文摘
客观的。Forkhead盒O 4 (FOXO4),一个关键的蛋白在Forkhead框O (foxo)家庭,扮演着关键的角色作为一个肿瘤抑制癌症的发展。在我们之前的研究中,Peroxiredoxin1 (Prx1)促进口腔癌的发展和预测结合FOXO4。本研究的目的是调查FOXO4表达的临床病理的意义和其潜在的机制在头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)。方法。FOXO4的功能预后与头颈部鳞状细胞癌的相关性,分析了通过ONCOMINE UALCAN,人类的蛋白质图谱,cBioPortal。的表达FOXO4中检测出这种破坏沉默CaL27通过免疫印迹和SCC9细胞株。FOXO4蛋白表达是通过免疫组织化学观察(包含IHC)和绑定Prx1 FOXO4衡量Duolink分析4-nitro-quinoline-1-oxide - (4 nqo)诱导的舌头致癌模型这种破坏+ / +和这种破坏+ /−老鼠。结果。通过生物信息学手段数据库的分析,表达有显著交互作用的FOXO4临床肿瘤分期和病理成绩与头颈部鳞状细胞癌患者。FOXO4 mRNA和蛋白表达降低与穷人被发现显著相关HNSCC患者的总生存期(OS)。FOXO4表达式在HNSCC显著负相关,这种破坏组织。采用4 nqo-induced口服致癌小鼠模型,我们证实FOXO4表达减少4 nqo-induced舌鳞状细胞癌(SCC)组织与正常组织相比。Prx1击倒了upregulation FOXO4表达式的鳞状细胞癌组织和CaL27 SCC9细胞系。此外,这种破坏的交互FOXO4被Duolink观察小鼠舌组织分析。结论。FOXO4 HNSCC发展中扮演着重要的角色。FOXO4明显的低表达与较短的操作系统与头颈部鳞状细胞癌的病人。通过与Prx1 FOXO4负调控。FOXO4可能是一个潜在的分子目标HNSCC的治疗和预后。
1。介绍
头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)第六恶性肿瘤与全球每年上升700000新病例和380000例死亡。5年总生存期(OS)口腔癌患者率小于50%1,2]。HNSCC的发展是一个复杂、多步骤的过程,这是影响肿瘤生物学和外部刺激因素。研究表明,HNSCC的风险因素包括烟草、酒精、槟榔、人类乳头状瘤病毒(HPV) (3,4]。此外,饮食因素和生活方式越来越被证明是风险因素(5]。几个基因和信号通路基础HNSCC一直探索的发展。泛素接合酶E2 (UBE2C)在HNSCC具有致癌作用,和UBE2C过度预测较短生存(6]。cyclooxygenase-2患者总体生存率(cox - 2)过度遭受了更糟(7]。它报道,PTEN / PI3K / AKT通路和cox - 2信号通路可能导致早期肿瘤发生和血管生成在HNSCC [7,8]。发病机制不清楚机制严重影响临床治疗和HNSCC的存活率。迫在眉睫的是找到典型的改善HNSCC预后分子标记。
foxo,与四叉头转录因子家族成员(FOXO1、3、4、6),扮演关键角色作为肿瘤抑制提供抗氧化应激和诱导细胞周期G1 / S逮捕和细胞凋亡在肿瘤发生[9,10]。越来越多的证据表明,FOXO4表达的失调可能会加速肿瘤进展包括颈、大肠癌、胰腺癌和肺癌11]。直到现在,底层功能和机制的FOXO4 HNSCC仍然是难以捉摸的。
Peroxiredoxin1(这种破坏),一个重要的抗氧化酶,是在各种恶性肿瘤。据报道,这种破坏恶性肿瘤的发展有紧密的联系通过调节氧化应激、细胞增殖、分化、入侵和迁移12]。我们先前的研究已经表明,这种破坏能促进口腔致癌作用和转移(13,14]。这种破坏将绑定到FOXO4在发育异常的口语角化细胞(辩)细胞根据蛋白质组学分析15]。在这项研究中,我们分析了FOXO4表达的临床病理意义基于公共数据库。FOXO4的潜在机制研究4-nitro-quinoline-1-oxide - (4 nqo)诱导的舌头致癌模型这种破坏+ / +和这种破坏+ /−老鼠和OSCC细胞系。
