文摘

伤口愈合上皮损伤后修复角膜屏障功能是必不可少的,需要协调上皮表运动受伤的地区。的存在和作用在多层pannexin1上皮表迁移在完好无损的检查,受伤角膜上皮从C57BL / 6 j (B6)控制和食源性肥胖(戴奥)小鼠,pretype 2糖尿病模型。我们假设pannexin1特异表达,两种离子通道蛋白之间的相互作用(P2X7和pannexin1) pretype 2中改变糖尿病组织。Pannexin1被发现出现在完好无损的组织,细胞边界和戴奥之间没有观察到显著差异和B6控制。然而,上皮清创术诱导pannexin1定位显著的区别。B6控制上皮显示强烈的前缘附近的染色,发现地区钙动员,而戴奥角膜上皮细胞的染色是分散和缺乏明显的等级强度从前缘。戴奥组织细胞远端伤口是不规则的形状,和上皮的形态相似,抑制与10 panx pannexin1抑制剂。Pannexin1抑制钙动员降低细胞间前缘附近和MATLAB脚本显示信息交流的减少,也在培养细胞中发现。接近结扎来确定执行P2X7和pannexin1交互是能动性和沟通的一个必要组成部分。虽然没有显著差异的交互在完好无损的戴奥和B6控制角膜上皮,有大大减少交互受伤戴奥角膜伤口附近和边缘。 The results demonstrate that pannexin1 contributes to the healing response, and P2X7 and pannexin1 coordination may be a required component of cell-cell communication and an underlying reason for the lack of pathologic tissue migration.

1。介绍

肥胖是一个主要的危险因素为2型糖尿病的发展。角膜是一个优秀的机关检查饮食对伤口愈合的影响,因为它是一个相对简单的无血管的组织氧合通过扩散。角膜上皮修复需要大量的同步事件,包括,但不限于,细胞活性、信息交流、基质沉积和组织重构(1,2]。在糖尿病中,顶端角膜上皮及其紧密连接成为妥协,和大分子和病原体可以穿透上皮。这个受损功能似乎加重了患者的糖化血红蛋白水平升高(3- - - - - -5)和提高延迟伤口愈合后损伤的风险,上皮脆弱,可能减少角膜上皮刚度(6- - - - - -8]。

最早的示威活动受伤的响应是由live-cell兔角膜上皮细胞的成像。在这项研究中,观察到的创伤性释放核苷酸引发了瞬态钙(Ca^{2 +}伤口附近)动员网站交叉非细胞区域,表明它是独立于缝隙连接(9]。除了初始释放ATP,因素,如表皮生长因子,细胞因子,和其它核苷酸释放眼泪,激活生长因子受体,和其他蛋白质(10,11]。ATP结合并激活一个大家庭的跨膜purinoreceptors (P2Y和P2X受体)在角膜导致下游信号(9,11,12]。蛋白P2Y受体引起细胞内钙的增加^{2 +},而P2X受体离子通道和门口钙和其他离子13,14]。一P2X受体,P2X7,通常被认为是痛觉感受器,既表达了角膜上皮和神经(15,16),和介导细胞迁移17]。在正常生理条件下,P2X7本地化是强烈的上皮细胞前缘附近的伤口;然而,一旦伤口的边缘和上皮restratifies接触,其定位可以沿着细胞边界(17]。体外研究表明,激活P2X7受体的抒发一种独特的Ca^{2 +}动员概要,游遍上皮表预测循环模式显示信息交流而不是通过缝隙连接但通过pannexin渠道(18]。

