hsa - mir - 105 - 1调节顺铂耐药性在针对ANXA9卵巢细胞癌

文摘

目的。顺铂是一种最有效的药物治疗卵巢癌(OC),这是最致命的类型的癌。然而,顺铂的药物抗性的发展随着时间的推移会导致许多OC患者临床疗效不佳。因此,有必要清楚地理解化学抗性的分子机制。在这项研究中,我们研究如何hsa - mir - 105 - 1函数在有顺铂耐药性OC细胞。方法。hsa - mir - 105 - 1的水平表达cisplatin-sensitive和耐OC细胞系中存在探测到。的目标基因hsa - mir - 105 - 1是由使用TargetScan和母星数据库和预测验证了双荧光素酶报告基因分析。的目标基因hsa - mir - 105 - 1被确认为ANXA9,ANXA9表达式由中存在评估,免疫印迹和免疫荧光。验证的功能hsa - mir - 105 - 1摄氏度,细胞,我们沉默或过表达hsa - mir - 105 - 1耐cisplatin-sensitive或OC细胞系,分别。此外,几个apoptosis-related蛋白质的表达水平,包括P53、P21, E2F1, bcl - 2,伯灵顿,和caspase-3检查免疫印迹分析。结果。hsa - mir - 105 - 1的水平表达是异常有顺铂耐药性OC细胞中表达下调,ANXA9在这些细胞表达明显调节。治疗与hsa - mir - 105 - 1抑制剂ANXA9信使rna和蛋白质的表达,增强顺铂电阻,和减毒cisplatin-sensitive OC细胞对顺铂诱导的细胞凋亡。此外,治疗与hsa - mir - 105 - 1模仿抑制ANXA9表达式,进一步增加了P53、P21,和伯灵顿表达E2F1的水平下降和bcl - 2表达,最后导致一个有顺铂耐药性OC细胞对顺铂的敏感性增加。结论。我们发现的差别一个对这些hsa - mir - 105 - 1表达增强顺铂耐药性,而upregulation hsa - mir - 105 - 1的恢复OC细胞对顺铂的敏感性。hsa - mir - 105 - 1 /ANXA9轴的顺铂耐药性OC细胞起着重要的作用。

1。介绍

卵巢癌(OC),它可分为卵巢上皮癌的亚型,生殖细胞瘤、卵巢性性腺间质瘤和转移性肿瘤组织起源的基础上,是一种最致命的全球妇科肿瘤(1]。有超过22万名妇女被诊断为OC和每年14万人死于它。最佳的治疗通常包括cytoreductive手术,以铂为基础的联合化疗。顺铂,也称为“青霉素的癌症,”自1971年以来治疗癌症中发挥了至关重要的作用。顺铂是一种烷化剂,不但造成国米,intrastrand DNA使交联的形成,最终导致细胞周期阻滞。最有效的抗癌药物顺铂在用于治疗卵巢癌、先天和获得性耐药经常发现顺铂。因此,晚期卵巢癌患者的5年生存率(阶段III和IV)只有20 - 30%。日益明显,耐药性的早期发现和及时调整患者的化疗方案是至关重要的为提高卵巢癌患者的临床结果。

小分子核糖核酸(microrna)组成的一组进化保守小非编码rna调节基因表达在转录和转录后的级别(2]。小分子核糖核酸在许多生物过程中扮演着重要角色,如细胞增殖、凋亡、迁移、入侵、分化、和代谢(3]。大量研究表明,microrna参与开发的化学抵抗各种癌症(4,5]。GSE的搜索数据集显示,mir - 105 - 1表达水平明显高于在noncisplatin-resistance癌症细胞相比,顺铂耐药性的癌细胞(数据未显示)。因此,我们推测,mir - 105 - 1可能发挥重要作用在顺铂药物抗性由卵巢癌肿瘤。膜联蛋白A9 (ANXA9),蛋白质膜联蛋白家族的一员,据报道参与各种肿瘤细胞的浸润和转移,如结直肠癌(CRC) (6],乳腺癌[7,8),和头颈部鳞状细胞癌的细胞9]。然而,很少有研究调查的角色ANXA9 OC。在这项研究中,我们调查了角色扮演的hsa - mir - 105 - 1和ANXA9顺铂耐药性的发展OC细胞。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