2。方法
2.1。ONCOMINE数据库
ONCOMINE (http://www.oncomine.org)是一个癌症基因芯片数据库用于全基因组表达分析(16]。FOXO4 HNSCC分析的微分表达式是使用ONCOMINE直接采用在线分析工具。的数据类型是信使rna和截止价值和褶皱变化如下:= 0.01, ,和 。
2.2。UALCAN
UALCAN (http://ualcan.path.uab.edu),这是探索基于癌症基因组图谱(TCGA)级别RNA-seq从31癌症类型和临床数据,用于深入分析基因的表达。FOXO4 mRNA表达在正常和HNSCC组织从数据库中进行。此外,我们分析了在不同组的表达HNSCC病人,包括患者的年龄、个体癌症阶段,组织学亚型。与UALCAN (HNSCC的预后分析之后17]。
2.3。人类蛋白质图谱(HPA)
人类蛋白质图谱(http://www.proteinatlas.org)收集人类蛋白质编码基因信息包括他们的RNA和蛋白质表达和定位18]。免疫组织化学分析(包含IHC)的图像FOXO4蛋白表达与头颈部鳞状细胞癌患者的临床标本和正常组织从HPA数据库,获得FOXO4蛋白质的表达是研究确定HNSCC的预后。
2.4。cBioPortal分析
cBioPortal (http://www.cbioportal.org)是一个开放的网站资源探索、可视化和分析多维癌症基因组学数据(19]。变更和相关的总体生存率HNSCC通过cBioPortal得到。基因改变的跟踪显示概述FOXO4 /样品。
2.5。LinkedOmics数据库分析
识别FOXO4-associated基因和基因表达相关性分析进行通过LinkedOmics LinkCompare模块(http://www.linkedomics.org/login.php)[20.]。皮尔森相关系数是用来统计分析。我们筛选差异表达基因与FOXO4 HNSCC病人。结果显示在形式的火山。
2.6。细胞培养
细胞系Cal27 (crl - 2095)和SCC9 (crl - 1629)写明ATCC买来和培养high-glucose杜尔贝科修改鹰的介质(美国Gibco DMEM高葡萄糖)和火腿的F12,含10%胎牛血清(美国Gibco的边后卫),1%青霉素和链霉素(Beyotime,中国),和400 ng / mL氢化可的松(Beyotime,中国)。细胞转染与负控制(NC)和shPrx1 (5 - - - - - -CTCTTGACTTCACCTTTGTGT-3 ,GeneChem,中国)使用1来选择μ美国g / mL嘌呤霉素(σ)。
2.7。免疫印迹
完整的细胞溶解产物被变性 加载缓冲10分钟的100°C。蛋白质sds - page分离的(美国Bio-Rad),半干的电泳转移到PVDF膜(美国Bio-Rad),并分析了使用指定的抗体和发射极耦合逻辑检测系统(美国Bio-Rad)和VCL用作加载控制。主要的抗体被孵化如下:anti-Prx1(1: 8000年,Abcam) anti-FOXO4(1: 500年,春秋国旅),和anti-VCL(1: 1000年,春秋国旅)。
2.8。动物研究
所有动物实验动物伦理和福利委员会批准北京口腔医院(批准号kqyy - 201809 - 001),是根据北京市实验动物的福利和伦理审查指南。所有方法都是按照指导方针和有关规定进行。
