Downregulation HBx抑制扩散、迁移和入侵HepG2细胞

文摘

肝癌是一种癌症相关死亡的主要因素较差患者的生存率。同时,B肝病毒X蛋白(HBx)和XB130可能会参与肝癌的发病机制。然而,HBx / XB130肝癌的具体机制还有待进一步研究。我们的研究探讨了HBx / XB130肝癌进展的影响。HBx和XB130表达被逆转录定量聚合酶链反应检测(RT-qPCR)和免疫印迹。超表达HBx和XB130在肝癌组织和细胞被发现。机械的研究表明HBx可以结合,积极调节XB130 HepG2细胞。随后,HBx表达式被撞倒,XB130 HepG2细胞中过表达时为了观察的特定角色HBx / XB130肝癌体外。结果CCK-8, Transwell、伤口愈合和集落形成化验建议HBx可以调解HepG2细胞的生物功能激活XB130-mediated PI3K / AKT途径。总之,我们的数据表明,抑制HBx有效抑制扩散和转移,诱导肝癌细胞凋亡,这可能是部分由XB130逆转。HBx XB130可能是肝癌发病的潜在目标。

1。介绍

根据美国癌症协会的估计,肝癌是一个普遍的癌症发病率迅速增加(1]。同时,肝癌患者的存活率相对较低,例如,在英国只有20%还活着后一年诊断(2]。基于全球的一项研究中,2012年有超过700000例肝癌,其中56%的病例是由乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒的20% (3]。新兴的研究表明,HBV在肝癌的发展起着至关重要的作用[4,5]。乙型肝炎病毒是一种肝病毒科的家庭成员,目前被认为是最小的动物病毒直径42纳米和球的形状6]。虽然对乙肝病毒有有效的疫苗和治疗方法,它仍然构成了全球重大健康问题,和全球20亿人被感染乙型肝炎病毒(7]。因此,识别与乙型肝炎病毒相关的分子机制在肝癌对改善患者的生存至关重要。

此外,乙肝病毒X蛋白(HBx)密切相关的感染乙型肝炎病毒(8]。HBx是发现了乙肝病毒DNA整合成肝细胞的基因组,这通常是发现在恶性肝细胞(9]。此外,HBx与肝癌发病机制因为HBx可以调节特定protooncogenes在转录水平的表达,然而HBx的详细机制仍有待进一步研究[10]。我们的研究试图进一步的研究影响HBx肝癌进展。同时,mRNA的表达XB130(也称为AFAP1L2)被确定在许多器官,包括脾、甲状腺、肾脏、脑、肺、胰腺、肝脏、结肠和胃,和最重要的疾病与XB130是癌症11]。XB130被广泛的表达模式研究在各种人类肿瘤,如甲状腺、食管和胃癌症(12]。然而,有限的信息关于特定XB130在肝癌中的作用及其与HBx协会。进一步的勘探表明,XB130与激活磷酸肌醇3-kinase /蛋白激酶B (PI3K / AKT通路在肝癌13]。PI3K / AKT通路与增殖和分化,以及细胞凋亡的肝癌细胞(14]。具体来说,PI3K / AKT信号通路可能促进肝癌细胞增殖15]。目前的研究集中在功能作用HBx / XB130 / PI3K / AKT监管轴肝癌。我们最好的知识,本研究首次说明之间的绑定关系HBx和XB130肝癌。我们的研究将揭示一个新的HBx-related肝癌的发生机制。

2。材料和方法

2.1。研究对象

共有63名肝癌患者住院的962^nd中国人民解放军医院从2014年1月到2016年1月被纳入本研究。所有包括患者符合以下标准:(1)没有合并慢性疾病史,(2)没有手术前化疗或物理治疗的历史在962年^nd中国人民解放军医院,(3)没有相关肿瘤家族史。基于7^th版的肿瘤淋巴结转移TNM分期标准提出的国际癌症控制联盟(UICC)(2010),患者分类。所有手术切除肝癌组织和邻近正常组织(超过5厘米远离癌组织)快速存储在液态氮在-80°C。对病人是列在表的详细信息1。

2.2。芯片分析

使用Affymetrix芯片分析。从组织RNA提取试剂盒试剂(热费希尔科学Inc .)、沃尔瑟姆,妈,美国)和杂化GeneChip人类基因第2.0位数组(热费希尔科学)48°C和60 rpm,其后扫描GeneChip扫描仪™3000 7 g系统(热费希尔科学)。数据分析随后使用表达式控制台软件进行背景校正和标准化的原始数据使用健壮的多片分析。确定了根据mrna的微分表达式 - - - - - -测试。差异表达mrna的热图是策划 和 作为阈值。

