转录分析揭示了硝苯地平诱导牙龈过度生长的关键基因

摘要

背景．硝苯地平诱导牙龈过度生长(NGO)是一种多因素的发病机制，其表现为细胞外基质增加，包括胶原和多糖、炎症细胞因子和成纤维细胞表型改变。然而，非政府组织的分子病因尚不清楚。本研究的目的是探讨非政府组织发病的关键基因。方法．在本研究中，我们检测了慢性牙周炎、硝苯地平无反应性牙龈过度生长、硝苯地平引起的牙龈过度生长以及健康正常牙龈的成纤维细胞的增殖和迁移能力。我们对这四组成纤维细胞进行了rna测序，并分析了差异表达基因(DEGs)。结果．非政府组织患者的成纤维细胞的增殖和迁移能力高于其他组。蛋白-蛋白相互作用网络分析显示TGFB2、ITGA8、ITGA11、FGF5、PLA2G4D、PLA2G2F、PTGS1、CSF1、LPAR1、CCL3、NKX3-1参与了NGO的发展。这些因子与花生四烯酸代谢和PI3K/AKT信号通路有关。结论．转录基因表达分析发现了一些可能与硝苯地平诱导的牙龈过度生长有关的DEGs。我们的研究为硝苯地平诱导牙龈过度生长的分子机制提供了重要信息。

1.介绍

药物诱导的牙龈过度生长(DIGO)/增生是一种常见的不良反应，在服用抗惊厥药物、免疫抑制剂和一些抗高血压药物的患者中观察到[1- - - - - -3.］.硝苯地平广泛用于治疗高血压和/或心绞痛。据报道，硝苯地平诱发的牙龈过度生长(NGO)是DIGO最常见的形式，发病率在6.3%至83%之间[4- - - - - -6］.然而，非政府组织的分子病因尚不清楚。

多年来，人们提出了若干非政府组织可能的机制和途径。有几个因素被认为影响硝苯地平和牙龈过度生长之间的关系，包括局部炎症、药物引起的牙龈结缔组织稳态改变和遗传易感性[7，8］.非政府组织的特点是牙龈结缔组织的细胞增殖和细胞外基质(ECM)成分积累。炎症细胞因子，如白细胞介素-1β［9]和白细胞介素6 [10，也有报道协同增强人牙龈成纤维细胞(hGFs)的增殖和胶原蛋白生成[11］.此外，胶原蛋白的合成由基质金属蛋白酶(MMPs)和组织金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)控制。基质金属蛋白酶是在牙周炎症和非政府组织中参与胶原蛋白和ECM组分降解的关键酶[12，13］.此外，并非所有服用硝苯地平的患者都出现牙龈过度生长。在文献中，表现出NGO的患者被称为“有反应者”，没有表现出NGO的患者被称为“无反应者”。这种个体间对牙龈变化的易感性可能与遗传易感性有关，遗传易感性可以影响药物-细胞斑块诱导的炎症相互作用中的各种因素[14］.我们前期研究证实MMP-2和MMP-9在硝苯地平诱导的牙龈过度生长发育和进展中发挥重要作用。硝苯地平治疗伴局部炎症调节MMP-2和MMP-9表达，这很可能与非政府组织的严重程度有关[13］.因此，我们强烈推测关键基因或效应分子的改变在NGO的发病机制中起重要作用。

2.材料和方法

2．1.实验组和组织制备

在我们的研究中，我们收集了12例40 - 70岁的患者的牙龈标本( 为每个组)。纳入标准如下:(1)高血压患者平均服用硝苯地平时间为3 ~ 8年;(2)所有患者入组前3个月内无其他全身性疾病或服用抗生素史;(3)未怀孕且未采取避孕措施的妇女;(4) ；(5)签署治疗研究知情同意书。NNGO组和NGO组的目标同时满足项目1-5，对照组和CP组的目标同时满足项目2-5。此外，牙周炎的诊断依据如下:(1)≥2颗非相邻牙齿可检测到牙间临床附着丧失(CAL)，或(2)颊部或口腔部 带口袋探测的mm mm在≥2颗牙齿时可检测到，但观察到的CAL不能归因于非牙周炎相关原因[15］.排除标准如下:(1)因其他药物(如苯妥英钠、环孢素A)所致牙龈增生患者;(2)其他全身性严重疾病患者;(3)近3个月使用激素治疗的患者。

