和目标基因是由皮尔森相关分析和文献综述。目标基因和目标之间的结合位点预测转录因子是通过使用JASPAR (http://jaspar.genereg.net/)。基因集富集分析(GSEA)是利用目标mRNA的通路富集分析。
2.2。细胞培养
人类结肠上皮细胞系NCM460 (BNCC353657)和结肠癌细胞株,包括116年HCT (BNCC337692) HT-29 (BNCC100164) SW480 (BNCC100604) lovos (BNCC338601), Caco-2 (BNCC350769)和(BNCC100173)是来自希伯来文名字RKO文化(中国)集合。这些细胞系杜尔贝科的修改维护鹰介质(DMEM)(美国Gibco)补充10%胎牛血清(的边后卫)(美国热费希尔科学)37°C公司为5%2。
2.3。细胞转染
FXR过度(oe-FXR),沉默DHRS9 (sh-DHRS9)和相应的消极控制(nc)是从GeneChem采购公司(中国)。Lipofectamine 2000(美国英杰公司)是用来使转染oe-FXR, sh-DHRS9,相应的nc HT-29和结肠癌SW480细胞。转染后细胞收集24小时后实验。
2.4。定量实时聚合酶链反应(存在)
使用试剂盒进行总RNA提取试剂(美国热费希尔科学)。提取的RNA的互补脱氧核糖核酸合成使用高容量cDNA逆转录工具包(美国热费希尔科学)。实时进行qPCR QuantStudio 3 PCR仪器(热费希尔科学、美国)使用SYBR绿色荧光信号检测设备(豆类、日本)和相应的引物(表1)。特定mRNA的表达水平的定量进行使用 。
2.5。免疫印迹
Radioimmunoprecipitation缓冲区(美国热费希尔科学)是用来溶解细胞。细胞溶解产物含有50μ克总蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜(美国微孔)钠十二烷基sulphate-polyacrylamide凝胶电泳(美国热费希尔科学)。膜和初级抗体在一夜之间被孵化在4°C。蛋白质乐队当时与三羟甲基氨基甲烷缓冲液冲洗盐水+渐变(TBST)缓冲3次,每10分钟。接下来,膜在室温下和二次抗体孵化2 h。化学发光底物(美国热费希尔科学)添加到观察蛋白质的乐队。
主要的抗体包括anti-FXR (ab129089,稀释1:1000),anti-DHRS9 (ab126074,稀释1:1000),anti-ATP5D (ab97491,稀释1:1000),anti-ATP5E(猫# pa5 - 104424,稀释1:1000),anti-NDUFA3 (H00004696-K,稀释1:1000),和anti-GAPDH (ab9485,稀释1:2500)都是rabbit-derived抗体。Anti-FXR、anti-DHRS9 anti-ATP5D, anti-GAPDH来自Abcam(英国)。Anti-ATP5E抗体来自热科学(美国)。anti-NDUFA3抗体从Abnova买(中国)。山羊anti-rabbit免疫球蛋白g h和l(合)抗体(Abcam ab6721,稀释1:2000年,英国)担任二级抗体。
2.6。细胞计数Kit-8 (CCK-8)测定
转染HT-29和SW480细胞(约 细胞每口井)镀到96孔板。后0、1、2和3天,10μl CCK-8解决方案(美国MedChem表达)是互相补充,孵化是持续了2 h 37°C孵化器有限公司为5%2。OD值被标在450海里(Bio-Rad实验室、美国)。
2.7。集落形成实验
HT-29或SW480细胞(约 细胞每)被种植到6-well盘子,和盘子被保存在一个37°C孵化器有限公司为5%2为文化。新鲜培养基代替每3 - 4 d。10 - 14 d后,肉眼可见的斑点,这些细胞被固定为4%多聚甲醛,持续15分钟。后,细胞治疗0.1%结晶紫为20分钟。染色后,多余的结晶紫染料在被使用磷酸缓冲盐清洗(PBS)和殖民地的数量决定。
2.8。Transwell化验
HT-29或SW480细胞(约 细胞每)第一次播种的上院Transwell设备8μ米孔径与无血清培养基(美国康宁公司)。与此同时,细胞培养基补充10%的边后卫了众议院。24至48 h后孵化在37°C,已迁移细胞和棉签在参议院被移除,而迁移的细胞受到固定(4%多聚甲醛)和染色(0.1%结晶紫)。这张照片是在显微镜下观察(上海Caikon光学仪器有限公司,中国),和相对细胞数进行了计算。测定细胞的入侵检测,50μl矩阵凝胶应用于底部的细胞接种前上院(美国BD生物科学),和其余的过程基本上是一样的迁移试验。
