文摘
背景和目的。乳腺癌的发病率居第一位女性肿瘤。三阴乳腺癌(TNBC),一种类型的乳腺癌,更积极,更糟糕的预后。Demethylzeylasteral (t - 96)隔离开雷公藤钩f .我们先前的研究发现,T96可以抑制TNBC通过抑制规范化和经典之中TGF -入侵β信号通路。然而,t - 96的抗肿瘤效果和机制对TNBC尚未研究。本研究旨在调查t - 96的抗肿瘤效应和机制在乳腺癌。实验方法。MTT试验、生活和死细胞分析和TUNEL被用来观察乳腺癌细胞的抗肿瘤作用与t - 96治疗。核的LSD1、Co-IP和分子对接被用来探索t - 96的直接目标和机制。皮下鼠异种移植模型被用来检测t - 96体内抗肿瘤活性的功效。关键结果。t - 96是更容易诱导细胞凋亡的高转移性TNBC细胞系(金额- 1315)。异常水平的组蛋白甲基化是一种重要的转移性肿瘤细胞的特征。LSD1是组蛋白demethylase。我们发现,t - 96可以显著减少LSD1的蛋白表达,增加其靶蛋白PTEN表达,提高组蛋白甲基化。t - 96也可以抑制PI3K / AKT信号通路,这可能被PTEN。击倒的LSD1 siRNA阻止t - 96的药理作用。和分子对接预测t - 96加工亲和力LSD1通过氢键。最后,t - 96小鼠异种移植模型中评估和- 1315细胞。和t - 96可以显著抑制肿瘤的生长,没有表现出明显的毒性。结论与意义。结果表明t - 96对高转移性TNBC的抗肿瘤活性钝化LSD1函数。
1。介绍
据统计2020年全球癌症,乳腺癌最常诊断的癌症,女性癌症死亡的首要原因。据估计,2020年有226万例新病例(占总病例的11.7%)和684996个新的死亡(总病例的6.9%)36个癌症1]。三阴乳腺癌(TNBC)占大约15%的浸润性乳腺癌,是最激进的亚型,损失的特点表达雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR),没有放大的表皮生长因子受体2 (ERBB2)。由于缺乏抗激素和anti-ERBB2靶向治疗,化疗已经TNBC患者的一线治疗选择。但化疗的临床反应是有限的和相关的毒性2,3]。因此,开发新型药物和疗法对TNBC至关重要。
表观遗传学,包括编码rna、组蛋白修饰、DNA甲基化,是潜在的可遗传的基因表达变化的研究没有DNA序列变化和基因型。(4- - - - - -6)组蛋白甲基化过程中,组蛋白的甲基转移到氨基酸蛋白质,一直与癌症、心血管疾病和阿尔茨海默病(7- - - - - -9]。组蛋白甲基转移酶和组蛋白demethylases,甲基化和脱甲基蛋白质赖氨酸和精氨酸残基,具有至关重要的作用在组蛋白甲基化调控的控制10,11]。这个家族的酶在正常生理机能和人类疾病中扮演关键角色,可能小说,化学驯良的药物发现的潜在的治疗目标。
赖氨酸(K)特殊demethylase 1 (LSD1)是第一个发现组蛋白赖氨酸demethylase和编码KDM1A基因(12]。LSD1, flavin-dependent单胺氧化酶,mono -脱甲基和H3K4 di-methyl组抑制基因表达,或将di-methylated H3K9 mono和unmethylated H3K9提高基因表达(13,14]。这种蛋白质在胚胎干细胞自我更新和组织分化,以及调节其他病理过程(15,16]。LSD1也认为是一个重要的功能在不同的肿瘤生物学过程,如增殖、细胞生存,epithelial-to-mesenchymal过渡(EMT)。和更高的LSD1表达式表明贫穷的结果17- - - - - -19]。因此,抑制LSD1癌症治疗可能是一种很有前途的药物目标(20.,21]。