2.3。实验抗体

以下抗体被用于这项研究:主要抗体HBx (ab39716,稀释1:500年免疫印迹分析;1:100年RNA免疫沉淀反应(RIP)测定;1:200年免疫组织化学(包含IHC);Abcam,剑桥,英国),XB130(1000 # 12684,稀释1:免疫印迹分析;1:把50;1:包含IHC 100;美国细胞信号技术,波士顿,MA), PI3K (ab32089, 1: 1200年,Abcam)磷酸化- (p) PI3K (ab278545, 1: 1500年,Abcam),一种蛋白激酶(# 9272,1:1000年,细胞信号技术),p-AKT (Ser473)(# 4060, 1: 2000年,细胞信号技术),和β肌动蛋白(sc - 47778;1:500年,圣克鲁斯生物技术公司,圣克鲁斯,美国CA)以及二次抗体(ab205718, 1: 10000年,Abcam)。

2.4。包含IHC

获得的肝组织样本在4%多聚甲醛固定1 h和嵌入在脱水石蜡。组织被切割,沉浸与阻塞渗透解30分钟,10分钟孵化3%过氧化氢,被5%山羊血清。共有50个μL主要抗体是添加到1小时在室温下孵化的部分,其次是二次抗体的孵化30分钟在37°C。接下来,添加了部分与50μL过氧化物酶,颜色是发达与diaminobenzidine 5分钟。组织部分与苏木精复染色。30年代的分化与盐酸乙醇后,细胞脱水,安装,在倒置显微镜下观察(IX53、奥林巴斯、东京、日本)。

2.5。细胞培养和转染

人类肝癌细胞HepG2和正常肝细胞米哈在罗斯威尔公园孵化纪念研究所- 1640中在37°C公司为5%₂。HepG2细胞的细胞悬液培养在37°C孵化器有限公司为5%₂24 h后,细胞被播种在一夜之间文化菜肴文化。包含小干扰RNA质粒针对HBx (si-HBx)和XB130 (si-XB130)碎片和空质粒转染到HepG2细胞使用Lipofectamine 2000(热费希尔科学)细胞融合达到60%。4 h posttransfection中恢复,细胞进一步培养48 h为后续实验。质粒pcDNA3.1 (GenePharma、上海、中国)被使用,而序列片段被Sangon合成生物技术(上海,中国)。

2.6。免疫印迹分析

细胞溶解在冰radioimmunoprecipitation分析缓冲区(50更易与L Tris-Cl [ ),120更易/ L氯化钠,10 L更易与氟化钠,10 L更易与焦磷酸钠,2 L更易与乙二胺四乙酸,1更易/ L Na₃签证官₄1更易与L phenylmethylsulfonyl氟化物,1% NP-40)含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏、巴塞尔、瑞士)。溶菌产物的蛋白表达是衡量bicinchoninic酸。总共30μg蛋白分离8%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)和转移到聚偏二氟乙烯(美国微孔,贝德福德,MA)膜,阻止了5%牛血清白蛋白标记后分离。随后,膜与上述孵化主要抗体在4°C 16 h,然后在室温下用二次抗体1 h。免疫反应性的蛋白质乐队使用增强化学发光体系测定(美国热费希尔科学),是量化的QuantityOne v4.6.2成像软件(Bio-Rad实验室、大力神、钙、美国)。

2.7。定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)

从组织和细胞总RNA提取试剂盒试剂(热费希尔科学),然后测量的质量和浓度的RNA使用NanoDrop ND1000分光光度计(热费希尔科学)。RNA是相对地转录成互补DNA(互补)使用miRcute microrna的互补脱氧核糖核酸合成第一链工具包(Tiangen生物技术有限公司,北京,中国)。定量PCR进行混合使用SYBR-Green我主人工具包(热费希尔科学),而PCR进行GeneAmp PCR系统(美国PE2400)。电泳的结果由一个紫外线扫描过氧化凝胶医生100凝胶检测器(Bio-Rad),用灰色值计算每个乐队的形象J软件。HBx和XB130引物(表2)合成了GenePharma(上海,中国)。