2.9。Dual-Luciferase报告基因分析
放大3UTR DHRS9序列突变(DHRS9-Mut)或野生型(DHRS9-Wt)导入到PGL3-basic向量(美国Addgene)构建报告基因质粒。然后HT-29细胞种植到96孔板。接下来,HT-29细胞cotransfected oe-FXR / oe-NC和记者质粒。转染组的荧光强度是衡量荧光素酶活性测定工具包(美国Promega)转染后48 h。
2.10。染色质免疫沉淀反应(芯片)的测定
芯片分析都使用了芯片工具包(美国# 9006 CST)。简而言之,HT-29细胞用甲醛交联10分钟,然后交联是通过添加125海里甘氨酸和终止反应5分钟。然后细胞收获和超声波处理,直到DNA平均长度为200 - 1000个基点。接下来,使用FXR抗体进行免疫沉淀反应(英国ab168852 Abcam)控件,并使用中存在沉淀DNA被放大。DNA和细胞溶解产物孵化一夜之间在4°C。然后,Dynabeads蛋白G(美国表达载体)添加了DNA浓缩为2 h。免疫球蛋白(美国B900620 Proteintech)作为一个消极的控制。最后,DNA被执行中存在测量。DHRS9启动子是前锋的引物序列1:5 - - - - - -TCCCCTGCTGGTTTGATGATT-3 ;反向:5 - - - - - -AAAATATCCTGCCTTTCCCCCA-3 ;引物序列2:5 - - - - - -AACAGAGTGCATACCCTTTCA-3 ;反向:5 - - - - - -GGCTTATTTTTGTAAAGCAAACTCT-3 。
2.11。临床样本收集
结肠癌患者( )没有任何治疗治疗为样本集合在唐山中心医院从2020年1月至2022年1月。肿瘤组织和相应的收集相邻组织形成了结肠癌患者。所有患者签署知情同意,相关实验与临床样本唐山中心医院伦理委员会的批准。
2.12。测量细胞耗氧率(OCR)
OCR决心使用海马生物科学XF96分析仪(美国北Billerica)。培养皿的细胞保持24小时,然后适应了XF介质在37°C 2 h。OCR测量是按照指令进行XF细胞水压力测试的概要文件。寡霉素,trifluoromethyl苯腙(CCCP),和鱼藤酮先后添加,然后是OCR值确定。基底的耗氧量 consumption-nonmitochondrial呼吸和质子漏(平均(1)是(2))。最大耗氧量 氧气consumption-nonmitochondrial呼吸和质子漏(max(3)意味着(2))。
2.13。数据分析
本研究实验都是独立的实验,重复3次。GraphPad Prism 8.0软件(美国GraphPad软件)是用于统计、分析和策划实验中获得的数据。所有数据在数据的形式 ,和组间数据对比进行使用 - - - - - -测试或单向方差分析。使用价值判断的意义不同,星号与差异的显著性水平,表示 。
3所示。结果
3.1。在结肠癌FXR表达下调
先前的研究已经显示,FXR损失与肿瘤促进表型(31日]。调查FXR结肠癌发展之间的相关性,Wilcox TCGA FXR使用数据库进行分析确认FXR的低表达在肿瘤组织(图1(一))。我们TCGA进一步执行数据库分析之间的联系FXR表达与TNM结肠癌患者的阶段。结果显示,FXR的表达没有明显相关性与远处转移,区域淋巴结,肿瘤分级(补充图1)。此外,很明显,FXR表达下调在T3 + T4组相比,T1 + T2组(图1 (b))。与此同时,我们也发现了mRNA和蛋白表达水平的FXR在临床结肠癌邻近组织和癌组织中存在和免疫印迹,分别。结果表明,FXR的mRNA和蛋白表达水平显著降低肿瘤组织(图1 (c))。随后,FXR的mRNA和蛋白表达水平在正常结肠上皮细胞和结肠癌细胞系测量中存在和免疫印迹。结果表明,FXR的mRNA和蛋白表达水平显著降低结肠癌细胞系(HCT 116、HT-29 SW480, Caco-2,, RKO lovos)比在正常结肠上皮细胞(NCM460)。其中,FXR的表达水平相对较高在SW480细胞(HT-29细胞和相对较低的数字1 (d)和1 (e))。因此,HT-29和SW480选择后续实验。总之,在结肠癌FXR的表达很低。
(一)
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(d)
(e)
3.2。FXR Upregulation抑制结肠癌细胞的恶性表型
