文摘

背景。非小细胞肺癌(NSCLC)是全球最常见的恶性肿瘤之一,和cisplatin-based化疗是主要的治疗非小细胞肺癌。然而,顺铂耐药性的非小细胞肺癌细胞对非小细胞肺癌的治疗是一个重大的挑战。材料和方法。存在和免疫印迹进行探测的表达LINC02389 miR-7-5p在NSCLC组织和细胞系。细胞计数kit-8 (CCK-8)测定和流式细胞术分析是应用于考试非小细胞肺癌细胞的细胞增殖和细胞凋亡率。LINC02389之间的交互和miR-7-5p双荧光素酶报告基因分析,验证了RNA下拉试验,和RNA免疫沉淀反应(RIP)测定。此外,有顺铂耐药性NSCLC细胞生成的评估LINC02389的生物功能和miR-7-5p NSCLC的顺铂耐药性。结果。LINC02389 NSCLC组织中高度表达,与非小细胞肺癌患者的不良预后相关。击倒LINC02389抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的非小细胞肺癌,而miR-7-5p击倒产生相反的效果。此外,LINC02389消极监管miR-7-5p的表达。此外,LINC02389过表达,然而miR-7-5p表达下调与他们的父母相比,有顺铂耐药性NSCLC细胞细胞。此外,氧化应激生物标志物有顺铂耐药性细胞中过表达,被LINC02389监管。此外,LINC02389可以逆转顺铂对非小细胞肺癌细胞的抑制作用,由衰减部分逆转miR-7-5p的表达。结论。我们的研究首先证明lncRNA LINC02389充当一个致癌基因促进发展,氧化应激,顺铂耐药性通过骗取miR-7-5p并可能提供非小细胞肺癌的治疗靶点。

1。介绍

肺癌是最高的癌症死亡率和发病率在世界范围内,造成了一个巨大的全球癌症治疗(医疗负担1,2]。然而,空气环境恶化和经济繁荣的烟草人肺癌风险的各种原因和不同类型的癌症(3,4]。其中,非小细胞肺癌(NSCLC)是最常见的肺癌。围手术期或不可切除的非小细胞肺癌辅助治疗,如化疗、放疗、靶向治疗中发挥重要作用[5,6]。其中,cisplatin-based化疗已成为一线治疗不可切除的非小细胞肺癌。有趣的是,顺铂对其抗癌效果通过破坏核DNA (7,8),但DNA修复机制将促进快速收购顺铂耐药性的肿瘤细胞(9]。因此,顺铂耐药性已成为当前临床治疗,一个困难的问题,有必要进一步探索如何扭转这种耐药性。

最近,lncRNAs(长非编码RNA)已确定参与调停顺铂电阻(10]。lncRNA是一组RNA不编码蛋白质,但起着至关重要的作用在表观遗传调控和修改11]。lncRNA总是通过信使rna相互作用而发挥其功能,microrna的蛋白质,甚至DNA (12]。许多生物细胞内的过程,如上皮细胞间充质转变(EMT)和氧化应激通过上游受lncRNA效应(13]。在NSCLC起始和进展,lncRNA MALAT1能够引起药物抗性mir - 197 - 3 - p / p120连环蛋白轴(14]。否则,lncRNA函数的方式称为内源性RNA(龙头)竞争。lncRNA PTAR海绵miRNA101能像海绵一样,促进差别,microrna的结果对这些非小细胞肺癌细胞增殖,迁移和入侵15]。LINC02389据报道,是一个重要的预后因子在肺鳞癌(全基因组分析16]。然而,在非小细胞肺癌LINC02389仍然埋的功能。

