N -反式CDKN1A BBC3, DDIT3 -Feruloyloctopamine醒来,病因加速肝细胞凋亡信号

文摘

N -反式-Feruloyloctopamine (FO),天然化合物,在我们之前的研究抑制肿瘤细胞恶性表型的一种蛋白激酶,EMT-related信号,可能是作为一个有前途的治疗肝癌的药物治疗。然而,具体目标和具体机制仍然需要澄清。筛选与RNA-Seq Huh7细胞治疗FO透露,317个基因被调制,其中188基因调节和129个基因表达下调。实时细胞分析仪和流式细胞仪数据显示,肿瘤细胞增殖和细胞凋亡影响佛。大卫科学数据显示,大多数生物过程的术语与增殖和凋亡相关。KEGG富集分析表明,佛主要调节PI3K-AKT apoptosis-related信号,BBC3, DDIT3,病因,CDKN1A表面作为FO诱导肝癌细胞凋亡的新靶点。结果暗示FO可能加剧肝细胞凋亡调节BBC3, DDIT3, CDKN1A,病因的信号。FO的障碍作用可以提供新的目标和新的治疗肝癌的可信度。

1。介绍

肝细胞癌(HCC)是世界上主要的恶性肿瘤,肿瘤中排名第四的死亡。肝细胞癌的发病率上升与亚洲仅导致超过70%的全球发病率和死亡率(1,2]。手术切除仍是早期肝癌的最优策略。先进的肝癌仍呈现不良预后即使手术,放疗和化疗有(3]。化疗药物导致不仅强劲阻力,而且更多的副作用(4]。

天然产物引起了公众的关注很长一段时间在癌症治疗,因为他们的强大功效和较低的毒性,表现出广泛的生物活性与各种各样的疾病,如传染性疾病和癌症5]。N -反式-Feruloyloctopamine (FO)大蒜中提取的皮肤,具有较高的抗氧化活性和选择性地诱导白血病细胞凋亡在肿瘤(6]。它可能被认为是一个有前途的抗癌药物。我们以前的报告显示,FO抑制肝癌细胞入侵通过一种蛋白激酶,增殖蛋白激酶(MAPK),和EMT-related信号(7]。的分子结构如图1,合成FO的方法是根据我们以前的报告完成的。然而,药物靶点和详细的机制已经被掩盖了。,全基因组转录组分析(RNA-Seq)被用来屏幕(度)的差异表达基因FO-treated Huh7细胞,目的是揭示药物的模式。我们假设FO可能调节相关基因在细胞凋亡和PI3K-AKT途径调解肝癌细胞的增殖和凋亡。

2。材料和方法

2.1。细胞系

肝癌细胞系Huh7和Hep3B购自中国科学院细胞银行(上海,中国)。肝癌细胞系中维护高葡萄糖DMEM(美国加州英杰公司)补充10%胎牛血清(的边后卫)(技术)和1% (100 U /毫升)penicillin-streptomycin(技术),然后维持在37°C湿润孵化器有限公司5%₂。

2.2。细胞增殖的实时分析

实时细胞分析(RTCA;罗氏应用科学,GmbH,潘茨堡,德国)实验进行了使用xCELLigence RTCA DP乐器。简单地说, 细胞被播种在好吧细胞增殖测定微量滴定E-plates,酝酿了15分钟之后,基线检测。细胞培养10小时后,佛(2.0毫米)和DMSO溶液添加到Huh7 Hep3B细胞,分别,然后每个井的电阻抗测量连续近90小时。斜率表示单位时间内细胞阻抗的增加( )。的 计算从3个人复制井。

2.3。流式细胞术分析

当细胞融合达到60%,Huh7 Hep3B细胞接受佛和DMSO,分别和消化EDTA-free胰蛋白酶后24小时。收集细胞后,他们用冷洗两次PBS和resuspended 1 x绑定缓冲的浓度 细胞/毫升。然后,5μL (FITC膜联蛋白V和5μL(π被添加,这些细胞被轻轻涡和孵化15分钟在RT (25°C)在黑暗中。最后,400年μL 1 x绑定缓冲了,分析的解决方案是在1小时内流式细胞术。细胞凋亡研究的帮助下BD LSR II (Becton, Dickinson和公司、美国)。数据分析使用FlowJo软件(FlowJo v10;美国有限责任公司、亚什兰或)。