2.8。把

HepG2细胞孵化与蛋白质G-agarose珠子(罗氏)在4°C 1 h,离心分离。收集到的上层清液是孵化一夜之间在4°C 4μg抗体HBx或免疫球蛋白g(免疫球蛋白;热费希尔科学)。免疫复合物沉淀了孵化与50μ在4°C L蛋白G-agarose 3 h。琼脂糖珠被离心沉淀与溶解洗了三次缓冲区。接下来,珠被停职 (Sigma-Aldrich) 5分钟。复杂的蛋白质G-agarose珠子被移除10000×g离心5分钟,和上层清液加载到10% sds - page免疫印迹分析。

2.9。细胞计数工具包(CCK -) 8化验

细胞被播种在96 -孔板包含100μL杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM)的密度 细胞/。在24、48和72小时37°C和5%的孵化有限公司₂最初的媒介是丢弃,和新鲜的DMEM包含10μL CCK-8解决方案(豆类生物技术有限公司、大连、辽宁、中国)是补充道。另一个3 h的孵化后,光密度值(OD)细胞在450 nm测量使用标rt - 6100 (Rayto、深圳、中国),并绘制生长曲线。

2.10。集落形成实验

总共 软琼脂细胞混合0.5% (Solarbio,北京)和添加到6-well板覆盖着0.8%的琼脂。后满2毫升完全培养基,镀受到两文化。之后,殖民地被拍到和倒置显微镜下计算(IX53,奥林巴斯光学有限公司,东京,日本)。

2.11。伤口愈合实验

细胞融合90%被播种在一夜之间成为6-well板和培养在37°C公司为5%₂。伤口的间隔5毫米都是用吸管沿层附着的细胞。伤口内的细胞被磷酸盐(PBS)和新鲜培养基添加进一步的文化。细胞迁移到伤口被拍摄在0和24小时计算。

2.12。Transwell化验

HepG2细胞的入侵能力被Transwell试验评估。细胞( )被播种在0.5毫升无血清培养基,然后添加到顶端Transwell室,而0.75毫升中含5%胎牛血清添加到基底外侧室。Transwell室是孵化18 h和4%多聚甲醛固定1 h,紧随其后的是细胞碎片。与苏木精染色后(美国BD生物科学,圣何塞,CA) 1 h在室温条件下,细胞在显微镜下拍摄(IX53,奥林巴斯)和五个随机选择的视觉领域。

2.13。流式细胞术检测细胞凋亡

细胞凋亡是评估使用膜联蛋白V-fluorescein异硫氰酸酯(FITC) / propidium碘(PI)细胞凋亡检测试剂盒(Solarbio)。简单地说,细胞分离与0.25%胰蛋白酶,resuspended PBS 细胞/毫升,固定为0.7毫升绝对乙醇24 h。离心后180 g×30年代,浮在表面的被丢弃。细胞被resuspended 1毫升PBS,紧随其后的是另一个离心。与100年沉淀的细胞被停职μL核糖核酸酶(1毫克/毫升)和细胞悬液与400年孵化μL膜联蛋白V-FITC (50μg / mL) 15分钟在黑暗中。400年,μLπ(50μg / mL)被添加到细胞和在黑暗中孵化了10分钟。细胞凋亡是由流式细胞分析仪(CytoFLEX、贝克曼库尔特公司,Chaska, MN,美国)。

2.14。流式细胞术检测细胞周期

在对数生长期细胞被播种在6-well板 细胞/好,培养在一夜之间在37°C公司为5%₂。胰蛋白酶化后,细胞被离心机在1000 r / min流管5分钟。添加70%预冷乙醇后,沉淀是固定在4°C以上18 h,然后与核糖核酸酶混合(50 mg / L) 10μ信用证,π(50 mg / L),享年300岁μ信用证。经过30分钟的反应在室温下,DNA检测是由流式细胞分析仪(CytoFLEX,贝克曼库尔特),并分析了细胞周期的比例Modifit软件(Topsham真实软件,Inc .,我,美国)。

2.15。统计分析

SPSS22.0(美国IBM SPSS统计,芝加哥,IL)是用于统计分析。测量数据来自独立重复实验结果表示为 。生存分析是由kaplan meier分析的手段。配对 - - - - - -测试是用于比较两组,而单向或双向方差分析(方差分析)和图基的事后测试被用于数据比较在多个组。 被认为是统计学意义的指标。