研究糖尿病角膜上皮显示显著增加(4-7-fold) P2X7 mRNA相比,年龄匹配的个人(15,17]。此外,还有一份报告,2型糖尿病患者增加了P2X7控制个体相比,外周血单核细胞(19]。先前的研究在角膜上皮pretype 2糖尿病肥胖小鼠模型表明,有一个失去感觉上皮神经和改变P2X7本地化后的上皮和间质角膜擦伤(6]。此外,调查表明,交互P2X7 pannexin1,另一个离子通道,出现在培养角膜上皮细胞的研究中,而其他的研究表明,P2X7基因敲除小鼠显示减少pannexin1 [18,20.,21]。这些数据表明pannexin1和P2X7可以作为传感蛋白前缘附近的伤口。

pannexins属于一个家庭的大孔隙的蛋白质运输和释放细胞内ATP进入间隙空间通过一个单一的膜通道,而这样做,在信号扮演许多角色,炎症和细胞骨架重组(22,23]。研究人员推测,ATP穿过pannexin渠道和激活P2X受体在前馈模式(24]。最近,我们发现pannexin1前缘附近的伤口在培养的上皮细胞和证明P2X7受体激活被废除pannexin1抑制(18]。总的来说,这些结果表明,上皮细胞显示一个复杂的曲目pannexin1和P2X7之间的通信。

本研究的主要目的是确定是否有不同定位的pannexin1 P2X7之间的关系和pannexin1 C57BL / 6 j (B6)控制和pretype 2糖尿病小鼠角膜上皮(戴奥)。我们假设pannexin1促进愈合过程通过其前缘附近的定位,通过其渠道和ATP的后续运动激活P2X7受体,促进迁移。pannexin1定位相似时完好无损的角膜上皮细胞从组织损伤后存在显著的不同。2小时后,pannexin1毗邻地区的前沿在B6强烈控制和分散在戴奥;然而,20小时后,这种反应那么激烈B6控制和戴奥组织。pannexin1抑制时,在信息交流减少了50%,而B6控制。此外,接近结扎化验(PLA)表明,当P2X7和pannexin1显示类似的完好无损的眼角膜的交互水平,有显著减少受伤戴奥角膜上皮的协会。潜在的协同关系和物理协会表明pannexin1可能是伤口的潜在药理干预的目标。

2。材料和方法

2.1。抗体和抑制剂

免疫组织化学,anti-pannexin1兔多克隆抗体针对pannexin1(猫。# acc - 234)和anti-P2X7兔多克隆抗体针对P2X7受体(猫。# 4月- 004年)从Alomone购买实验室(耶路撒冷,以色列)。邻近结扎试验,老鼠anti-pannexin1单克隆抗体针对pannexin1(猫。# sc - 515941)是购自圣克鲁斯生物技术(达拉斯,TX)和anti-P2X7兔多克隆抗体针对P2X7受体的细胞外域(猫。# apr - 008)是购自Alomone实验室。10 panx pannexin1模仿抑制肽(猫。# 3348),炒肽买来Tocris生物科学(明尼阿波利斯、锰)。Alexa Fluor-conjugated + 488驴anti-rabbit和鼠标免疫球蛋白二次抗体和rhodamine-phalloidin从英杰公司购买(CA)卡尔斯巴德。

2.2。组织准备和器官的文化

所有的老鼠都购自杰克逊实验室(杰克逊实验室;巴尔港,我),研究协议符合标准的研究视野和眼科协会眼科保健和视觉研究中使用的动物,以及波士顿大学IACUC。美联储C57BL / 6 j小鼠是控制饮食(B6控制)或高脂肪饮食诱导肥胖(戴奥)(杰克逊实验室):控制饮食D12450B(10千卡%脂肪,3.8千卡/克)和高脂肪饮食D12492(60千卡%脂肪,5.2千卡/克)(6]。

检查定位P2X7和pannexin1受伤,1.5毫米清创伤口进行B6控制和戴奥老鼠,如前所述[6,17,18]。清创后,小鼠安乐死,眼睛阐明,并放置在器官培养12,17采用无血清,孵化角化细胞介质(表达载体卡尔斯巴德,CA)含有100μ青霉素g / mL和100年μg / mL链霉素2 8到20小时37°C和5%的公司₂。最低3眼睛每个时间点的条件进行了分析。