雷公藤钩f(雷公藤)是一种传统的中草药,广泛分布在中国、日本、和韩国。Demethylzeylasteral (t - 96),提取雷公藤的最重要组成部分,从整个雷公藤植物或去皮木材部分(22]。和一些研究表明t - 96具有明显的免疫调节作用和抗肿瘤活性,如抑制炎症,抑制肿瘤的生长,提高化学敏感性等。23- - - - - -25]。据报道,t - 96也可以抑制引起的致瘤性肝癌干细胞通过抑制H3组蛋白lactylation,这表明t - 96的抗肿瘤作用与表观遗传分子(26]。因此,我们假设t - 96有一个通过LSD1-mediated组蛋白修饰对TNBC细胞抗肿瘤效应。在先前的研究中,我们发现t - 96可以扭转EMT和抑制TNBC的入侵细胞通过抑制TGF -β信号通路(27]。然而,它的抗肿瘤作用和机制尚未深入研究。在这项研究中,我们调查了t - 96的抗肿瘤活性两个乳腺癌细胞系,总和- 1315细胞系,高转移性乳腺癌易感基因1突变TNBC细胞系,MCF-7细胞系,一个卑微的转移和雌激素受体阳性乳腺癌细胞系。我们还探讨了t - 96的抗肿瘤机制是否通过LSD1-mediated组蛋白修饰。
2。材料和方法
2.1。试剂和材料
杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM) Penicillin-Streptomycin (10000 U /毫升),胎牛血清(的边后卫)、谷酰胺(200毫米)和来自热费希尔科学Inc .。MTT和DMSO从西格玛化工有限公司。所有抗体都来自Abcam有限公司。t - 96年从BioBioPha有限公司购买。
2.2。细胞系,细胞培养
人类乳腺癌细胞系和- 1315和MCF-7在DMEM培养补充10%的边后卫,Penicillin-Streptomycin (100 U /毫升),和谷酰胺(2毫米)37°C公司为5%2在湿润孵化器。细胞与0.5毫升0.25%胰蛋白酶消化1 - 3分钟37°C。和2毫升完全培养基添加中和胰蛋白酶。在对数生长期细胞使用。(28]
2.3。细胞生存能力分析
细胞生存能力检测到3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyl溴化四唑试验(MTT)。首先,我们播种的细胞浓度的5×103个细胞/在24小时的96孔板。t - 96在DMSO溶液溶解,准备一个父溶液浓度的100毫米。然后,细胞生长在不同浓度的t - 96 (1、2、4、8、12μ米)24 h或48 h。顺铂(CP、8μ米)作为阳性对照组。治疗后t - 96 CP 24 h或48 h, 10μL MTT的解决方案(5毫克/毫升)被添加到每个和孵化4 h。100年μL DMSO溶液添加到每个溶质晶体。吸光度测量板的读者的波长492 nm。(29日]
生活和死细胞分析也用于检测细胞生存能力。活和死细胞测定染色的解决方案是两个不同的荧光染料的混合标签生活和死细胞。细胞活细胞染色标签完整,可行的绿色。死细胞染色细胞受损等离子体膜红标签。活和死染色工具包(Yeasen,中国)是用来评估抗肿瘤活性的t - 96和- 1315细胞。有或没有接受治疗后t - 96 48 h,收集细胞通过细胞刮刀。细胞被洗,离心后的细胞悬液密度105细胞/毫升是由1×分析缓冲区。增加100μL染色试剂到200μL细胞悬液,在37°C孵化15分钟,然后,在荧光显微镜下观察(尼康、日本)。
2.4。瞬时转染
细胞接种在six-well盘子。LSD1-specific核(sc - 60970,圣克鲁斯,美国)或nontarget-specific控制核(sc - 37007,圣克鲁斯,美国)被暂时性的转染表达载体™Lipofectamine 3000转染试剂,试剂提供的指令。(30.)之后,细胞治疗与t - 96和培养48 h,为后续研究和蛋白质是收获。
2.5。Coimmunoprecipitation (coIP)测定