microrna的展品在基因转录起始和抑制的效果的稳定性和翻译mRNA在最近的研究17]。microrna的家族中的一员,miR-7在转录后的修改中起着至关重要的作用。此外,大量的研究miR-7-5p显示miR-7-5p是肝细胞癌的肿瘤抑制,颜色直肠癌,乳腺癌和胶质母细胞瘤。Downregulation miR-7-5p导致油气痕迹过度在结直肠癌导致疾病进展18]。也在结直肠癌miR-7-5p负受ZFAS1诱导癌细胞发展(19]。通过miR-7-5p miR-7-5p还参与神经胶质瘤肿瘤发生/表皮生长因子受体/ PI3K / AKT /原癌基因反馈回路(20.]。有趣的是,miR-7-5p会使KLF4食道癌在结肠直肠癌,但这食道癌抑制肿瘤发生[差别生物对这些21,22]。正如之前所讨论的,miR-7-5p负相关在胃癌和胶质母细胞瘤(巧合的是23,24]。此外,miR-7-5p决心与肿瘤复发和转移有关队列研究(25]。考虑到癌细胞的药物抗性,microrna的促进宫颈癌细胞抵抗但变弱阿霉素耐药性小细胞肺癌细胞(26,27]。在非小细胞肺癌中,李等人发现miR-7-5p凋亡,细胞生长抑制作用,并通过调节细胞周期阻滞PAK2 [28]。一般来说,miR-7-5p已被广泛报道在癌症。在这项研究中,我们证明了小说在NSCLC miR-7-5p监管机制。底层机制LINC02389 / miR-7-5p-regulated顺铂耐药性仍是个谜。,我们进行了体外实验分析的角色LINC02389 / miR-7-5p变更将在非小细胞肺癌的治疗提供一个新奇。

2。方法

2.1。病人

从2016年到2018年,257名患者承认西安交通大学第二附属医院被招募进实验被成像和组织病理学诊断为非小细胞肺癌后考试。所有的病人已完全知情并签署书面同意。癌症和邻近的正常组织中获得手术。我们的研究符合赫尔辛基宣言》的要求,并经伦理委员会批准的西安交通大学第二附属医院(没有。2015 - ms - 45)。

2.2。RNA序列识别差异表达lncRNA

五cisplatin-based chemotherapy-resistant和5 cisplatin-based chemotherapy-sensitive病人的癌症和邻近组织收集和冻结RNA序列识别差异表达lncRNA抗性和敏感的肿瘤组织之间。

2.3。细胞培养和转染

A549, HCC827 MRC-5细胞系来源于美国类型文化集合(写明ATCC Genetimes,中国上海)。A549和火腿F-12K (Kaighn)介质和HCC827对待RPMI 1640中。MRC-5细胞与DMEM培养。所有的媒介是补充10%的边后卫和1%青霉素和链霉素。细胞培养在37°C公司为5%2和适当的湿度。

建立LINC02389 miR-7-5p击倒和miR-7-5p超表达细胞模型,构造和生成了慢病毒GeneChem(上海,中国)。细胞被播种在6-well板之前的日子转染和培育confluency 50 - 80%。之后,治疗慢病毒与细胞准备介绍和放大后几天的稳定转染细胞。可以通过荧光显微镜可视化效率。执行中存在表达水平检测。

2.4。中存在

每组的细胞是用PBS和试剂盒提取试剂的三倍。孤立的总RNA从细胞质和细胞核离心。优势RT-for-PCR工具包(豆类、日本)应用逆转录PCR分析。相对地转录RNA后到cDNA指令。热循环仪是编程和加热已经在实验之前。将每组RNA为模板系统,建立反应。收集每一组的相对表达水平和随后分析最终的数据。

2.5。免疫印迹

每组的细胞是用PBS和提取三次里帕补充蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂在冰上10分钟。涡和离心机的解决方案在4°C和吸管BCA的上层清液定量分析来识别蛋白质浓度。BCA试剂盒提供的是Beyotime生物技术(上海,中国)。每个蛋白质样品补充5 x加载缓冲区和煮10分钟。然后,样本electrophoretically分离在钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶(sds - page)和转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜通过半干的事后分析。块5%的脱脂牛奶1中的膜h TBST略冲洗。孵化的膜抗体H3K27ac管在4°C和一夜之间动摇。组蛋白H3是设置为内部控制。洗膜与TBST三次10分钟,然后培养相应的二级抗体H3K27ac和组蛋白H3在室温下1 - 2 h。最终,三次洗膜与TBST检测前10分钟。