将患者分为四组，采用牙龈指数(GI)、龈缘水平(GML)和牙周病活动度(CAL)测量和评估牙周病活动度。在28颗牙中，每颗牙记录3次牙周手测和测量，分别位于三颊、中颊、近颊和舌侧4个部位。每颗牙齿以4个牙齿评分的平均值进行评分。GI评分标准[160分:健康牙龈;1点:牙龈轻度炎症，牙龈颜色略有变化，轻度水肿，探查时无出血;2分:牙龈中度炎症、牙龈发红、亮水肿、出血诊断;3点:牙龈严重发炎，牙龈明显肿胀或溃疡，有自动出血的倾向。CAL是牙釉质交界处到牙周袋底部的距离，表示附着丧失的程度。GML是指从牙龈边缘到牙釉质交界处的距离，反映了牙龈的退化程度。

所有患者均行口腔超声除垢术，清除可能干扰探囊和检测CAL的沉积物。(A组)牙周组织健康的病人( ， 毫米, mm)，需要拔除第三颗磨牙(NOR)(B组)严重慢性牙周炎( ， 毫米, mm)，谁需要拔第三颗臼齿(CP)(C组)硝苯地平无反应牙龈扩大患者( ， 毫米, mm)需要拔除第三颗臼齿(NNGO)(D组)牙龈扩大的病人( ， 毫米, mm)因硝苯地平引起需要牙周治疗者(NGO)

根据复旦大学伦理委员会批准的议定书，从每位参与者获得知情同意书。从下颌三臼齿的近端乳头的组织被制成石蜡切片，并用苏木精和曙红（H＆E）染色来自每个试样的一个代表部分，而剩余的牙龈组织用于培养RNA-SEQ的成纤维细胞。将样品在10％缓冲福尔马林中固定在48小时，以进一步组织学检查。

２.２.细胞培养

简单地，分离牙龈组织后，用含10%胎牛血清(FBS)的少量Dulbecco 's modified Eagle 's medium (DMEM)在培养皿中消除牙龈上皮组织。将组织切成1mm^3.用眼剪子取块，转移到培养瓶中，置于37℃，5% CO的培养箱中培养₂， 95%的相对湿度。媒介每天都在变化。将细胞培养到半通量状态，在37℃胰酶作用2分钟收获细胞，然后在新培养皿中传代。实验使用的是四传代成纤维细胞。

２.３.CCK8化验

细胞计数试剂盒8 (CCK8, Dojindo, Kumamoto, Japan)用于评估hGF的增殖。根据制造商的说明， 细胞/ml接种于96孔培养板。细胞附着24小时后，用无血清的DMEM替代生长培养基。然后,10μ加入5 g/l的CCK-8溶液，再孵育2 h。使用Multiskan GO分光光度计(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)在450 nm处测量吸光度。

２.４.Transwell细胞迁移试验

使用Transwell室（Costar，Corning，Ny，USA）体外测定细胞运动。将细胞置于100中的Transwell室（每孔40,000个细胞）中的细胞 μl无血清DMEM。在会议厅的下部，600人μ加入含10%胎牛血清的DMEM。细胞在培养箱中培养24 h。刮去未迁移细胞后，用甲醇固定细胞膜，用4染色后计数 ，6-diamidino-2-phenylindole (DAPI;凯根生物技术，南京，中国)。用光学显微镜在200倍放大倍数下对五个不同区域的细胞进行计数。

2．5．RNA-Seq和蛋白质相互作用网络分析

为构建cDNA文库，使用Trizol试剂(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)从成纤维细胞中提取细胞总RNA。每个cDNA文库都根据制造商的指南构建，并在公司(无锡药明康德医药有限公司，中国无锡)使用Illumina HiSeq 2000平台(意大利乌迪内IGA)进行下一代测序。RNA-Seq比较不同样本或cDNA文库中与特定转录本对齐的reads数量。表达使用RPKM(每Kilobase的外显子模型每百万映射Reads)归一化计算，同时考虑转录组的长度、碱基对数量和Reads总数[17］.这种标准化消除了不同基因长度和测序水平对基因表达计算的影响。如果基因表现出Benjamini和Hochberg-adjusted，则被认为表达差异值(FDR)为5%，平均倍数变化为0.2。DEGs的生物信息学分析基于RNA-Seq结果。此外，为了进一步研究在蛋白质水平上DEGs之间的关系，我们整合了交互基因检索工具(Search Tool for Retrieval of interaction Genes, STRING)数据库(http://string-db.org/)．注释、可视化和集成发现数据库(DAVID)在线平台(https://david.ncifcrf.gov/)进行基因本体论(GO)分析。