3所示。结果

3.1。HBx和XB130调节患者的肝癌

癌症组织和邻近的正常组织获得肝癌患者。芯片分析,患者在每个阶段(T1 T4)被选中时,分别从肝癌组织中提取总RNA和邻近的正常组织。发现HBx和XB130最显著的调节基因(褶皱变化高于10)在肝癌组织中(图1(一))。因此,HBx XB130确定研究的目标。来验证芯片的可靠性数据,我们进行RT-qPCR化验。我们的研究结果表明,HBx和XB130表达调节在癌症组织的入学肝患者(数字1 (b)和1 (c)),而与肿瘤大小呈正相关(数字1 (d)和1 (e))。为了进一步检测蛋白质含量HBx XB130在肝癌组织中,包含IHC染色。正如预期的那样,积极HBx和XB130在肝癌组织中都远高于相邻的组织(图1 (f))。随后,HBx和XB130被用作生物标志物分析肝癌患者的预后。患者的中值表达式分组HBx XB130,分别。低表达患者HBx XB130显示,手术后的存活率更高(数字1 (g)和1 (h))。

3.2。HBx和XB130 HepG2细胞中异常表达

表达HBx和XB130 HepG2细胞和正常肝细胞米哈进一步探索。结果表明:HBx和XB130 HepG2细胞相比,米哈细胞中高度表达(图2(一个))。免疫印迹分析还表明,蛋白质含量HBx和XB130增加HepG2细胞与米哈(图2 (b))。结果表明,HBx XB130可能起到促进作用在肝癌的发展。因此,HepG2细胞转染pcDNA 3.1包含si-HBx或XB130-OE质粒。HBx / XB130表达在细胞被PCR量化选择最高的效率,也就是说,最低的细胞表达HBx和随后的最高表达XB130实验(数字2 (c)和2 (d))。

3.3。HBx结合XB130 HepG2细胞

接下来,我们调查了HBx和XB130 HepG2细胞之间的绑定关系。HepG2细胞间overexpressing XB130, HBx表达没有明显变化。然而,在细胞HBx损耗、XB130水平降低(图3(一个))。XB130和HBx(图的蛋白质含量3 (b))是类似于我们观察到的结果图3(一个)。相关的HBx XB130分析在肝癌组织中表达,这表明HBx表达呈正相关,XB130表达式(图3 (c))。HBx XB130进一步检测使用的绑定撕裂,这显示浓缩细胞低表达的XB130 HBx显著降低(图3 (d))。这些结果表明,HBx可能绑定到XB130 HepG2细胞影响肝癌细胞活动。

3.4。Downregulation HBx阻碍HepG2细胞的增殖,可以部分恢复XB130超表达

随后,HBx表达沉默,而XB130 HepG2细胞(图中同时4(一))。稳定转染HepG2细胞培养为0,24日,48岁和72 h,分别,紧随其后的是观察的OD值使用CCK-8测定450海里。72 h后,OD值低表达的细胞HBx明显下降。相比之下,细胞的OD值与XB130 cotransfected升高,表明增强扩散能力(图4 (b))。同时,观察细胞的集落形成细胞的数量的殖民地形成减少HBx沉默后,同时过度XB130增加细胞的数量殖民地形成(图4 (c))。这些实验的差别表明,对这些HBx HepG2细胞的增殖能力下降,同时增加XB130表达式部分逆转枯竭HBx细胞增殖的抑制作用。

3.5。失去HBx抑制HepG2细胞的迁移/入侵

伤口在5毫米的间隔HepG2细胞的进一步培养24小时观察伤口愈合的距离。创伤之间的距离明显HepG2细胞广泛的沉默HBx比与si-NC HepG2细胞,而XB130 upregulation HBx击倒的存在导致相反的结果(图5(一个))。Transwell化验发现,入侵细胞的数量减少HBx下调后,后部分增加XB130调节(图5 (b)),这表明损耗HBx抑制细胞迁移和入侵,虽然XB130反向si-HBx细胞迁移和入侵的抑制效果。

3.6。损耗的HBx促进HepG2细胞的凋亡

进一步检测表达下调的影响HBx HepG2细胞凋亡,流式细胞术,结果显示低表达HBx双阳性细胞的比例增加,进一步XB130减少细胞的过度凋亡(图6(一))。细胞周期进一步检查,发现可怜的表情HBx逮捕了多细胞G0 / G1期但少细胞S期,伴随着G2 / M期基本持平。然而,进一步XB130提升细胞的过度逮捕在G0 / G1期进入S期(图6 (b)的差别),这表明,对这些HBx增加凋亡HepG2细胞,同时XB130减少凋亡细胞的活动。