2.6。芯片

染色质免疫沉淀反应的芯片进行分析(芯片)分析工具包(Beyotime,中国)。不同组的细胞与1%甲醛交联了大约10分钟与甘氨酸在室温和淬火。超声破碎法后,细胞溶解产物是孵化主要抗体anti-H3K27ac过夜。免疫沉淀反应的DNA片段受到qPCR分析LINC02389-specific引物描述。

2.7。双荧光素酶报告基因分析

miR-7-5p目标LINC02389双荧光素酶报告基因分析,合成PmirGLO-LINC02389-wt /狗矢量和miR-7-5p-overexpression /数控cotransfected A549和A549-R细胞。PmirGLO-LINC02389-wt /狗矢量和miR-7-5p-overexpression /数控设计并合成了GeneChem(上海,中国)。双荧光素酶的荧光素酶活性测定试验系统,并通过Renilla荧光素酶活性荧光素酶活动的规范化。

2.8。RNA拉试验

RNA拉试验进行探索内部LINC02389之间的串扰和miR-7-5p。磁珠与特定的结合位点LINC02389-wt /狗与细胞孵化一夜之间,其次是洗提和纯化。结果受到存在检测miR-7-5p表达式。

2.9。ROS

ROS /过氧化物检测化验设备(细胞)(英国Abcam ab139476)是利用检测每组ROS水平。种子细胞在组织培养聚苯乙烯板实验,确保前一天50 - 70% confluency当天实验。然后,遵循分析工具包的指令,妥善处理不同组织的细胞。检测结果通过标和收集数据进行进一步分析。

2.10。ELISA

探测MDA和细胞内谷胱甘肽和SOD表情,ELISA进行使用相关酶联免疫试剂盒Abcam (MDA, ab238537;谷胱甘肽,ab193767;后SOD, ab277415),制造商协议。特定的抗体MDA、谷胱甘肽和SOD与酶和细胞溶解产物孵化。酶的活动展示了每一个蛋白的表达水平。

2.11。Transwell

细胞迁移能力被Transwell试验检测。不同组的细胞被播种到小室12-well板上加无血清培养基的地方。较低的井是与特定的介质加载补充的边后卫。24 h后种植在37°C,删除与多聚甲醛参议院和修复与结晶紫染色。通过显微镜图像结果。

2.12。CCK-8

细胞计数设备8 (CCK-8 Abcam,中国上海)是利用检测的增殖率和IC50 A549和A549-R细胞。对于实验过程,细胞被镀成一个96孔板和培育confluency大约50%。CCK-8试剂添加到每个指令后,孵化一个合适的时间,和细胞增殖率曲线应由测量绘制最优密度(OD) 450海里。此外,IC50检测,不同浓度的顺铂应该添加到每个形成浓度梯度。

2.13。细胞凋亡检测

半胱天冬酶检测试剂3/7 (GeneChem、上海、中国)用于检测细胞凋亡率。简要来说,稀释剂添加到细胞和孵化30分钟,然后,测量荧光大约在502 - 530海里。

2.14。统计数据

所有结果都至少重复三次,和最具代表性的图了。作为演示了所有数据 。学生的 - - - - - -执行测试来确定两个独立样本之间的区别,和团体之间的差异是由双向方差分析使用GraphPad Prism 8.2 (GraphPad棱镜软件、圣地亚哥、钙、美国)。突出显示的图片与水平线的意思 < 0.05被认为是具有统计学意义的价值。

3所示。结果

3.1。LINC02389在NSCLC组织表达谱

LINC02389被RNA序列;热图之间的差异表达基因前20名cisplatin-based chemotherapy-resistant ( )和chemotherapy-sensitive组( )如图1(一)。257年非小细胞肺癌患者,LINC02389被在癌症组织与正常组织相比(图1 (b))。生存分析显示,257年LINC02389与预后不良相关非小细胞肺癌患者(图1 (d))。