5摄氏度细胞系(SW626、SK-OV-3 tov - 112 d, A2780,和OVcar3)和正常卵巢上皮细胞系(iose - 80)是购自南京凯基生物生物技术(中国南京)。所有的细胞系最初存储在液态氮,随后允许在一个完整的恢复DMEM培养基(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)含10%胎牛血清,10000 UI /毫升青霉素,链霉素10毫克/毫升之前使用。细胞培养在湿润37°C孵化器含5%二氧化碳。

2.2。建立一个有顺铂耐药性获得OC细胞模型

建立稳定的有顺铂耐药性OC模型,SW626 OVcar3细胞暴露在逐步增加顺铂浓度(Sigma-Aldrich,达姆施塔特,德国)。简单地说, SW626或OVcar3细胞培养在6毫米板和0.1最初处理μ顺铂(浓度低于各自的IC₅₀为1个月)。随后,顺铂浓度的培养基是增加了0.1μ米每2周达最终浓度为1μ米(直到一个细胞群被选中,至少证明IC高出三倍₅₀(45μ顺铂的g / mL)比亲本细胞系)。并行、控制野生型细胞被以同样的方式对待但没有顺铂。有顺铂耐药性SW626和OVcar3细胞被指定为SW626 / DDP和OVcar3 / DDP,分别。消除残余的影响顺铂在培养基,SW626 / DDP和OVcar3 / DDP细胞培养在cisplatin-free DMEM辅助媒介2周之前,他们在实验中使用。

2.3。转染

hsa - mir - 105 - 1抑制剂和hsa - mir - 105 - 1模拟合成了GenePharma公司(上海,中国)。转染的细胞被播种到文化板块和转染用Lipofectamine TM2000(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的指示。

2.4。预测hsa - mir - 105 - 1的目标基因

目标- mir - 105 - 1基因预测使用TargetScan和母星数据库。基因,同时预测了两个数据库被确定为目标hsa - mir - 105 - 1的基因。潜在的结合位点预测。

2.5。双荧光素酶报告基因分析

野生型ANXA9片段包含潜在的结合位点hsa - mir - 105 - 1是从人类基因组DNA通过放大PrimeSTAR®海关。DNA聚合酶(豆类、日本)。引物序列如下:5 - - - - - -CCCTCGAGTGAAACTGAGCCCAATTACCAAG-3和5 - - - - - -ATTTGCGGCCGCAGTGAGGCAGAAACTATCAAAGA-3 。种子区域诱变是通过使用以下突变反向引物:5 - - - - - -TCCCTGCCCCACCCCACATGTGTAGGCTGGATCTGAGATTTCCGTGTT-3和5 - - - - - -AACACGGAAATCTCAGATCCAGCCTACACATGTGGGGTGGGGCAGGGA-3 。片段包含野生型3UTR的ANXA9(ANXA93UTR-WT)和突变体3UTR的ANXA9(ANXA93UTR-MUT)插入到下游地区psiCHECK-2子向量的荧光素酶基因的重组质粒psiCHECK-2 -ANXA93UTR-WT和psiCHECK-2 -ANXA93分别UTR-MUT。荧光素酶报告实验,psiCHECK-2 -ANXA93UTR-WT或psiCHECK-2-ANXA93UTR-MUT, hsa - mir - 105 - 1模仿或模拟数控(负控制),并与Renilla荧光素酶报告质粒pRL-TK活动暂时性cotransfected进入细胞使用Lipofectamine™2000(美国生活技术,卡尔斯巴德,CA)。转染24小时后,dual-luciferase记者分析系统(WI Promega,麦迪逊,美国)是用于检测荧光素酶活性根据制造商的协议。

2.6。实时定量PCR(存在)