野生型(这种破坏+ / +、C57BL / 6)小鼠和Prx1击倒(这种破坏+ /−小鼠C57BL / 6), 6 - 8周大,体重25 - 30 g,建立在我们的实验室如前所述21]。本研究使用我们之前工作的方法,和措辞描述部分繁殖的方法14,22]。这种破坏+ / +( 雄性和雌性7),这种破坏+ /−( 雄性和雌性7日)小鼠随机分为对照组( )和4 nqo-treated组( ),分别。在这项研究中,我们使用舌头4 nqo引起的致癌作用模型的指导下我们的先前的研究14]。所有的小鼠安乐死,舌头被移除;然后通过包含IHC FOXO4表达式分析了基于组织病理学变化。舌粘膜组织学变化是由两个病理学家验证包括正常粘膜上皮增生,上皮不典型增生和鳞状细胞癌根据世界卫生组织的头部和颈部肿瘤分类(第四版,2017)。
2.9。免疫组织化学分析(包含IHC)
内源性氧化物酶抗原修复和堵塞后,所有的部分都孵化与anti-FOXO4 (1: 50, Abcam)一夜之间在4°C和二级抗体(Maixin,中国)应用于37°C为30分钟。最后,幻灯片进行评估使用布朗民建联沉淀(Maixin,中国),与苏木精染色。在显微镜下(日本奥林巴斯BX61),三个区域被随机选择来自国防部的所有部分( )分析。
2.10。蛋白质对接
对接FOXO4 (PDB ID: 3 l2c)与这种破坏(PDB ID: 4 xc)使用ZDOCK执行从发现工作室(DS) 201623]。选择最好的停靠的姿势是基于评估ZRANK绑定接口的残渣。进一步用DS对接结构。
2.11。两人链接分析
Duolink接近结扎试验(PLA)是用于检测这种破坏之间的交互和FOXO4鼠标幻灯片。解放军允许下蛋白质检测内源性蛋白表达水平与高灵敏度和特异性原位。实验步骤进行(如前所述15]。
2.12。统计分析
使用SPSS 20.0统计分析(美国纽约阿蒙克的IBM公司)。通过学生的变量之间的差异进行了分析 - - - - - -测试或单向方差分析(方差分析)。使用Mann-Whitney连续变量进行了分析测试或克鲁斯卡尔-沃利斯检验邓恩的期末测验。不同变量之间的等级相关和皮尔逊相关系数的测试评估。值< 0.05被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。转录水平FOXO4与头颈部鳞状细胞癌的病人
的转录水平FOXO4 HNSCC和正常样本通过ONCOMINE数据库进行了比较。FOXO4的mRNA表达显著下调与头颈部鳞状细胞癌的病人,在三个不同的数据集(图1(一))。在彭头颈直径数据集(口腔鳞状细胞癌),FOXO4在肿瘤组织与正常组织表达下调,褶皱的变化为-2.049 ( ,图1 (b)),而这是发现mRNA FOXO4下降2.351倍克罗默头颈直径数据集( ,图1 (c)在FOXO4差别)和2.114倍对这些基因的mRNA表达Estilo头颈直径数据集从舌鳞状细胞癌( ,图1 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.2。FOXO4表达之间的相关性及与头颈部鳞状细胞癌患者的临床病理特点
接下来,FOXO4 mRNA的表达与临床病理参数之间的关系与头颈部鳞状细胞癌患者进行了分析通过UALCAN(数据基于TCGA)。如图2(一个)的mRNA表达FOXO4 HNSCC患者显著下调。FOXO4表达没有明显区别男性和女性HNSCC患者,虽然有显著减少,分别比正常的病人(图2 (b))。FOXO4 HNSCC患者表达明显低于正常对照组个体分析基于年龄(图2 (c))。FOXO4 mRNA表达非常与病人的HNSCC临床阶段(图2 (d))。的mRNA水平FOXO4明显与肿瘤病理分级有关。较低的表达FOXO4倾向于与未分化的病理级别(图2 (e))。此外,较低的mRNA的表达FOXO4大大促进了短OS HNSCC患者通过kaplan meier绘图仪(图2 (f), )。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
代表FOXO4在正常和HNSCC组织的免疫组织化学图像从HPA获得。低蛋白质的表达FOXO4被发现在正常组织中,而没有检测到表达HNSCC组织(图3(一个))。此外,如图3 (b),一个优越的长期存活率高FOXO4 HNSCC患者中可观察到蛋白质表达水平( )。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