2.3。免疫荧光

每个时间点后,金球奖被固定在刚做好的磷酸盐(PBS), 4%的多聚甲醛在室温下pH值7.2,30分钟(RT)。Immunofluorescent染色进行(17]permeabilizing和屏蔽屏蔽解决方案(PBS(93%的组织 ),特里同x - 100 (10% ),BSA (5% ))一小时(人力资源)rt组织孵化在初级抗体稀释在屏蔽解决方案在一夜之间在4°C(稀释将描述每个实验)和PBS洗。Alexa Fluor-conjugated 488二级抗体(表达载体,卡尔斯巴德,CA)使用的稀释1:300年屏蔽解决方案1小时与PBS RT之前再洗。组织与rhodamine-conjugated counter-stained phalloidin(表达载体,1:50)可视化f -肌动蛋白。细胞或组织安装使用VectaSHIELD包含4 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)(向量实验室,伯林盖姆,CA)可视化细胞核。主要的抗体被排除在次级控制组织。染色后,眼角膜被使用共焦显微成像。

2.4。对免疫荧光共焦显微镜

组织是由切角膜为径向部分和削减蝴蝶缝到巩膜的边缘为了平组织统一的图像(17]。组织被夹在p35区域MatTek组织培养皿(MatTek;亚什兰、马)和一个玻璃盖玻片和成像写从顶端上皮细胞向间质蔡司LSM 700(蔡司、Thornwood NY)共焦显微镜。荧光获得水平组使用二级控制样本,与针孔大小保持在1的单位。所有图片的设置和目标没有改变为了消除数据由于不同共焦设置的变化。每个区域是收集 - - - - - -栈在1μm步骤,包括顶端和基底细胞。

2.5。接近结扎试验(PLA)

蛋白质的检测距离结扎试验(PLA)都使用一个鼠标anti-pannexin1单克隆抗体和一个anti-P2X7兔多克隆抗体P2X7受体的细胞外领域的目标。检测进行了使用Duolink®试剂(Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼)根据制造商的Duolink®解放军荧光协议用细微的修改。驴子anti-mouse (DUO92004)和驴anti-rabbit + (DUO92002)解放军探针,连同Duolink®屏蔽解决方案,抗体稀释剂,结扎缓冲区,放大缓冲区,和特定的清洗缓冲,在试验中使用。组织部分被孵化阻断缓冲区60分钟37°C预热湿度室。抗体稀释1:100 (anti-pannexin1)和1:300 (anti-P2X7)抗体稀释剂,应用于组织,在RT孵化2小时,然后洗1 x洗缓冲区在RT +和-探针在抗体稀释剂稀释混合物,和部分孵化为1小时37°C加热湿度室。部分被洗了洗缓冲区在rt,结扎缓冲区在高纯度水混合,并添加了连接酶和孵化30分钟37°C加热湿度室。部分被洗了洗缓冲放大rt,部分被孵化的缓冲区包含聚合酶100分钟37°C加热湿度室。部分被洗了洗缓冲B RT然后0.01 x洗缓冲B .组织成像在蔡司Axiovert LSM 700。

2.6。分析邻近结扎

图片被附近的前缘和相邻区域的边缘使用瓷砖函数和光学切片。进行了分析与ImageJ CellProfiler (Broad研究所、剑桥MA)来确定DNA结扎发生通过评估荧光,它只发生如果解放军+和-探针在40 nm彼此的25]。为puncta分析,图像导入ImageJ;一个初始的阈值进行分离puncta从背景噪音,和文件导出到CellProfiler。现场检测管道puncta被用来计数。的大小平均puncta决心使用测量工具在CellProfiler ImageJ和细化。为了一致性,同样的分析参数用于所有图像。使用GraphPad棱镜5执行统计分析。

2.7。钙(Ca^{2 +})动员

Ca^{2 +}动员实验进行体外小鼠角膜(18]。总之,眼角膜preincubated在卡尔- 520点和CellMask™深红色(热费希尔,沃尔瑟姆,MA) 30分钟37°C和5%的公司₂。卡尔- 520是用于1:100年,和使用CellMask深红色1:10000年,DMSO和普朗尼克酸的最终浓度为1% ( )和20% ( ),分别。多余染料被免职,眼角膜被安装在聚乙二醇使硅烷化玻璃底菜(26]。体外成像,人类角膜上皮细胞(HCE) (17)是培养融合玻璃底菜和预加载钙指示剂染料。图片收集每5秒45分钟在蔡司Axiovert LSM 880共焦显微镜(卡尔蔡司,白色平原,纽约)利用快速模块和AIRYScan。