验证的作用异常FXR表达在结肠癌细胞的生物功能,oe-NC或oe-FXR转染到HT-29 SW480细胞。存在转染效果评估,发现了一个显著的增加了FXR表达oe-FXR-transfected组(图2(一个))。CCK-8和集落形成进行化验检查FXR在细胞增殖的影响。实验数据表明,FXR超表达明显抑制(图的可行性2 (b)(图)和集落形成能力2 (c))HT-29 SW480细胞与对照组相比。然后,我们评估的能动性oe-FXR-transfected HT-29 Transwell化验和SW480细胞。结果表明,FXR超表达明显减少结肠癌细胞的迁徙和侵入性能力(图2 (d))。综上所述,FXR扮演了一个角色的肿瘤抑制基因和抑制结肠癌细胞增殖的能力,迁移和入侵。在这项工作中,我们发现FXR HT-29细胞的行为更重要的影响,所以HT-29细胞株用于后续实验。
(一)
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3.3。DHRS9 FXR的目标在结肠癌
进一步探索FXR的潜在机制,我们预测其潜在使用MotifMap下游靶基因数据库和GTRD数据库和分割的目标基因表达下调939 DEmRNAs。结果显示,38个微分潜在目标基因(图中被发现3(一个))。随后,皮尔逊相关分析用于检测之间的相关性38 mrna和FXR(补充表1),这表明DHRS9与FXR强烈正相关(图3 (b))。进一步的生物信息学分析显示,DHRS9表达显著减少结肠癌组织与正常组织相比(图3 (c))。存在结果还显示,DHRS9表达显著降低结肠癌细胞系与正常结肠上皮细胞(图3 (d))。JASPAR数据库显示,有多个潜在的结合位点FXR的上游DHRS9成绩单(图3 (e)),所以我们猜想DHRS9 FXR的潜在目标基因。芯片和dual-luciferase化验了验证FXR和DHRS9之间的互动。结果表明,FXR绑定到DHRS9启动子和增强的荧光素酶活动的向量携带DHRS9启动子(数字3 (f)和3 (g)),这表明DHRS9 FXR的直接目标。最后,HT-29细胞治疗FXR过度表达,然后超表达的影响FXR DHRS9中存在多普勒超声检查和免疫印迹。结果表明,FXR超表达可以显著增加DHRS9信使rna和蛋白质的水平在HT-29细胞(数字3 (h)和3(我))。通过上面的分析,我们证实了FXR可以激活转录DHRS9和移植DHRS9的表达。
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(c)
(d)
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(h)
(我)
3.4。FXR激活DHRS9抑制结肠癌的恶性发展
调查FXR的角色/ DHRS9监管轴在细胞功能层面,我们设计了一个拯救实验。首先,我们转染结肠癌细胞HT-29 oe-NC + sh-NC, oe-FXR + sh-NC oe-NC + sh-DHRS9, oe-FXR + sh-DHRS9。我们首先验证结肠癌细胞的转染效率存在(图4(一)),发现FXR超表达部分抵消增加的细胞增殖能力和集落形成能力引起DHRS9沉默在结肠癌细胞(图4 (b)和4 (c))。同时,细胞功能实验表明,增强的迁移和入侵能力引起sh-DHRS9治疗结肠癌细胞被抑制后overexpressing FXR同时(数字4 (d)和4 (e))。总之,转录因子FXR抑制结肠癌细胞的恶性进展通过激活DHRS9。
(一)
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3.5。FXR激活DHRS9抑制细胞氧化磷酸化
我们执行KEGG DHRS9基因和通路分析发现该基因是丰富在氧化磷酸化途径(图5(一个))。它已被证实在小鼠模型和人体临床样本的缺乏线粒体氧化磷酸化改变细胞的新陈代谢,从而加快肠道肿瘤的发生(32]。Rodriguez-Enriquez et al。33)进一步发现,癌症细胞增殖可能被破坏氧化磷酸化和诱导氧化应激。基于之前的研究,我们首先研究了氧化磷酸化的蛋白表达基因在结肠癌细胞和显示,FXR超表达部分抵消氧化磷酸化的upregulation DHRS9造成的基因表达抑制(图5 (b))。自从FXR表达的变化和DHRS9结肠癌细胞导致氧化磷酸化蛋白基因的表达变化,然后我们检查这些变化是否导致氧化磷酸化交替功能。我们检查了OCR不同的转染细胞,发现OCR明显HT-29细胞中表达下调,下调DHRS9表达式。进一步FXR恢复OCR水平的过度表达,表明DHRS9激活FXR减少氧化phosphorylation-dependent OCR(图5 (c))。总之,转录因子FXR可以激活DHRS9和抑制结肠癌细胞的氧化磷酸化。