标准Co-IP测定,细胞细胞溶解在里帕缓冲区(Beyotime,中国)。细胞溶解产物被离心澄清14000 g×10分钟,和上层的收集。删除底部沉淀后,2μg的主要抗体加入1毫克的澄清总细胞溶解产物和孵化一夜之间在4°C。第二天,蛋白质A-agarose珠子(圣克鲁斯,美国)添加和孵化2 h。然后,珠子与冰冷的洗了三次里帕缓冲区,紧随其后的是加1×SDS resuspend加载缓冲区。microcentrifugation 30年代后,样品加热到96°C和离心机离心10分钟1分钟14000×g。(31日,32]
2.6。提取核蛋白质
核蛋白质制备按照协议从核提取工具包(Beyotime,中国)。删除PBS的生长介质和洗细胞,去除PBS后,取消了细胞与细胞刮刀。细胞被离心收获。涡5秒钟,细胞沉淀完全暂停和分散。把样品放在冰5分钟。胞质蛋白提取试剂B是添加、涡流和离心机,上层清液被新EP管。沉淀,剩余上层清液完全吸气和核蛋白质提取试剂与PMSF补充说。涡和离心后,上层的拍摄,提取的核内蛋白。
2.7。免疫印迹分析
与不同浓度的t - 96治疗后48 h,提取细胞总蛋白质里帕缓冲区,12% sds - page电泳,半干的设备转移到PVDF膜的35分钟。膜阻塞和孵化主要抗体在一夜之间推荐浓度在4°C。第二天,膜与PBS清洗三次,和二次抗体孵育1 h,然后是膜与ECL孵化。最后,被检测到的信号Tanon免疫印迹体系(上海,中国)。(33]
2.8。小鼠模型
协议下的所有小鼠实验动物保健和使用委员会批准的江苏省中医学院。裸体小鼠成长在一个装有空调的无菌环境。总和(1×10 - 1315细胞7细胞)皮下注入裸体小鼠的右翼。肿瘤变得明显时,小鼠随机分为两组,治疗t - 96(5毫克/公斤)或车辆在生理盐水(1% DMSO)了25天。体重和肿瘤大小是衡量每5天。25天,所有老鼠都牺牲了;肿瘤和组织切除,冰箱和冷冻在-80°C下实验。
2.9。免疫组织化学分析
肿瘤组织formalin-fixed,石蜡包埋,切片在5μ米厚。部分deparaffinated和水化和内源性过氧化物酶活性被3.0%的H2O2。然后,一夜之间,部分被孵化与主抗体二级抗体30分钟紧随其后。染色是可视化使用民建联工具包(Keygentec,中国)。(34]
2.10。末端转移酶的dUTP尼克结束标记(TUNEL)测定
TUNEL染色石蜡包埋的肿瘤部分执行根据制造商提供的协议(罗氏诊断,德国曼海姆)。与尼康显微镜获得的图像。
2.11。Immunofluorescent化验
肿瘤组织切片,免疫荧光分析的描述(35]。与尼康显微镜获得的图像。
2.12。分子对接
t - 96是与Chemdraw 2014和大师10.2中打开。然后,配体和配体的制备加工协议在大师10.2。和LSD1 (PDB id: 2 z5u)从PDB(下载http://www.rcsb.org/pdb10.2)和开了大师。采用滑移对接协议对接的研究。
2.13。统计分析
数据提出了均值±SD和分析通过SPSS 15.0软件,和所有的原始数据上进行 - - - - - -测试。 被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。t - 96有选择地杀死高转移性乳腺癌细胞系
在图1(一)MTT检测显示,t - 96诱导细胞毒性更有效地在高转移性TNBC细胞系(金额- 1315)比低转移性乳腺癌细胞系(MCF-7)。t - 96引起乳腺癌细胞形态的变化在这些测试(图1 (b))。总和- 1315细胞数量减少,细胞间连接消失,一些细胞萎缩,成为圆形。重大变化观察高剂量组(8μ米)。治疗- 1315细胞系和t - 96和导致细胞凋亡数量要明显高于MCF-7细胞系。所以,与低转移性乳腺癌细胞系相比,t - 96显示优惠抗增殖活动对高转移性乳腺癌细胞系(金额- 1315)。因此,总和- 1315被选为一个模型的进一步研究抗肿瘤活性和t - 96的潜在机制。