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(一)热图识别差异表达lncRNAs有顺铂耐药性和cisplatin-sensitive病人之间。(b) LINC02389表达式在非小细胞肺癌患者和邻近的正常组织。(c) LINC02389表达式在复发和不再发生的非小细胞肺癌患者。(d)生存分析LINC02389高和低表达的非小细胞肺癌患者。(e, f) MDA和复发中谷胱甘肽的表达式和不再发生的非小细胞肺癌患者。(g h) MDA和谷胱甘肽表情LINC02389高和低表达的非小细胞肺癌患者。

此外,93年当地复发患者,我们观察到更高的LINC02389表达式,表明其潜在作用调解cisplatin-based化疗抵抗(图1 (c))。此外,我们发现局部复发患者(图增加MDA水平1 (e))和减少局部复发患者的谷胱甘肽的表达(图1 (f)),这表明氧化应激在调节中扮演重要角色cisplatin-based化疗抵抗。此外,我们发现增加MDA水平,减少谷胱甘肽表达LINC02389高表达患者(数字1 (g)和1 (h))。

3.2。在非小细胞肺癌细胞LINC02389产生致癌作用

我们发现异常高表达LINC02389 A549和HCC827 MRC5相比(图2(一个))。然后,我们在A549撞倒了LINC02389(图2 (b))和HCC827(图2 (c))。CCK-8试验表明,LINC02389击倒导致受损细胞增殖率(数字2 (d)和2 (e))。然后,我们申请了Transwell化验,发现细胞迁移试验减少LINC02389击倒(数字2 (f)和2 (g))。半胱天冬酶测定表明,3/7 LINC02389击倒导致增强细胞凋亡(数字2 (h)和2(我))。

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(一)LINC02389表达式在A549和HCC827相比MRC5细胞系。(b)击倒LINC02389 A549。(c)击倒HCC827 LINC02389。(d) CCK-8结果在A549 LINC02389击倒。(e) CCK-8结果LINC02389 HCC827击倒。(f) Transwell化验检测A549 LINC02389击倒对迁移能力的影响。(g) Transwell化验检测HCC827 LINC02389击倒对迁移能力的影响。3/7 (h)半胱天冬酶测定评价LINC02389击倒对A549细胞凋亡率的影响。3/7 (i)半胱天冬酶测定评价HCC827 LINC02389击倒对细胞凋亡率的影响。
3.3。LINC02389 H3K27ac引起的,监管NSCLC的顺铂耐药性

我们已经建立有顺铂耐药性A549细胞株(A549-R);国际扶轮是 (图3(一个))。我们发现LINC02389过表达在A549-R与A549相比(图3 (b))。在推倒LINC02389 A549-R(图3 (c)),我们已经注意到减少IC50 A549-R (2.21μg / ml),这表明LINC02389至关重要在A549的调停顺铂耐药性(图3 (d))。基于这些结果,我们假设LINC02389表达式在A549-R激活。根据UCSC基因组浏览器,我们发现H3K27ac是重要的在促进A549表达式(图3 (e))。此外,我们发现过度的H3K27ac A549-R与A549相比(图3 (f))。通过与C646治疗,我们发现在A549-R H3K27ac(图的表达下降3 (g));进一步,可以减少C646 LINC02389表达式(图3 (h))。然后,我们发现H3K27ac丰富了在启动子区域的LINC02389芯片(图3(我)),可以抑制这种浓缩C646(图3 (j))。

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(a) CCK-8试验来评估A549的IC50, A549-R顺铂(顺铂耐药)。(b) LINC02389表达A549-R与A549相比。(c)击倒A549-R LINC02389表达式。(d) CCK-8分析评估的影响LINC02389击倒的IC50 A549-R顺铂。(e) UCSC基因组浏览器探索H3K27ac浓缩。(f) H3K27ac表达A549-R与A549相比。(g) H3K27ac表达A549-R C646对待。(h) LINC02389表达A549-R C646对待。(我)芯片分析评估H3K27ac的浓缩A549-R LINC02389的启动子区域。(j)芯片分析评估H3K27ac的浓缩在启动子区域的LINC02389 A549-R C646对待。
3.4。miR-7-5p可能的下游目标LINC02389调节顺铂耐药性