2.4。RNA-Seq分析仪

Huh7细胞接受佛和DMSO溶液,分别消化与试剂盒(热费希尔科学)24小时后,和收集。两个样本运往GENEWIZ公司(http://www.genewiz.com/图书馆建设和RNA-Seq)。测序图书馆建设包括RNA质量检查(安捷伦2100,安捷伦真核细胞总RNA纳米装备),图书馆建设(Illumina公司TruSeq RNA样本准备工具包),图书馆净化(AMPure XP珠子、贝克曼库尔特),插入片段测试(安捷伦2100,安捷伦高灵敏度DNA工具包),定量分析图书馆(安捷伦2100和量子位生物分析仪)和芝加哥期货交易所集群生成系统(TruSeq PE集群装备v4-cBot-HS)。高通量测序进行TruSeq SBS设备v4-HS (Illumina公司HiSeq 2000)。

2.5。差异表达基因和生物信息学分析

差异表达基因检查使用R / Bioconductor包磨边机和建立log2fold变化和值( ; )。基因功能分析和路径分析使用大卫生物信息学工具进行了分析。基因本体论(去)和《京都议定书》百科全书的基因和基因组(KEGG)途径进行了分析通过设置所有的条款和KEGG通路基因背景基因。

Pathview库是用于生成“PI3K-AKT”和“细胞凋亡信号通路。显著改变基因的褶皱值映射通过在本地KEGG颜色,绿色代表表达下调表达,红色代表调节表达水平与对照组。为了展示一个全面的形象有关的监管信号通路分析,所有基因的表达显著不同的没有褶皱的截止值是可视化。

2.6。实时定量PCR分析

四个代表基因参与了“PI3K-AKT”和“细胞凋亡信号通路被Q-PCR验证Huh7 FO处理相比,数控。总RNA提取使用试剂盒(热费希尔科学)。反应合成双链cDNA PrimeScript RT试剂盒(豆类)根据制造商的指示。随后,使用执行Q-PCR SYBR预混料交货Taq™II(豆类)。的方法被用来量化相对每个mRNA的表达,使用GAPDH作为内部控制。所有实验进行了一式三份。信使rna表达差异与paired-sample组进行评估 - - - - - -使用GraphPad Prism 5.0软件进行测试。时,这被认为是重要的 。引物序列如下:NOXA-forward: 5 - - - - - -GTGCCCTTGGAAACGGAAGA-3 ,反向:5 - - - - - -CCAGCCGCCCAGTCTAATCA-3 ;CDKN1A-forward: 5 - - - - - -GGGATGTCCGT CAGAACCCA-3 ,反向:5 - - - - - -CACCCTCCAGTGGTGTCTCG-3 ;PUMA-forward: 5 - - - - - -CTGTGAATCCTGTGCTCTGC-3 ,反向:5 - - - - - -AATGAATGCCAGTGGTCACA-3 ;CHOP-forward: 5 - - - - - -GGAAACAGAGTGGTCATTCCC-3 ,反向:5 - - - - - -CTGCTTGAGCCGTTCATTCTC-3 ;和GAPDH-forward: 5 - - - - - -ATCTTCCAGGAGCGAGATCCC-3 ,反向:5 - - - - - -AGTGAGCTTCCC GTTCAGCTC-3 。

2.7。统计分析

执行统计分析软件SPSS 15.0和5.0 GraphPad棱镜。所有测试都是双尾;学生的 - - - - - -测试是用于统计比较,和 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。FO施加的抑制作用对肝癌细胞的增殖活性和刺激细胞凋亡

FO的功能进行深入研究,我们执行实时细胞分析(RTCA)和流式细胞仪检测细胞增殖和细胞凋亡,分别。与佛在我们之前的研究中,干预后达到了抑制肝癌细胞对应剂量的IC50大约2.00毫米。为了避免药物毒性的效应细胞生存能力,佛在这项研究中一直不断的浓度在2.00毫米7]。实验小组用FO, 0.2% DMSO-treated集团作为控制。观察FO Hep3B细胞的影响以及Huh7细胞增殖,细胞指数(CI)值的变化记录在肝癌细胞治疗FO。RTCA数据显示,明显降低在CI观察添加FO而DMSO(数字2(一个)和2 (b))。流式细胞术分析与膜联蛋白染色Huh7和Hep3B细胞后V-FITC /π表明,细胞凋亡率显著增加的百分比与数控(24 - 48小时)(数据2 (c)和2 (d))。这些数据凸显了抗和FO proapoptosis活动。