2.8。Ca的建模^{2 +}波

图像分析进行使用斐济/ ImageJ (NIH,马里兰州贝塞斯达)和MATLAB脚本(MATLAB, MathWorks公司)是专门为Ca的分析^{2 +}波,如前所述12,18,27]。总之,每个实验的视频导出为TIF或AVI格式,导入自定义MATLAB脚本,对Ca和分析^{2 +}反应基于细胞群(单个细胞或组的细胞)。这些特定的MATLAB脚本启用评估这些细胞群的时空,和通信通过识别Ca^{2 +}事件、事件产生波动曲线记录仪和计算相邻的细胞有一个Ca的概率^{2 +}事件是诱导后10帧内建立了Ca^{2 +}事件发生在一个给定的细胞。在实验室自动化计算机程序开发标志着每个细胞的位置和跟踪每个细胞通过计算和质心位置为每个注册个人区域的参考系。检测这些事件的起始帧手动选择。其他脚本是用来纠正轻微运动或漂移的帧。

2.9。统计分析

值以获得 (SEM)从至少三个独立的实验。统计学意义是由未配对,单侧学生的 - - - - - -用适当的事后测试或一个或双向方差分析测试使用GraphPad棱镜5 (GraphPad软件,圣地亚哥,CA)和R工作室(RStudio, Inc .,波士顿,MA)。

3所示。结果与讨论

3.1。Pannexin1的表达和定位

Pannexins属于一个家庭的蛋白质释放细胞内ATP通过一个单一的膜通道,然后激活purinoreceptors,特别是离子通道受体P2X7 [24]。pannexin1通道信号的角色数量,炎症和细胞骨架重组引起的机械变形(22,23]。最近,李et al。18]显示体外抑制pannexin1延迟伤口愈合,我们将此归因于异常方向的能动性。此外,降低信息交流。以前,我们发现有一个定位的改变的上皮清创后P2X7 B6小鼠的控制。伤口闭合和上皮分层后,这个定位回到观察完好无损的组织(17]。相比之下,有一个不同的本地化P2X7戴奥眼角膜受伤后(6]。这些数据让我们推测P2X7和前缘pannexin1可以作为传感器的伤口;然而,在伤口愈合的组织受损,这些传感器可能不会发生。此外,尚不清楚如果P2X7之间的关系和pannexin1对于信息交流是必要的,如果检测到这种交互在肥胖或糖尿病组织。

进一步探索这种关系,pannexin1检查在上皮的本地化之前和之后的伤口清创术2 B6 pretype控制糖尿病(戴奥)老鼠(图1)。B6控制和戴奥完好无损的上皮,pannexin1沿着细胞边界(图检测1(一)(插图)),戴奥组织显示更广泛的细胞质pannexin1染色。两个小时postdebridement, pannexin1 B6控制上皮染色是强烈的前缘附近的细胞边界和大约5 - 6行(图1(一))。相比之下,pannexin1戴奥组织分散,缺乏维生素B6的强度检测控制(图1(一))。在8小时,沿细胞边界区域的染色B6控制组织立即下降到只有两行前缘(虚线)。有趣的是,8小时的染色模式和强度戴奥组织类似于B6控制。此外,戴奥的前沿组织一直更粗糙,像在操纵他们更脆弱。20小时,pannexin1在场上皮细胞边界戴奥和B6控制;然而,点状的染色前缘附近著名的B6控制。我们推测,这个定位是指示性的内吞作用来响应升高ATP。远端前缘在20小时(图1(一)大纲),典型的基底上皮鹅卵石形状出现在B6控制组织,而细胞更细长的戴奥(图1(一)大纲;放大图1 (b)(星号))。我们推测,细长的形态是由于机械力的变化,改变了细胞的细胞骨架结构。这个假设是由类似的拉伸上皮表型的检测live-cell电影培养的上皮细胞治疗10 panx,特定的pannexin1抑制剂(18]。