总RNA提取使用RNeasy迷你包(试剂盒、德国)根据制造商的指示,然后反向转录成互补使用的主要脚本™RT试剂盒与gDNA橡皮擦(豆类、日本)。小RNA反转录成cDNA使用Mir-X microrna的第一链合成装备(豆类、日本)。使用的条件中存在如下:95°C 5分钟,40 95°C的周期15年代和50年代60°C, 95°C 15秒,15秒60°C, 95°C 15 s。hsa - mir - 105 - 1的水平ANXA9被发现使用SYBR优势qPCR预混料(豆类、日本)7900 HT快速实时PCR系统(美国应用生物系统公司,培养)。RNU6-1 (U6)和GAPDH是用作评估内部控制hsa - mir - 105 - 1ANXA9水平,分别。存在如下:使用的引物对hsa - mir - 105 - 1, (F) 5 - - - - - -ACACTCCAGCTGGGACGGATGTTTGAGCATGT-3和(R) 5 - - - - - -CTCAACTGGTGTCGTGGA-3 ;U6, (F) 5 - - - - - -CTCGCTTCGGCAGCACA-3和(R) 5 - - - - - -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3 ;ANXA9(F): 5 - - - - - -CAGCTCATCTCACGAAACTTCC-3和(R) 5 - - - - - -GGTTCGAGTGGCAAGAATTTCAA-3 ;GADP, (F) 5 - - - - - -TGTTCGTCATGGGTGTGAAC-3和(R) 5 - - - - - -ATGGCATGGACTGTGGTCAT-3 。每个PCR分析进行了一式三份。相关基因表达水平的计算使用2^−ΔΔCt方法。

2.7。西方墨点法

与150年细胞细胞溶解μL裂解缓冲(Beyotime,中国)含1%蛋白酶抑制剂(热费希尔科学)冰了5分钟,然后洗两次冰冷的PBS。接下来,细胞收获和离心机在12000 g 5分钟在4°C,和蛋白质浓度在每一个上层的决心用BCA试剂盒(Beyotime)。等量的总蛋白(20μ从每个上层清液溶解在20 g)μL的加载缓冲区(Beyotime)和钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(Beyotime)。分离蛋白乐队被转移到聚乙二烯二氟化物(罗氏应用科学,德国)膜,随后被封锁与5%脱脂奶粉1 h在室温下。免疫印迹是由孵化的膜主要抗体ANXA9, E2F1, bcl - 2,和伯灵顿(1:500稀释),P53、P21(1: 1000稀释),和caspase-3 GAPDH(1: 2000稀释)在室温下1 h。孵化后的主要抗体,膜洗,然后用一个孵化HRP-linked二级抗体(1:5000稀释)在室温下1 h。应用蛋白质乐队与增强化学发光检测试剂(Biosharp,中国),用化学发光和图像捕获摄像头(Tanon,中国)。每个乐队的染色强度测量使用ImageJ软件(美国国立卫生研究院)。GAPDH从相同的样本作为一个内部加载控制。三个独立的实验进行。

2.8。免疫荧光

治疗细胞被固定的4%多聚甲醛(PFA)和0.0075%戊二醛为15分钟;之后,他们permeabilized与磷酸盐缓冲溶液含有0.1% Triton x - 100 (PBST)和屏蔽10% BSA (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)在室温下为30分钟。一夜孵化后在4°C antimouse ANXA9 (PBST稀释1:500),这些细胞被洗与PBST(3×5分钟),然后用Alexa FluorR孵化488共轭[F (ab )2-Goat antimouse免疫球蛋白(H + L) cross-adsorbed二级抗体稀释PBST 1 H在室温下。细胞核被复染色与4 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI),细胞被安装到玻片上。图像获取与荧光显微镜(日本奥林巴斯)。

2.9。细胞生存能力

治疗细胞悬浮在培养基被播种到96孔板的密度5000细胞/好,培养24小时。培养基被替换为新的介质含有10% CCK-8解决方案(Beyotime)。孵化后1 h, OC细胞检测的可行性通过测量每个在450 nm的吸光度和荧光标(Tecan无限200 PRO,瑞士)。的集成电路₅₀值被定义为药物浓度可行的细胞的数量减少了50%相比,控制细胞并计算使用GraphPad Prism 6.0软件(美国GraphPad软件)。三个文化井用于每一个治疗组,和三个独立的实验。