(一)
(b)
3.2。t - 96和- 1315细胞凋亡
生活和死去的测定和免疫印迹试验表明,t - 96的可行性和降低浓度的方式- 1315细胞通过细胞凋亡在图2。通过生活和死亡的分析,与对照组相比,绿色荧光细胞的数量明显减少和红色荧光t - 96治疗后增加。我们发现,t - 96显著诱导细胞死亡(图2(一个))。和明年,免疫印迹试验用于检测apoptosis-related蛋白质表达,我们发现bcl - 2、Bcl-xl两凋亡蛋白,在治疗组明显减少。但伯灵顿,proapoptotic蛋白质,在治疗组显著增加(数据2 (b)和2 (c))。这些数据表明,t - 96诱导凋亡的至少部分是通过调制bcl - 2家族蛋白的表达。
(一)
(b)
(c)
3.3。t - 96抑制LSD1-Mediate SUM1315细胞表观遗传学机制
组蛋白甲基化、组蛋白共价转译后的修改(天车)中起关键作用的规定染色质结构,及其动力学控制等细胞过程扩散,细胞周期和细胞程序性死亡36- - - - - -38]。组蛋白甲基转移酶和demethylases是主要贡献者的建立和维护不同的组蛋白赖氨酸甲基化的水平。因此,他们被认为是癌症治疗的新药物靶点[39]。LSD1,第一个发现组蛋白赖氨酸demethylase,提出调解的脱甲基H3K4me1/2和H3K9me1/2黄素腺嘌呤二核苷酸(时尚)端依赖胺氧化反应(40,41]。LSD1高度表达各种癌症和与患者的不良预后相关42,43]。在乳腺癌,LSD1 er阴性乳腺癌中高度表达,提出了作为生物标志物预测积极生物学(42]。
图1(一)表明TNBC细胞比雌激素受体阳性乳腺癌细胞更敏感的growth-inhibitory影响t - 96和暗示,t - 96通过抑制LSD1功能发挥了抗肿瘤效果。和免疫印迹试验来证明这一假设。在数据3(一个)和3 (b)结果表明,t - 96 LSD1的蛋白表达减少。接下来,我们发现,t - 96的PTEN蛋白表达增加,由LSD1[直接监管44]。和t - 96还在数据增强H3K4me2的甲基化水平3 (c)和3 (d)。PTEN是一个自然的PI3K / AKT抑制剂细胞信号通路(45]。数据3 (e)和3 (f)表明,t - 96抑制PI3K / AKT细胞信号通路活动。
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(e)
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探讨t - 96的抗肿瘤效果是否依赖LSD1,我们使用siRNAs击倒LSD1表达式,如图4(一)和4 (b)LSD1-silenced sum - 1315细胞,t - 96的抑制作用PTEN蛋白表达减弱。进一步coIP试验的结果证实,t - 96减毒LSD1之间的交互和核心人物4 (c)和4 (d)。这些结果表明LSD1需要t - 96诱导抗肿瘤效应的总和- 1315细胞。
(一)
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3.4。在硅片的行动对t - 96的预测模式
我们停靠t - 96到LSD1的晶体结构(数字出版4 (e)和4 (f)。分子对接预测,酚羟基之间的氢键形成的t - 96和ARG316,这也导致了稳定的复合物绑定交互。这个结果表明,t - 96加工向LSD1主要通过强大的亲和力很强的氢键。
3.5。t - 96诱导小鼠的抗肿瘤作用