我们发现LINC02389细胞质中表达主要是A549-R(图4(一));因此,我们假设LINC02389可能调节顺铂耐药性骗取小分子核糖核酸。根据母星,我们预测潜在的microRNA LINC02389目标。存在,我们发现只有miR-7-5p明显在非小细胞肺癌细胞中表达下调(图4 (b))。此外,在非小细胞肺癌患者中,我们发现miR-7-5p在NSCLC患者(图表达下调4 (c)LINC02389高表达患者)和(图4 (d))。此外,miR-7-5p压制在A549-R(图4 (e))。因此,我们假设LINC02389可能海绵miR-7-5p调节顺铂耐药性。

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(一)LINC02389表达式在A549-R细胞核和细胞质中。(b) miR-7-5p表达式在A549和HCC827与MRC5相比。(c) miR-7-5p表达式在复发和不再发生的非小细胞肺癌患者。(d)之间的相关性miR-7-5p和LINC02389表情在非小细胞肺癌患者。(e) miR-7-5p表达A549-R与A549相比。(f)击倒A549-R miR-7-5p。(g) CCK-8分析评估的影响miR-7-5p击倒的IC50 A549-R顺铂。(h) Upregulation A549-R miR-7-5p。(我)CCK-8分析评估的影响miR-7-5p upregulation的IC50 A549-R顺铂。

在A549-R,我们表达下调的表达miR-7-5p(图4 (f)),发现IC50 A549-R受损(2.16μg / ml)(图4 (g));然而,增强的IC50 A549-R miR-7-5p过表达(6.36后检测μg / ml)(数据4 (h)和4(我))。

3.5。LINC02389与miR-7-5p规范顺铂耐药性

推倒LINC02389之后,我们发现异常高表达miR-7-5p A549和A549-R(数字5(一个)和5 (b))。然后,双荧光素酶报告基因分析应用,表明miR-7-5p可能与LINC02389 A549和A549-R(数字5 (c)和5 (d))。然后,RNA拉试验证实LINC02389之间的串扰和miR-7-5p A549和A549-R(数字5 (e)和5 (f))。然后,我们撞倒LINC02389和miR-7-5p同时,发现IC50与对照组相比没有明显的影响(图5 (g))。

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(一)miR-7-5p LINC02389撞倒了A549细胞株的表达。(b) miR-7-5p表达LINC02389撞倒HCC827细胞系。(c)双荧光素酶活性测定的绑定测试LINC02389 miR-7-5p A549。(d)双荧光素酶活性测定的绑定测试LINC02389 HCC827 miR-7-5p。(e) RNA拉试验测试之间的交互miR-7-5p LINC02389 A549。(f) RNA拉试验测试之间的交互miR-7-5p HCC827 LINC02389。(g) miR-7-5p击倒可以反向的影响LINC02389击倒的IC50 A549-R顺铂。
3.6。LINC02389 /顺铂耐药性miR-7-5p监管针对氧化应激

以前,我们氧化应激在cisplatin-based缓解具有化疗耐药性的所有发现的病人。在这一部分中,我们发现降低ROS、MDA和增加谷胱甘肽和A549-R中超氧化物歧化酶(SOD)与A549(数字6(一)- - - - - -6 (d))。然后,我们发现通过击倒LINC02389 A549-R, ROS、MDA增加谷胱甘肽和SOD降低(数字6 (e)- - - - - -6 (h))。此外,我们撞倒LINC02389 miR-7-5p同时发现ROS, MDA,谷胱甘肽和SOD水平没有显著影响(数据6(我)- - - - - -6(左))。