3.2。FO Huh7细胞基因表达调控

基于之前的数据,我们发现,佛对Huh7细胞有更明显的抑制作用比其他肝癌细胞。因此,我们选择Huh7细胞作为代表和RNA-Seq测序完成。RNA序列研究用于屏幕度FO -(2.00毫米)插入肝癌细胞。筛选的阈值 和 ,188年调节度和129度使之抑制RNA-Seq数据(数据的确认3(一个)和3 (b))。修改记录的数量已经有组织的基础上或者是价值。RNA-Seq数据所示补充材料。

3.3。生物信息学分析

KEGG分析识别最重要途径受佛,数据表明,度一般都浓缩在PI3K-AKT等信号通路( ),细胞凋亡( ),MAPK ( ),和JAK-STAT ( )(图3 (c))的途径。,以确定哪些生物过程(BP)可以由佛,去分析和数据显示为一个泡沫(图3 (d))。去英国石油(BP)分析显示,以下度显著富集条件涉及:“去:0042127细胞增殖的监管”( , ),“去:000726信息信号”( , ),“去:0006915 ~凋亡”( , ),和“去:0051726细胞周期调节”( , )。

FO的监管影响细胞增殖和细胞凋亡在关键信号通路上证实了Pathview库,用适当的颜色和褶皱度的值被映射为每个基因形成“PI3K-AKT信号通路”(图4)和“凋亡”(图5)。绿色表示表达下调基因,红色是指调节基因。类似于大卫与circosplot可视化分析,大部分的基因显示在“凋亡”和“PI3K-AKT信号通路调节。这些结果表明,FO可能发挥其抗肿瘤能力通过调节这些信号通路的关键基因。

3.4。候选基因的筛选和验证

结合去KEGG浓缩分析的结果,招募的候选基因不仅包括那些去英国石油(BP)增殖和凋亡有关,而且那些PI3K-AKT或细胞凋亡途径。中心bcl - 2基因包含绑定组件3 (BBC3) ( , ),DNA损伤诱导转录3 (DDIT3) ( , ),细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1 (CDKN1A) ( , ),和PMA-Induced蛋白1(病因)( , ),由Q-PCR也验证和证明是符合RNA-Seq数据(图6)。

4所示。讨论

临床上,无限制的增殖是肿瘤细胞的主要模式,因此,诱导细胞凋亡是治疗肿瘤的主要策略8]。细胞凋亡是由内在和外在的信号通路的信号通路。前者是由死细胞表面受体,而后者是在线粒体(9]。在线粒体凋亡过程中线粒体的膜透性降低,水平BCL-2-related antiapoptosis因素受损(10]。bcl - 2家族,proapoptotic和凋亡过程总结道。proapoptotic蛋白诱导的线粒体细胞色素c的释放,在激活mitochondria-dependent死亡中发挥着关键作用,而凋亡蛋白质工作通过阻止这个版本(11,12]。此外,细胞色素c促进凋亡multiprotein复合物的形成通过积累半胱天冬酶9和凋亡蛋白酶激活因子1 (Apaf-1)在细胞质中13]。半胱天冬酶9是一种凋亡启动子下游蛋白酶可以激活半胱天冬酶3,然后裂解细胞基质,最后导致细胞凋亡(14]。