最后,我们评估t - 96的抗肿瘤功效在活的有机体内。在异种移植模型中,总和- 1315细胞接种BALB / c裸小鼠皮下注射。然后老鼠被我。与车辆或t - 96 G(5毫克/公斤/天)为25天。与vehicle-treated组相比,t - 96治疗显著降低金额- 1315异种移植的生长(图5(一个)),减少了肿瘤的体积和重量(数字5 (b)和5 (c)(图),诱导肿瘤死亡5 (d))。图5 (e)TUNEL分析显示,与对照组相比,绿色荧光细胞发出的t - 96组的增加。和t - 96减少ki - 67蛋白表达在SUM1315细胞免疫荧光试验(图5 (f))。这些结果表明,t - 96诱导肿瘤细胞凋亡和抑制细胞增殖。t - 96增加了组蛋白的甲基化水平H3K4me2 H3k9me2和增强PTEN蛋白表达的免疫组织化学染色分析(数据5 (g)- - - - - -5(我))。进一步分析显示,t - 96并没有显示出显著的毒性对人体重量和组织(图6)。这些结果表明,t - 96表现出体内强大的抗肿瘤活性。
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4所示。讨论
TNBC比别人更加积极,导致预后较差。因此,开发一种新的治疗转移性乳腺癌或TNBC是一个吸引人的概念。- 1315是一种高转移性和TNBC细胞系。因此,在本研究和- 1315用来评估t - 96的抗肿瘤活性和探讨底层机制体外。同时,- 1315和异种移植模型被用来评估t - 96的抗肿瘤活性在活的有机体内。
一些文章报道了抑制性t - 96对乳腺癌的影响并探讨了机制。ADP-ribosylation因子1 (ARF1)起着至关重要的作用在调节囊泡形成和运输。ARF1表达的失调和活动参与乳腺癌。t - 96有可能抑制ARF1活动。通过抑制t - 96可以抑制乳腺癌细胞增殖hyperphosphorylation针对ARF1复审委员会及其下游的通路。(46)发布的一项研究我们发现t - 96可以抑制mda - mb - 231 (TNBC细胞)迁移,并抑制EMT-related基因和蛋白的表达。我们发现,t - 96抑制入侵的影响与机制通过抑制古典和模TGF -β信号通路(27]。然而,在这些先前的研究中,他们没有调查t - 96的抗肿瘤作用和机制的角度影响甲基化。如图1,我们表明,t - 96是一个抗肿瘤辅助剂,抗肿瘤活性显示在乳腺癌细胞系。和t - 96有一个更健壮的活动总和- 1315,这是一个高度转移和TNBC细胞系,并以最低的化疗反应,最坏的结果47]。我们发现,t - 96显示MCF-7可怜的抗肿瘤活性,这是另一个乳腺癌细胞系,不是TNBC细胞系。正如在图报道1(一)和2(一个)、t - 96表现出剂量依赖性的抗效应对求和- 1315细胞。bcl - 2家族蛋白成员凋亡过程的特点和监管机构。有些bcl - 2家族成员位于线粒体膜,线粒体膜透性改变,引发细胞凋亡蛋白酶活动,并决定细胞命运的(45,48]。和bcl - 2家族蛋白异常表达在人类乳腺癌[49]。在SUM1315, t - 96诱导细胞凋亡与bcl - 2和Bcl-xl表达下调,但upregulation伯灵顿表达数据2 (b)和2 (c)。
一种磷酸酶,PTEN是发现在几乎所有的人体组织。修改其他蛋白质和脂肪(脂肪)和去除磷酸基的基板(50]。作为一个肿瘤抑制,PTEN控制不同的细胞过程,蛋白质转译后的修改。一些研究表明之间有紧密的相声PTEN和p53。PTEN可能控制p53的函数通过调节p53蛋白表达水平和活动(45,51]。之后,我们检测到PTEN蛋白表达,并发现t - 96显著增加PTEN蛋白的数据的数量3(一个)和3 (b)。PTEN可能脱去磷酸磷脂酰肌醇(3、4、5)联结,PI3K的产物,和灭活PI3K / AKT细胞信号通路抑制细胞生存(52- - - - - -54]。PTEN是PI3K / AKT信号通路的拮抗剂。我们发现t - 96也可以抑制一种蛋白激酶的磷酸化(图3 (e),3 (f))。这个结果可能会进一步证实上述观察。