2.6。统计分析

使用SPSS version 20进行统计计算(IBM公司，Armonk, NY, USA)。学生的 -进行检验或单因素方差分析(ANOVA)，以确定每个比较的统计学意义; 被认为具有统计学意义。

3.结果

3．1.的临床特征

正常牙龈呈淡粉色，有光泽。边缘是刀边的，呈扇形。流线型乳突常有深度约1- 2mm的沟槽，附着的齿龈有斑点。牙龈坚硬，有多条血管和神经(图)1(一))．CP组刀缘变圆，牙间通道消失，牙龈表面光滑光滑。触摸牙龈时经常发生牙龈出血(图1 (b))．NNGO组牙龈的临床特征与正常牙龈相似(图)1 (c))．在NGO组中，扩大是局部的或全身的，影响整个口腔。整个乳头和周围组织都增大，使牙龈组织呈分叶状(图)1 (d))．

３．２．组织学研究

NOR组牙龈组织呈层状鳞状上皮(EPi)结构，上皮峰短而有组织。棘细胞约3 ~ 4层，颗粒细胞扁平，角蛋白粘连良好。呈立方体状的基底细胞，嗜碱性核深染，垂直于基底膜。固有层有大量结缔组织(Ct)，其中含有胶原纤维束和成纤维细胞，散在一些慢性炎症细胞(Ic)和淋巴细胞(图)1 (e))．而非政府组织每层上皮细胞均增加，角化上皮变厚。过多的上皮尖变宽，不规则伸长，有的甚至越过棘细胞层的网状增厚。棘状上皮细胞也较大，胶原束呈波状。固有层结缔组织胶原纤维增多。成纤维细胞丰满，慢性炎症细胞比NOR组更常见(图)1 (h))．CP组棘细胞层增厚，上皮棘突拉长，结缔组织增多，炎性细胞浸润增多(图)1 (f))．同时，NNGO组和NOR组的组织在显微镜下的外观并没有明显的区别(图)1 (g))．

３．３．非政府组织患者的hGFs具有较高的增殖和迁移能力

四组消化后获得的hGFs呈细长的纺锤形粘附生长(图)2(一个)CCK8检测hGF的增殖情况。与NOR组和NNGO组相比，NGO组和CP组的hGFs增殖明显增强( )．然而，与CP组相比，NGO组的hGFs表现出更高的增殖( ）（数字2(一个)、B、2 (b))．随后使用Transwell室测量hGFs的迁移速率。与CP组相比，NGO组的hGFs迁移能力更强(图)2(一个), C和2 (c))．

3．4．硝苯地平诱导牙龈过度生长衍生hGFs的转录组分析

为了评估非政府组织和其他组之间hGF基因表达的差异，我们使用火山图来确定fold change和统计学意义(图)S2A)．首先，在显示的NGO组中发现4040(1866上调，2174下调)、2867(1141上调，1726下调)和11032(6720上调，4312下调)基因 （ ）对比其他三组。因此，这些基因被鉴定为差异表达基因(DEGs)。PPI分析显示，与CP组相比，非政府组织组中有一些DEGs，包括NOS3、ITGAM、RAC2、PIK3CG、MMP9、TGFB1和IL6(图)3(一个))．GO分析表明，非政府组织可能与细胞质、细胞质部分、蛋白结合及结合功能有关(图)S1A)．KEGG分析表明，这些deg可能参与了Rap1信号通路、PI3K-Akt信号通路以及轴突引导(图)印地和S1E)．

为了探索硝苯地平的不同敏感性，我们分析了NGO和NNGO组之间的差异基因，并确定了几个关键的差异基因，包括FGFR1、VEGFA、IL6、MMP2、CDH1、ERBB3、RHOD和MAPK13。GO分析显示，NGO可能与细胞质、细胞质部分、结合、蛋白结合有关(图)3 (b))．KEGG结果显示，这些deg参与了癌症的蛋白多糖、肌动蛋白细胞骨架的调控和代谢途径(图)S1F)．