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谷胱甘肽(模拟)她,MDA, SOD A549-R与A549表达式。谷胱甘肽(情况)她,MDA, SOD在LINC02389撞倒了A549-R表达式。谷胱甘肽(我)她,MDA, SOD LINC02389表达式和miR-7-5p A549-R撞倒了。

4所示。讨论

的机制在肺癌化疗诱导耐药性并不完全理解。目前,各种机制的理论已经形成,如DNA损伤修复、癌症干细胞,antiapoptosis,和免疫逃避29日]。然而,各种各样的分子机制需要行为影响核糖核酸或蛋白表达。miR-7-5p一直得到广泛的研究在非小细胞肺癌由于其肿瘤抑制效果,它可以影响细胞增殖和细胞凋亡28,30.,31日]。LINC02389也被建议发挥重要作用在非小细胞肺癌在先前的研究中,但其具体机制尚不清楚。我们执行中存在和免疫印迹分析非小细胞肺癌及其邻近组织。结果表明,LINC02389在NSCLC细胞高表达,而miR-7-5p是相反的。此外,LINC02389的表达显著减少局部复发患者。这些确认LINC02389和miR-7-5p确实在NSCLC差异表达。我们进一步探讨他们对在非小细胞肺癌细胞株增殖和凋亡的影响。击倒LINC02389抑制细胞凋亡的CCK-8和流式细胞术检测,而击倒miR-7-5p显示相反的效果。这类似于李的研究(28]。此外,我们还发现,LINC02389和miR-7-5p都可以促进肿瘤细胞增殖。在后续有顺铂耐药性肺癌细胞,我们发现LINC02389过表达,miR-7-5p抑制。同时,只有miR-7-5p被存在明显有顺铂耐药性细胞中表达下调。

LINC02389和miR-7-5p对肿瘤细胞的影响明显不同。这种变化在耐药肿瘤细胞在体外诱导,似乎是相关的。因此,我们进一步验证了它们之间的关系。首先,我们发现在患者高LINC02389表达式,miR-7-5p表达很低,他们负相关。相比之下,的表达miR-7-5p LINC02389击倒后显著增加。随后,我们使用了dual-luciferase报告基因检测确定LINC02389之间的负相关和miR-7-5p在非小细胞肺癌癌细胞体外,RIP和RNA拉化验建议绑定活动。换句话说,LINC02389可以作为电抗器,以减少miR-7-5p的表达。我们阐明LINC02389和miR-7-5p有顺铂耐药性细胞的表达。此外,顺铂的抑制作用是逆转LINC02389时在非小细胞肺癌细胞。这可以减毒逆转miR-7-5p的表达。 This implies that LINC02389 promotes drug resistance by downregulating miR-7-5p. Our study is the first to demonstrate the role of LINC02389 as an upstream regulator in the downregulation of miR-7-5p.

氧化应激是自由基及其代谢的不平衡(32]。它会导致DNA损伤在核苷酸(33]。许多信号通路可以触发信号级联导致活性氧,如NF -κB通路(34]。近年来,氧化应激也被认为是一个可能的肿瘤细胞药物抗性发展的潜在机制。我们观察到在MDA的表达显著差异,局部复发患者的谷胱甘肽。在体外实验中,我们调查了许多ROS生物标志物的表达蛋白质和RNA水平。我们发现ROS、MDA降低,谷胱甘肽和SOD在有顺铂耐药性细胞增加,逆转LINC02389击倒的。然而,当LINC02389和miR-7-5p同时出局,我们没有观察到任何显著变化的氧化应激指标。这表明LINC02389能促进氧化应激在有顺铂耐药性细胞,这个促销是通过调节miR-7-5p的表达。

数据可用性

所有作者确保数据和材料是可用的和透明的。

伦理批准

所有程序中执行研究涉及人类受试者按照道德标准机构和/或国家研究委员会和赫尔辛基宣言》及其修正案晚些时候或类似的道德标准。

从所有参与者获得知情同意。

的利益冲突

所有的作者宣称他们没有利益冲突。