2.10。流式细胞术

细胞周期检测,细胞( 细胞每口井)收获后不同治疗,然后固定在70%乙醇在4°C。固定后,在1000 g细胞离心5分钟去除乙醇;之后,他们洗,随后沾propidium碘(π)(10μg / mL)。然后细胞核糖核酸酶处理(100μg / mL)在室温下30分钟。为膜联蛋白V-fluorescein异硫氰酸酯(FITC) /πdouble-staining化验,细胞( 每)收集细胞,在室温下在1000 g离心5分钟;之后,他们在冰冷的PBS resuspended在1000 g离心5分钟,洗。接下来,500年resuspended洗细胞μL ( 缓冲区,和5μL的膜联蛋白V-fluorescein异硫氰酸酯(FITC)染色解决方案+ 5μL (PI染色的解决方案是添加到悬架。悬浮细胞被彻底地混合和孵化在室温下30分钟。治疗细胞与BD流式细胞仪分析了石中剑流式细胞分析仪(becton dickinson,富兰克林湖,新泽西,美国),和分布的细胞在细胞周期的不同阶段和细胞凋亡率测定使用FlowJo软件(美国FlowJo LLC、亚什兰或)。三个独立的实验进行。

2.11。赫斯特染色

细胞被播种到12-well板的密度 每口井。接受治疗后,这些细胞被洗两次与PBS、固定与4% PFA 20分钟,然后再洗两次PBS。固定细胞培养与赫斯特33342年染色解决方案(美国表达载体)5分钟,在显微镜下观察和细胞荧光(奥林巴斯、日本)。

2.12。统计分析

所有数据分析了使用IBM SPSS统计为Windows 19.0版本软件(美国IBM公司,阿蒙克,纽约),并表示为一个结果 ( )。比较两组使用学生的进行 - - - - - -进行了测试和比较在多个团体使用单向方差分析Student-Newman-Keuls紧随其后事后测试。一个值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。hsa - mir - 105 - 1表达下调细胞在有顺铂耐药性OC

qPCR进行化验分析的hsa - mir - 105 - 1表达水平在正常细胞和OC细胞。结果表明,hsa - mir - 105 - 1的水平在3 5摄氏度的细胞系在iose显著低于- 80细胞系(图1(一))。SW626和OVcar3细胞水平最低hsa - mir - 105 - 1,选择建立有顺铂耐药性OC细胞系为SW626 / DDP和OVcar3 / DDP,分别。父亲的细胞的生存能力和抗不同浓度的顺铂被CCK-8化验检测。结果表明,有顺铂耐药性细胞对顺铂比他们更加可行和不敏感的细胞(数字1 (b)和1 (c))。此外,qPCR化验表明,hsa - mir - 105 - 1表达有顺铂耐药性细胞的含量明显低于野生型细胞(图1 (d))。

3.2。ANXA9,目标hsa - mir - 105 - 1的基因,是调节细胞在有顺铂耐药性OC

为了调查的功能机制hsa - mir - 105 - 1, TargetScan和母星数据库被用来预测其假定的目标基因。同时分析建议ANXA9作为一个可能的目标基因hsa - mir - 105 - 1(图2(一个))。确认是否ANXA9是真正的hsa - mir - 105 - 1的目标,我们生成一个萤火虫荧光素酶报告质粒带有野生型或hsa - mir - 105 - 1突变体种子3UTR的ANXA9。荧光素酶记者化验表明,野生型的荧光素酶活动3UTR与hsa - mir - 105 - 1明显低于对照组,确认ANXA9的实际目标基因hsa - mir - 105 - 1(图2 (b))。此外,存在,免疫印迹和免疫荧光分析被用来验证hsa - mir - 105 - 1之间的关系ANXA9。这些结果显示ANXA9 mRNA表达的水平明显高于有顺铂耐药性的细胞与野生型细胞相比,这是相反的表达hsa - mir - 105(图2 (c))。此外,ANXA9的水平有顺铂耐药性细胞的蛋白表达也显著调节(数字2 (d)和2 (e))。最后,从kaplan meier绘图仪数据库获得数据(https://kmplot.com/analysis/index.php?p=service&cancer=ovar)透露,一个高水平的ANXA9表达式总是与预后不良相关OC病人(图2 (f))。