我们假设损伤诱发不同的表型,戴奥组织没有出现激活诱导的信号重构。一个潜在的原因可能是糖尿病的法规遵循上皮细胞减少导致机械变形随着细胞的变化,这可能改变pannexin1-mediated ATP的释放和激活P2X7受体在其他组织(23]。支持这个设想是实验数据证明戴奥上皮明显比B6控制(软8)和初步数据表明糖尿病上皮是比戴奥组织柔软。

3.2。抑制Pannexin1调节肌动蛋白重组和信息交流

自定位的pannexin1 B6控制和戴奥上皮在2小时postdebridement不同强度和细胞的数量显示增强的前缘附近的染色,我们调查了pannexin1在迁移和信息交流的作用。检查这个,B6控制眼角膜孵化与10 panx(特定的肽抑制pannexin1)或炒控制肽和上皮清创后2小时检查(图2)。眼角膜被孵化时包含炒肽中,f -肌动蛋白显示典型的肌动蛋白细胞骨架重组前缘的伤口,最小的细胞所面临的伤口。在10 panx, f -肌动蛋白结合在前沿,有一个在伤口附近的细胞形状不规则。

检查pannexin1在信息交流中的作用,Ca^{2 +}动员live-cell实验后角膜上皮损伤。B6控制眼角膜装满cal - 520点,还要经历一个很长的半衰期和钙指标比Fluo-3更激烈点,和counter-stained CellMask深红色,质膜染色,允许可视化角膜上皮的18]。后者染料允许我们确定基底细胞成像时,由于角膜上皮是多层次的。眼角膜是孵化与紧急控制肽(控制)或10 panx,随着时间的推移和事件记录(图3(一个))。图片导出到一个MATLAB脚本(18)和MATLAB-detected事件被确定为荧光事件的阈值大于50%的最大归一化荧光信号。细胞被发现使用图像坐标研究视频,和代表事件为每个条件(图图表生成3 (b))。pannexin1抑制时,MATLAB-detected事件大大降低(数字3(一个)和3 (b))。这些结果表明,信息交流需要pannexin1通道。在图3 (c)的角色,我们分析了pannexin1角膜上皮细胞之间的通信和显示有显著降低( )的可能性(或事件概率)细胞信号时pannexin1与10 panx抑制。这些结果支持我们的假设,在Ca pannexin1渠道发挥着至关重要的作用^{2 +}动员和角膜上皮细胞之间的沟通发生在前缘。这项研究让我们检查动态通信发生在基底细胞损伤后的前缘。未来将会进行实验来研究不同层之间的通信的角膜上皮和地区。协调响应图中观察到3的部分原因可能是由于pannexin1,通道蛋白,传输ATP的细胞,可能一些前沿的细胞(28]。这些数据是由早期的研究在其他细胞系统表明前馈系统的存在ATP穿过pannexin1渠道和激活P2X7受体(24]。未来的研究将检查时释放ATP水平pannexin1渠道与10 panx抑制肥胖或糖尿病组织。然而,角膜上皮体外实验的结果表明,沿着伤口边缘ATP的释放被抑制,从而消除了ATP梯度,荣格尔在中性粒细胞(29日]。

此外,我们想要评估如果受伤后的事件发生在我们的体外结果类似于那些我们从体外检测实验。要做到这一点,我们比较细胞前缘附近的概率会到另一个细胞在两种系统进行通信,我们发现没有显著差异(图3 (d))。一致性是有趣的,因为体外文化代表的是单一的上皮细胞层,而体外成像是一个完整的角膜的角膜上皮细胞基底。