此外,我们分析了基因改变的FOXO4 HNSCC病人和他们的对操作系统和DFS。基因变化被发现在33与头颈部鳞状细胞癌的515名患者。如图3 (c),HNSCC FOXO4变更率为6%的病人。之间没有相关基因突变的FOXO4短OS(图3 (d), )或更短的DFS(图3 (e), )基于kaplan meier HNSCC病人的情节和生存率较。
3.3。FOXO4表达式与这种破坏与头颈部鳞状细胞癌患者中,呈现负相关
如火山地块(图所示4(一)),有2596个基因(红点)和3050个基因(绿点)与FOXO4显示显著的积极的和消极的关系( )。结果表明FOXO4的广泛影响。在图4 (b),FOXO4表达呈负关联与Prx1 HNSCC的发展中发挥着积极的作用(皮尔森相关:-0.223, )。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
在目前的研究中,西方墨点法是用来证实在口腔癌FOXO4细胞系的表达CaL27 SCC9。FOXO4表达式的结果表明,水平很低,而这种破坏击倒导致显著增加FOXO4 Cal27表达式和SCC9细胞( ,数据4 (c)和4 (d))。
3.4。Prx1击倒上调FOXO4在小鼠舌组织
进一步评估的作用和关系FOXO4 Prx1口腔癌,我们发现FOXO4 4 nqo诱导蛋白表达的舌头致癌模型这种破坏+ / +和这种破坏+ /−老鼠。FOXO4鳞状细胞癌组织中的表达明显减少与正常组织相比,这种破坏+ / +老鼠(图4 (e)和4 (f), )。然而,在这种破坏+ /−小鼠与正常组织相比,减少FOXO4鳞状细胞癌组织中的表达均无显著差异(数字4 (e)和4 (f), )。在这种破坏+ /−老鼠,FOXO4正常和鳞状细胞癌组织中表达水平增加而与这种破坏+ / +老鼠(图4 (e)和4 (f), )。这进一步证实FOXO4在鳞状细胞癌组织,减少和Prx1击倒调节FOXO4表达式。
3.5。FOXO4与这种破坏在小鼠舌组织
FOXO4和Prx1的对接得分是84.82,和每一个可能的FOXO4-Prx1绑定中使用一个能源得分函数。ZDOCK对接结果表明FOXO4-Prx1 (B)表现出表面之间的界面面积虽然没有力量存在互补性FOXO4 Prx1链(图5(一个))。然后,H-bond交互FOXO4-Prx1 DS (B)进行了分析。这种破坏(B) Asp47和Ser83形成H-bonds FOXO4 Gly145和Ser143(图5(一个)①),这种破坏(B) Thr-49和Ser83形成H-bonds FOXO4 Gly145和Ser143(图5(一个)②)。这种破坏(B) Pro108和Glu123形成H-bonds FOXO4 His152和Asn153(图5(一个)③)。
(一)
(b)
HNSCC FOXO4调查机制,Duolink解放军是用来检测蛋白质相互作用原位。因此,FOXO4和这种破坏形成可视化为红色点状的点与显微镜4 nqo-induced舌组织(图5 (b)),这表明FOXO4可能直接与Prx1交互影响OSCC的进展。
4所示。讨论
HNSCC是最常见的恶性肿瘤之一,威胁着人类的生命和健康,与OSCC在头部和颈部被认为是最常见的恶性肿瘤转移和复发的风险更高(24,25]。虽然手术切除结合化疗的疗效改善结果与头颈部鳞状细胞癌患者中,已经有了很好的描述,晚期患者的生存率仍然贫穷。更重要的是,没有有效的早期诊断标志物这限制了口腔癌的预防和治疗。生物标记的识别准确性、重现性和可靠性会导致早期发现HNSCC和指导管理。一些研究显示,p16在HNSCC代孕HPV感染的标志和p16表达预测更好的临床结果(26,27]。此外,PET成像和PDL1建立诊断生物标记物在临床上用于HNSCC [27]。作为一个肿瘤抑制基因p53突变和超表达在OSCC导致预后不良(28]。HNSCC是一个多步过程涉及多个癌基因和肿瘤抑制基因包括p16、细胞周期蛋白D1, p53 [29日]。