彪马(BBC3)和病因(PMAIP1) bcl - 2家族的成员,都应对各种细胞内压力信号,如缺氧、失去生长因子或细胞因子、DNA损伤、抗癌药物,调节细胞死亡(15]。BBC3和病因与proapoptotic BH3-only蛋白质的活动,它可以结合抗凋亡蛋白,抑制他们的活动。此外,他们还可以直接或间接地影响贝克和伯灵顿。激活贝克和伯灵顿可以形成低聚物,导致线粒体通透性改变。随后,细胞色素c和第二mitochondria-derived激活半胱天冬酶(SMAC)从间隙空间被释放到细胞质中,然后通过激活半胱天冬酶诱导细胞死亡(16- - - - - -20.]。

p21 CDKN1A(),一个细胞随周期变动的激酶抑制剂,已被确定为一个目标基因p53的下游和能促进细胞凋亡在许多肿瘤类型通过激活TNF受体或诱导proapoptotic蛋白伯灵顿(21,22]。类似于美洲狮和病因,p21还可以调节细胞凋亡的调节线粒体膜透性的变化。有趣的是,彪马也被证明是一个重要因素p53-mediated凋亡和p21的监管,将死亡相关的信号传送到线粒体和促进细胞凋亡23- - - - - -26]。因此,我们的研究结果暗示p21和彪马可能相互作用,调节细胞凋亡。

排骨(DDIT3)是一个C / EBP转录因子家族的成员,和它的表达与内质网应激(人)27]。在ERS-related凋亡,切功能作为一个上游因子调节bcl - 2家族蛋白质,如彪马(28]。此外,CHOP-mediated细胞死亡包括多个基因可能增强细胞凋亡的诱导,包括ATF3和TRIB3 [29日,30.]。ATF3是一个转录抑制因子,可以引发细胞凋亡,以及TRIB3抑制NF -κB激活,从而减少生存。我们RNA-Seq数据还显示,TRIB3的表达( ; )和ATF3 ( ; )在调节FO-intervened Huh7细胞。这意味着除了这些中心基因外,其他未揭露的基因也可能是佛的目标。FO可能是一个多目标药物加速肿瘤细胞凋亡。

基于上述分析,我们模拟一个潜在的信号通路模型FO-induced在肝癌细胞凋亡。FO可能诱导活性氧的生产(ROS)和激活p53,这将提高CDKN1A水平。的upregulation CDKN1A往往伴随着彪马和病因的激活。与此同时,调节切可能激活内质网压力。同样的,切的提升也介导彪马和病因的表达。因此,我们推测,彪马和病因可能的下游信号通路的关键目标,都是由CDKN1A和排骨。上述改变proapoptotic因素可能激活BAX-forming寡聚物和可能转移从细胞质到线粒体。伯灵顿改变线粒体渗透性增加和释放细胞色素c和钙离子(总结图7)。积累的Ca⁺在细胞质中会进一步激活半胱天冬酶级联,最终导致细胞凋亡。但是,信号通路模型仅仅是一个假设基于生物信息学分析等研究报告。因此,在未来,一些分子生物学研究和患者样本将确认这个特定模型FO-related细胞凋亡途径。

5。结论

我们提供的证据表明,佛可以抑制在Huh7和Hep3B细胞增殖和促进细胞凋亡。此外,FO调节的关键途径和潜在的靶基因筛选。概念图FO刺激细胞凋亡的信号通过调节基因模拟中心,但具体机制FO介导的信号通路传导通过调节候选基因的表达还不清楚。我们还需要显示这个假设在后续分子生物学和组织病理学实验。这意味着改革FO基因可以抑制肿瘤的影响关键信号,可以作为一个有前途的抗肿瘤药物。

缩写

:	N -反式-Feruloyloctopamine
肝细胞癌:	肝细胞癌
Q-PCR:	定量聚合酶链反应
KEGG:	京都基因和基因组的百科全书
度:	差异表达基因
PBS:	磷酸盐
DMSO溶液:	二甲亚砜
走:	本体。

数据可用性

使用的数据来支持这项研究的结果包括在研究中。

的利益冲突

所有作者宣称他们没有利益冲突。

作者的贡献

马本进行了分子生物学实验和写的手稿。杨Wen-Ke参与生物信息学分析和图表绘制。京李和张Mei-Gui帮助数据分析。中天白和天主教徒谢构思研究,参与其设计和协调,并帮助修改手稿。所有作者阅读和批准最终的手稿。马本和李京同样贡献了这个工作。

确认

这项工作是支持由中国国家自然科学基金(82060666和82060666),兰州大学第一医院的基础(ldyyyn2018-29),中央大学的基础研究基金(lzujbky - 2018 - 54),和兰州市自然科学基金(批准号2016 - rc - 2)。我们感谢陆Cuncun循证医学中心基本医疗科学学院,兰州大学,评论手稿。

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