LSD1, flavin-containing胺氧化酶家族的一个成员和一个转录复合体的一部分,扮演着重要的角色在转录的调控和基因表达16,55]。LSD1异常在大多数癌症,与激进的病理特点和不利预后显著相关(56- - - - - -58]。重要的是,最近的研究说明抑制LSD1活动或镇压LSD1表达可以抑制肿瘤细胞生长的59- - - - - -62年]。许多研究把重点放在了LSD1在乳腺癌的作用。他们发现LSD1必不可少的乳腺癌细胞化学敏感性,如通过协调SIN3A / HDAC复杂和调节干细胞项目(63年,64年]。此外,监管LSD1 ERα在乳腺癌的信号,抑制LSD1逮捕和凋亡诱导显著增长hormone-responsive乳腺癌模型(65年]。与LSD1激活促进乳腺癌(EMT项目56]。所以,大多数的研究集中在抑制LSD1抑制入侵,乳腺癌转移,EMT (66年- - - - - -68年]。因此,LSD1是乳腺癌治疗的治疗目标。在本报告中,我们发现t - 96可以减少LSD1的蛋白表达增加H3K4me2的组蛋白甲基化和H3K9me2。此外,t - 96可以抑制PTEN蛋白表达的直接目标基因LSD1 [44]。和击倒LSD1转染基因表达的蛋白LSD1-specific siRNA可以阻止t - 96诱导PTEN蛋白表达的下调。核心,功能基因表达的调节,所需辅阻遏物可能与LSD1和增强LSD1 demethylase活动向H3K4体外和体内69年,70年]。CoIP化验结果表明,t - 96减毒LSD1之间的交互和核心。此外,分子对接实验进一步表明,t - 96处理强大的亲和力LSD1主要通过氢键相互作用。总之,这些结果表明,恢复LSD1正常表达是必要的t - 96诱导抗肿瘤活性。
我们的数据提供了重要的信息机制的t - 96作为一个有前途的治疗代理人的,有效地抑制肿瘤细胞生长和诱导癌细胞凋亡通过LSD1-mediated表观遗传机制。的t - 96诱导肿瘤细胞凋亡的具体机制是t - 96可以显著减少LSD1的蛋白表达,增加其靶蛋白PTEN表达,提高组蛋白甲基化,最后抑制PI3K / AKT信号通路(图7)。总的来说,这些结果表明,LSD1扮演着一个重要的角色在TNBC的t - 96诱导细胞凋亡细胞。我们的研究表明,t - 96值得进一步调查作为一个有前途的代理,因为选择性抗肿瘤活性的t - 96高转移性TNBC的细胞。
缩写
| t - 96: | Demethylzeylasteral |
| DMEM: | 杜尔贝科修改鹰的媒介 |
| 的边后卫: | 胎牛血清 |
| TUNEL: | 末端转移酶的dUTP尼克结束标签 |
| LSD1: | 赖氨酸(K)特殊demethylase 1 |
| coIP试验: | Coimmunoprecipitation化验 |
| MTT测定: | (3)- 4 5-cimethylthiazol-2-yl 2, 5-diphenyl溴化四唑试验 |
| TNBC: | 三阴性乳腺癌 |
| EMT: | Epithelial-to-mesenchymal过渡 |
| 雷公藤: | 雷公藤钩F。 |
数据可用性
使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。进一步的信息可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
Zhengjie沈顾Yongjuan,江公司的贡献同样这项工作。
确认
这项工作是由中国国家自然科学基金资助No.82104956, 82104939;江苏省自然科学基金。BK20190236。