3.3。Downregulation hsa - mir - 105 ANXA9表达式和提升OC细胞顺铂耐药性的增加

调查的功能hsa - mir - 105 - 1摄氏度,细胞,A2780和tov - 112 d细胞,相对高水平的hsa - mir - 105 - 1表达,转染了hsa - mir - 105 - 1抑制剂。随后的存在和免疫印迹分析表明转染与hsa - mir - 105抑制剂调节ANXA9信使rna和蛋白质表达水平(数字3(一个)和3 (b))。免疫荧光分析也证明了hsa - mir - 105 - 1抑制剂会增加ANXA9蛋白表达(图3 (c))。与此同时,细胞转染hsa - mir - 105 - 1抑制剂表现出顺铂的高电阻,由CCK-8化验(图3 (d))。的集成电路₅₀mir - 105 - 1的值inhibitor-transfected细胞明显高于在争夺团体(图3 (e))。接下来,我们用顺铂(1刺激细胞μg / mL),和随后的流式细胞仪分析显示,较低比例的细胞治疗与hsa - mir - 105 - 1抑制剂在G0 / G1期和更高的百分比在年代和G2 / M期相比,细胞治疗的争夺(数字4(一)和4 (b))。此外,治疗与hsa - mir - 105 - 1抑制剂抑制顺铂诱导的细胞凋亡(数字4 (c)和4 (d))。赫斯特染色显示,细胞治疗与hsa - mir - 105 - 1抑制剂有更少的明亮的荧光斑点,这表明更少的细胞凋亡(图4 (e))。此外,免疫印迹的差别研究表明,对这些hsa - mir - 105 - 1水平下降P53、P21,伯灵顿,裂解Caspase-3蛋白表达增加E2F1的水平和bcl - 2蛋白表达(图4 (f))。这些结果的差别表明,对这些hsa - mir - 105 - 1可以增强顺铂耐药性OC细胞。

3.4。Upregulation hsa - mir - 105有顺铂耐药性细胞对顺铂的敏感性增加

顺铂耐药性是否可以逆转hsa - mir - 105 - 1,我们调节hsa - mir - 105 - 1的水平在有顺铂耐药性OC细胞,SW626 / DDP细胞,OVcar3 / DDP细胞。后续存在分析显示,hsa - mir - 105 - 1模仿抑制ANXA9表达在mRNA水平,免疫印迹和免疫荧光检测显示,hsa - mir - 105 - 1模拟也抑制ANXA9蛋白(数据的表达5(一个)- - - - - -5 (c))。OC的转染细胞与hsa - mir - 105 - 1模拟减少的可行性有顺铂耐药性细胞接受顺铂(图5 (d)),IC₅₀hsa - mir - 105 - 1的值mimic-transfected细胞明显低于争夺组细胞(图5 (e))。在模拟10μ顺铂的g / mL,流式细胞仪分析表明,更高比例的细胞治疗与hsa - mir - 105 - 1模拟在G0 / G1期,和显著降低百分比和G2 / M期细胞相比,处理的争夺(数字6(一)和6 (b))。流式细胞术和赫斯特污点分析都表明转染与hsa - mir - 105 - 1模拟提升对顺铂诱导的细胞凋亡(数字6 (c)- - - - - -6 (e))。此外,免疫印迹的研究表明,upregulation hsa - mir - 105 - 1增加了P53、p21,伯灵顿表达E2F1的水平下降和bcl - 2表达(图6 (f))。这些结果表明,upregulation hsa - mir - 105 - 1可能恢复顺铂敏感性在有顺铂耐药性OC细胞。

4所示。讨论

OC的发病率和死亡率近年来有所增加。虽然cisplatin-based疗法被广泛用于治疗OC,顺铂耐药性的发展已成为一个主要障碍治疗卵巢癌。因此,重要的是要理解机制负责顺铂耐药性如果这主要临床问题需要克服。在这里,我们发现hsa - mir - 105 - 1表示在有顺铂耐药性细胞异常低的水平,和它的目标基因ANXA9。

microrna不仅作为肿瘤抑制或致癌基因,而且调节药物抗性在各种癌症。近年来,它已成为越来越受欢迎的学习角色扮演的各种microrna在癌症药物抗性。在OC,许多microrna,比如mir - 132 (10],mir - 142 [11],mir - 186 [12],mir - 195 (13已报告调整顺铂耐药性。mir - 105进行的研究主要集中在其作为预后标记和调节细胞增殖的能力,细胞凋亡,转移(14- - - - - -17]。据我们所知,mir - 105与顺铂耐药性的关系只有探索在三阴乳腺癌(TNBC),显示激活Wnt /β连环蛋白信号的表达下调SFRP1从而促进TNBC的药物抗性(18]。在这项研究中,我们证明了hsa - mir - 105 - 1的表达在有顺铂耐药性OC细胞被压抑了,但和一个upregulation hsa - mir - 105 - 1可能恢复OC的顺铂敏感性细胞。