(一)
(b)
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4所示。讨论
积累的研究已经表明,转录因子是非常重要的对于癌症发展。例如,STAT3的表达是各种癌症中特异表达。抑制STAT3的表达在肿瘤细胞可以减缓癌症的进展和阻止肿瘤的生长和肿瘤细胞迁移34]。KLF5基底乳腺癌中高度表达,抑制KLF5表达式会阻碍乳腺癌细胞迁移和增殖在体外和肿瘤发生在活的有机体内(35]。FXR表达的差别,我们发现对这些基因在结肠癌组织中通过生物信息学分析。作为一种重要的胆汁酸受体在核受体超家族,FXR可以与它的配体,胆汁酸分子,影响癌症的发展(36]。例如,黄等人发现FXR能抑制肝癌细胞的生长通过抑制mTOR-s6K通路(37]。刘等人。38]证实FXR的角色作为一个肿瘤抑制前列腺癌和显示,FXR的激活或超表达可以抑制前列腺癌细胞的扩散。在目前的研究中,我们验证了低表达FXR在结肠癌的生物信息学分析和分子实验。我们进一步与细胞功能实验证实,FXR超表达可以抑制结肠癌细胞的恶性行为,同意FXR的角色在其他癌症研究。
生物信息学分析预测38 FXR的潜在目标基因下游。我们进行了38的皮尔森相关分析预测目标基因和FXR(补充表中特定的数据了1),发现25个基因的表达呈正相关,FXR的表达,和其他13个基因的表达与FXR表达的负相关。我们选择最高的5个基因的相关性,以备后续分析,发现有很少的研究集中在SLC17A4 / SLC51A(排名前1 /前2)和结肠癌。此外,DHRS9已经发现在大肠癌中表达的异常25),但在结肠癌DHRS9的监管机制尚未深入研究。因此,我们选择DHRS9作为一个潜在的目标基因对我们的研究。研究已经证明,DHRS9结肠直肠癌的关键功能。患者低DHRS9表达水平明显较短的无病生存和显著增加淋巴结转移和复发39]。DHRS9明显在胰腺癌组织和DHRS9的高表达与血管渗透水平呈正相关,与不良预后相关(40]。然而,在结肠癌DHRS9很少报道。这里,FXR之间的绑定和DHRS9被芯片分析和dual-luciferase试验证实,进一步验证,FXR的过度可能导致upregulation DHRS9表达式。细胞实验表明,FXR激活DHRS9抑制结肠癌的恶性行为。
氧化磷酸化是吸引越来越多的关注41,42]。在最近的研究中,浓缩FXR / DHRS9途径表明这种监管轴与氧化磷酸化有关细胞。谭et al。43)发现,抑制肝癌细胞的氧化磷酸化可以降低细胞生存能力。Litvak et al。32)发现,氧化磷酸化的结肠上皮细胞的增加可能会导致结肠生态失调。我们评估氧化phosphorylated-related蛋白质的表达,免疫印迹,发现FXR过度扭转可能增加引起的蛋白表达DHRS9表达抑制。结合细胞的OCR测量和相关救援实验,我们最终确定转录因子FXR可以激活DHRS9抑制氧化磷酸化的结肠癌。
深入的了解结肠癌的发病机制有利于结肠癌患者的治疗。在这项研究中,转录因子FXR发现调节结肠癌的恶性进展通过激活目标基因DHRS9,从而抑制氧化磷酸化。这一发现提供了充分的理论支持,进一步了解结肠癌发展的分子机制。然而,由于实验条件的限制,本研究缺乏动物实验数据。在后续研究中,我们的团队计划建立小鼠模型进一步验证FXR的角色/ DHRS9在调节结肠癌进展在动物和临床水平。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。数据和材料在当前的研究中可从相应的作者以合理的要求。
伦理批准
这项研究是由唐山中心医院伦理委员会批准。依照经批准的方法进行了指导方针。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
Jl Z和Yg W为研究设计做出了贡献。霍奇金淋巴瘤进行文献搜索。YW获得数据。Jc G写了这篇文章。Hc Y和Xt W进行数据分析和起草。Jl Z修改这篇文章。所有作者给提交版本的最终批准。Jinlai赵和怡港王同样这项工作。
补充材料
补充图1 a。关于FXR远处转移的相关性,区域淋巴结,肿瘤分级。ns意味着没有显著差异。(补充材料)