foxo,属于叉头转录因子家族,参与细胞的命运,包括细胞周期逮捕,细胞增殖和细胞凋亡10,25]。一些研究表明,FOXO负监管由磷酸肌醇PI3k / AKT信号通路,促进胞质封存FOXO FOXO和结果的失活在一些癌症。最近的实验和临床研究调查,FOXO3和FOXO4发挥重要作用在乳腺癌的进展,胰腺癌,和其他癌症30.,31日]。FOXO4表达式被报道减少肾癌和膀胱癌32]。在肿瘤发生过程中,能力FOXO4消除活性氧(ROS)被发现PI3K / Akt途径表达下调,从而导致增加细胞内ROS水平。然而,ROS增加生产会产生压力激发了激酶和c-Jun n端激酶(物)提高FOXO4活动和功能(10]。
在这项研究中,FOXO4的mRNA水平表达和分析并运用Ualcan TCGA(基于)和ONCOMINE数据库之间的关系,探索FOXO4 HNSCC患者的表达和临床意义。结果表明,FOXO4 HNSCC组织中表达明显低于在正常组织,和下FOXO4表达这些病人OS率较低有关。失去FOXO4表达与肿瘤分化程度和临床阶段基于TCGA的数据。FOXO4 mRNA表达非常与病人的个人HNSCC临床分期和肿瘤病理等级。较低的表达FOXO4倾向于与未分化的病理级别。最低的mRNA的表达FOXO4观察在三年级而不是4级(图2 (e)),可能是由于小的患者数量在4级(7例)。总之,数据表明,转录和蛋白质表达水平FOXO4与HNSCC患者临床病理参数显著相关。它建议FOXO4可以预测生物标志物HNSCC患者的生存。
在先前的研究中,我们发现,通过可能绑定FOXO4 Prx1扮演着重要的角色在人类发育异常的口语角化细胞(辩)细胞基于质谱和生物信息学分析15]。据报道,这种破坏主要是位于细胞质和细胞核的主要抗氧化功能(33]。这种破坏防止细胞氧化应激和清除活性氧(12]。我们先前的研究显示,这种破坏的表达是人类口腔白斑(OLK)和增加OSCC组织。在4 nqo-induced舌头OLK动物模型,这种破坏击倒增加细胞凋亡和抑制口腔致癌作用。此外,与OSCC的异种移植模型中,我们发现这种破坏击倒显著抑制舌癌转移率和EMT过程(13,14]。一些研究表明,FOXO4也是一种抗氧化剂主要位于细胞核(34]。FOXO4可以停止氧化应激诱导细胞凋亡,影响衰老PI3K / AKT, Ras-MEK-ERK、IKK, AMPK途径10]。这种破坏可以直接调节FOXO3为约束力的合作伙伴(35]。
在目前的研究中,这种破坏负监管FOXO4 HNSCC患者基于cBioPortal分析表达式。我们证实了这种破坏击倒的表达增加FOXO4 Cal27和SCC9细胞。同样,这种破坏沉默诱导upregulation FOXO4表达4 nqo-induced舌鳞状细胞癌组织。Duolink分析表明,这种破坏与FOXO4在小鼠舌组织。根据这些数据,我们得出的结论是,在氧化应激条件下,这种破坏与FOXO4和消极交互调节其表达。随后,这种破坏促进胞质FOXO4封存,结果在某些FOXO4失活。协调行动促进口腔癌症的发展。的潜在机制FOXO4 HNSCC进展的需要进一步研究。
5。结论
FOXO4 HNSCC发展中扮演着重要的角色。FOXO4的低表达与较短的操作系统与头颈部鳞状细胞癌患者。这种破坏与FOXO4和负调控其表达。研究结果表明,FOXO4可能是一个潜在的分子目标HNSCC治疗和预后。
数据可用性
所有生成的数据或分析包括在这项研究。一些数据支持这项研究是生物信息学手段数据库,从之前报道的研究和数据集引用。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
这项研究是由北京自然科学基金(7192075)。我们感谢所有成员的贡献参与协助这项研究。