3.3。交互Pannexin1 P2X7

由此产生的细胞间Ca^{2 +}动员和肌动蛋白重组糖尿病角膜上皮显示一个错综复杂的在2之间的通信通道蛋白,pannexin1 P2X7。在分析提出pannexin1 signalome [30.),我们假设有重大变化之间的交互P2X7和pannexin1 pretype 2糖尿病角膜上皮(戴奥)相比,B6控制模型。这种变化在协会可能构成伤口愈合延迟和混乱中观察到糖尿病角膜模型。尽管之前的免疫沉淀反应实验证明pannexin1与P2X7在培养的上皮细胞18),这些实验没有地址关联的定位在完好无损的和受伤的角膜上皮,或协会是如何改变糖尿病角膜。为了解决这个问题,我们进行了解放军在完好无损的角膜和角膜损伤后2小时。这个时间点被选中,是因为之前的实验表明,有显著性差异的本地化P2X7和pannexin1 2小鼠模型。放大的过程,最终产生一个可见的信号只会发生如果两个抗体在40 nm。这种技术被用来检测P2X7 / pannexin1交互在整个组织,特别是在该地区附近,远端伤口。

光学图像收集从基础到顶端层上皮和作为写(基底层)和正交(厚度)视图(图4(一))。所有在同一激光增益和强度成像进行设置,建立了通过考试的负面控制和后续分析重叠的像素点(见方法)。对比染色的上皮罗丹明phalloidin(图4(一)肌动蛋白)进行改进组织的可见性。在完好无损的B6控制上皮,P2X7 pannexin1强colocalization沿着细胞边界(图显示4(一))。在正交图像,有许多puncta顶端和基底细胞。在戴奥写和正交部分,P2X7和pannexin1协会是类似于B6控制(图4(一))。两个小时后受伤,有一个明显的变化B6控制和戴奥之间的协会组织。B6控制,有强烈的染色在写和正交图像。有解放军punctae在最顶端细胞明显多于有基底细胞,而且似乎减少了前沿的协会(图4(一)昊图公司)。戴奥组织损伤后,有一个“线”的荧光在前沿,然而大大减少与punctae伤口。与B6控制一样,强烈的顶端染色显示的戴奥眼角膜上皮细胞;然而,只有最小的协会在基底细胞。这种定性数据导出到ImageJ进行初步处理,然后使用CellProfiler软件分析和量化。我们优化CellProfiler管道识别,提高punctae在一个适当的大小,由ImageJ初步分析。细胞分别进行分析,以确保最佳解放军puncta探测。一些细胞在前缘和背部的伤口被选择进行分析,以确保统计显著性。的平均数量puncta完好无损的,边缘的伤口,从伤口边缘条件计算B6控制和戴奥样品。与图基双向方差分析的方法进行多重比较。 In the unwounded tissue, there was no statistically significant difference in the number of puncta per micron between B6 control and DiO tissue ( )(图4 (b))。此外,受伤后B6控制,puncta(没有明显变化 边缘和 从边缘)。相比之下,戴奥组织,显著降低puncta附近和远端前缘( )(图4 (b))。我们缺乏协会预测,可能是一个异常的潜在原因移民戴奥眼角膜受伤后初步数据,糖尿病细胞迁移,但方向性受损。在未来,Ca^{2 +}动员和迁移实验将进行糖尿病角膜上皮确定下游降低信息交流的影响。

这是第一个研究使用定量图像处理组织检查信息交流协会和关联数据2离子通道。该模型可用于确定治疗目标和测试策略在角膜和其他组织调节治疗,防止疾病进展。

4所示。结论

总之,我们的研究提供了全面的数据证明pannexin1维生素B6含量有不同的定位控制和一个肥胖pretype 2糖尿病模型(戴奥)。此外,pannexin1抑制损害角膜上皮的信息交流,表明pannexin1在伤口修复起着至关重要的作用。2 pretype糖尿病角膜上皮,P2X7 pannexin1协会是微不足道的,表明相互作用的蛋白质丢失,从而扰乱interactome和随后的下游信号。

数据可用性

免疫组织化学和信号数据用于支持本研究的结果中包括这篇文章。之前报道Ca^{2 +}动员数据被用来支持这项研究,并可在doi: 10.1371 / journal.pone.0213422。这些先前的研究和数据集引用在相关地方在引用的文本和李et al。18]。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

我们承认莫莉石灰的优秀的技术援助。这项工作是由美国国立卫生研究院(RO1EY06000 (V.T-R)和R21EY029097-01 (V.T-R)),马萨诸塞州狮子眼研究基金,基金和新英格兰角膜移植手术。