3.7。通过XB130 HBx块PI3K / AKT通路

一种蛋白激酶磷酸化的程度(Ser473)被发现在米哈和HepG2细胞免疫印迹分析。结果表明,PI3K和AKT磷酸化程度的HepG2细胞增加。此外,它的差别是发现对这些HBx PI3K和AKT磷酸化程度的降低HepG2细胞,后部分恢复XB130超表达。上述结果表明,PI3K / AKT通路的活性在HepG2细胞升高,可能是由HBx / XB130轴(图7)。

4所示。讨论

乙肝病毒已经建议明显诱发肝癌,肝癌和仍然是癌症死亡率越来越频繁的16]。然而,HBV-infected肝癌的潜在调控机制尚未充分阐述。目前的研究,以探索肝癌HBx-regulated机制,我们收集临床肝癌组织和邻近组织和肝癌细胞系HepG2购买,因为HepG2细胞是最常用的肝癌细胞系为研究[17]。

根据芯片的研究,我们发现HBx和XB130显著的调节,这是符合我们进一步检测HBx和XB130肝癌组织和细胞中表达。Arzumanyan等人发现,高度表达HBx刺激细胞迁移,在软琼脂增长,球体形成癌症干细胞(18]。我们的研究也表现出低表达患者HBx存活率更高,这是符合之前的一项研究报告,调节HBx预测一个贫穷的整体存活率和复发存活率的肝细胞癌患者19]。此外,它是证明了积极的XB130肝癌患者( )是75% (20.]。然而,XB130表达式之间的比较癌症组织和邻近的正常组织和肝癌的详细分子机制基本XB130尚未完全阐明。上述所有引用文献合作支持我们的发现HBx和XB130调节在肝癌,肝癌可能发挥致癌作用。

随后的调查探讨了监管HBx和XB130肝癌之间的关系。HepG2细胞转染pcDNA 3.1质粒的表达水平改变了HBx或XB130。免疫印迹分析,相关研究,和撕裂试验表明HBx一定会和积极的规范表达XB130在肝癌,以前没有报道,并强调了研究的新颖性。然而,绑定HBx与其他蛋白质已经被报道。例如,HBx可以绑定到细胞受损的DNA结合蛋白1是一个适配器蛋白质cullin 4的一个有趣的新基因E3泛素连接酶复杂(21]。此外,李等人报道,抑制HBx SELENBP1的可能原因之一,乙型肝炎病毒感染引起的肝细胞癌的发展(22]。XB130也被报道是一个适配器蛋白对癌症具有争议性的影响,以来表达XB130取决于不同类型的癌症(23]。我们的机械分析进一步表明,HBx PI3K / AKT通路激活通过积极调节XB130表达式。PI3K通路是一种胞内信号通路,充当一个调制器在细胞生存、增殖、分化以及在肿瘤发生中起着重要作用[24]。已经记录的水平p-PI3K p-AKT增加肝癌细胞后XB130的过度表达,表明XB130 PI3K / AKT通路激活(13]。然而,上游机制XB130-mediated PI3K / AKT途径激活尚不清楚。在目前的研究中,我们发现的抑制性影响si-HBx PI3K / AKT通路被XB130减轻,指示的监管作用HBx PI3K / AKT通路。一致,另一项研究证明了激酶AKT, ERK和物被磷酸化,激活的异位表达HBx在肝癌细胞(25]。

然后我们进一步研究影响HBx / XB130 / PI3K / AKT通路HepG2细胞的生物学功能。结果CCK-8 Transwell,伤口愈合实验,和集落形成试验表明,阻碍差别HBx对这些增殖,迁移,和入侵HepG2细胞但诱导细胞凋亡,由XB130逆转过度。此外,PI3K / AKT通路参与了HBx / XB130-mediated事件。这些结果验证我们的声明,HBx和XB130肝癌的加速发展在体外与PI3K / AKT通路。

5。结论

最后,本研究提出HBx / XB130肝癌的高表达。从力学上看,过度XB130可以部分逆转枯竭的抑制效应HBx细胞(图8),为肝癌的治疗提供了可能的目标。然而,一个在活的有机体内分析需要进一步验证我们的发现来自在体外实验。然而,目前的研究提供了一个新颖的机制与乙型肝炎病毒有关的肝癌,可能帮助开发新的治疗方法。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

信息披露

这手稿提出了<预印本>研究广场根据以下链接:https://www.researchsquare.com/article/rs-36398/v1之前,但现在它已经撤回。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者要感谢黑龙江省自然科学基金杰出青年项目的(YQ2019H035)。

引用

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