microrna经常执行他们的功能通过绑定到3UTR下游目标的mrna (17]。在我们的研究中,生物信息学分析表明,hsa - mir - 105 - 1可以直接绑定到ANXN9 mRNA。荧光素酶记者化验表明,过度的hsa - mir - 105 - 1明显压抑的荧光素酶活性,表明ANXA9 mRNA拥有hsa - mir - 105 - 1的结合位点。依照数据从荧光素酶记者分析,我们发现,治疗与hsa - mir - 105 - 1抑制剂显著提升ANXA9的表达,而治疗与hsa - mir - 105 - 1模拟抑制ANXA9 OC细胞中表达。

ANXA9是膜联蛋白家族的一员,它包含蛋白质的进化特征的能力与膜磷脂在Ca^{2 +}端依赖的方式。这个属性很可能占膜联蛋白是如何帮助调节膜的组织和渗透性和被认为依赖所谓的II型Ca^{2 +}结合位点中发现膜联蛋白的蛋白质。特别是,众多的膜联蛋白组与癌症发展密切相关(19- - - - - -21]。然而,ANXA9研究远远低于其他膜联蛋白。ANXA9,最初称为膜联蛋白31日首次发现在表达序列标签(EST)数据库(22]。的ANXA9基因(大小,8233个基点)包含14个外显子,位于人类染色体1对方篮里,编码345个氨基酸链(23,24]。ANXA9蛋白是一个独特的膜联蛋白家族的成员,因为它的细胞内活动似乎没有受钙(24,25]。最亲密的进化亲属ANXA1和ANXA226,27,这个进化枝的成员被认为功能组织和调节膜/细胞骨架的联系(27,28]。

很少有研究分析ANXA9在癌症的表达。三好et al。29日)报道,高水平的ANXA9 mRNA预测结直肠癌(CRC)患者的不良预后。另一项研究表明,ANXA9可能促进CRC通过调节的入侵和转移与肿瘤侵袭转移相关的基因(6]。在乳腺癌中,ANXA9基因表达与骨转移和患者的预后相关(7,8]。头颈部鳞状细胞癌的水平ANXA9经常改变,与肿瘤的分化等级相关,表明ANXA9与这些癌症的发病机理有关9]。上述研究表明,ANXA9在肿瘤细胞浸润和转移中扮演的角色。在这项研究中,我们发现,当ANXA9表达调节了hsa - mir - 105 - 1抑制剂,顺铂耐药性的增强,细胞分裂增加,细胞凋亡是压抑的。相反,当ANXA9被hsa - mir - 105 - 1表达下调模仿,顺铂耐药性是恢复,OC细胞仍在G0 / G1期,和细胞凋亡率增加。值得注意的是,虽然我们在体外研究表明可能的靶向治疗作用治疗有顺铂耐药性hsa - mir - 105 - 1摄氏度,在活的有机体内研究如何在OC hsa - mir - 105 - 1功能仍然缺乏。后续在活的有机体内研究调查所扮演的角色hsa - mir - 105 - 1的顺铂耐药性OC可能导致药物的发展目标hsa - mir - 105 - 1 /ANXA9轴。

5。结论

总之,目前的研究表明,hsa - mir - 105 - 1介导的顺铂敏感性OC细胞通过瞄准ANXA9和hsa - mir - 105 - 1表达被压抑在OC细胞。的差别此外,对这些hsa - mir - 105 - 1表达增强顺铂耐药性和OC细胞的凋亡率下降,而upregulation hsa - mir - 105 - 1的表达可能恢复OC细胞对顺铂的敏感性。我们的研究结果提供了新的见解如何克服顺铂治疗和获得性耐药可能有助于改善患者的治疗结果有顺铂耐药性OC。

数据可用性

数据集支持本文的结论包括在本文中。

的利益冲突

所有作者声明没有与本研究相关的利益冲突。

确认

本研究支持由河南省教育厅科学技术研究项目(172102310301)。

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