最后，用维恩图说明了DEGs在不同群体中的分布及其重叠表达情况4(一)结果显示，与其他组相比，非政府组织中有138个基因发生了改变，说明这138个基因可能受到硝苯地平的影响(表)S1)．通过PPI网络分析，我们发现了TGFB2、ITGA8、ITGA11、FGF5、PLA2G4D、PLA2G2F、PTGS1、CSF1、LPAR1、CCL3、NKX3-1等可能参与调控的重要deg(图3)4 (b))．这些因素可能参与了PI3K-AKT信号通路(图4 (d))．此外，GO分析显示，NGO与细胞对刺激和蛋白质结合的反应密切相关(图)4 (c))．

4.讨论

硝苯地平是DIGO中最常见的钙通道拮抗剂[18- - - - - -20.，但潜在的分子机制仍不清楚。目前，牙龈过度生长的一些最常见的原因和风险因素包括性别、遗传、给药时间和炎症[13，14，21］.由于牙龈成纤维细胞对氧化石墨烯诱导药物比其他成纤维细胞亚群更敏感，因此已知氧化石墨烯的致病机制是由遗传决定的。这种成纤维细胞的异质性导致了潜在增殖的成纤维细胞因子/GFs的产生和与ECM成分相关的环境反应的差异[22］.在本研究中，我们对来自NGO患者的hGFs进行了培养和分析，发现这些hGFs的迁移和增殖能力增强。

RNA-Seq提供了比其他所有方法更精确的DGO基因表达转录水平的测量，使我们能够进一步阐明非政府组织背后的分子机制。在这项研究中，转录组分析获得了来自非政府组织组的牙龈成纤维细胞的丰富信息。先前的研究表明，局部炎症，特别是牙菌斑，是DIGO病因学的一个重要因素[23- - - - - -25］.为消除炎症因子对牙龈增生的影响，将牙龈增生患者的成纤维细胞与牙周炎患者的成纤维细胞进行比较。基于非政府组织和CP组之间的PPI网络分析，我们在来自非政府组织组的成纤维细胞中发现了关键的新DEGs，包括NOS3、RAC2、ITGAM和PIK3CG，与CP组相比，它们的表达上调。据我们所知，这是首次报道这些新基因与NGO之间的关系。NOS3促进一氧化氮(NO)的合成，NO是一种细胞内信号分子，通过cGMP信号介导的信号转导途径调节血管舒张[26］.同时，RAC2通过增加NOS活性来增加活性氧(ROS)的产生[27，通过NADPH氧化酶[28］.据报道，ROS在氧化应激中发挥关键作用，氧化应激似乎与纤维化疾病的开始和进展有关[27，29］.Pik3CG是细胞生长，增殖和运动的关键因素，参与内皮祖先迁移[30.］.此外，与CP组相比，在NGO组中IL6和TGFB1被鉴定为显著的差异基因。IL6与非政府组织相关的免疫炎症特征有关。TGFB1在皮肤、肝脏、肾脏、眼睛、肺和心血管系统等不同组织的纤维化中起着关键作用。TGFB1刺激成纤维细胞的数量和纤维连接蛋白和糖胺聚糖(GAGs)的ECM沉积[31- - - - - -33］.MMP9在NGO成纤维细胞中显著上调。我们之前的研究表明MMP9是NIGO发展的潜在贡献者，并且很可能与NIGO的严重程度有关[13］.这些结果表明，虽然炎症过程是导致NGO严重程度的最终原因，但NGO受到多种因素的影响，包括细胞因子和酶[34］.

在使用硝苯地平治疗后出现明显牙龈变化的患者中，观察到有相当多的硝苯地平隔离[35，36］.然而，并非所有接受硝苯地平治疗的患者都出现牙龈过度生长。牙龈成纤维细胞对各种刺激表现出功能异质性[7］.通过比较NOG和NNGO组，我们确定了几个关键的deg，如FGFR1、VEGFA、IL6、MMP2、CDH1、ERBB3、RHOD和MAPK13。根据GO分析，FGF是一种成纤维细胞有丝分裂原分子，具有与成纤维细胞增殖相关的分化功能[37］.fgfr1配体结合激活多个信号级联并介导RAS和MAPK/ERK信号通路[38］.VEGFA促进内皮细胞增殖和分化，诱导微血管高通透性，参与ECM重塑[39］.CDH1参与细胞-细胞粘附、流动性和上皮细胞增殖的调节[40］.RHOD参与活化酪氨酸激酶(如PDGFRB和ERBB3)的内化和转运[41］.PDGF刺激IGF合成，导致成纤维细胞胶原合成增加，可能与牙周再生过程中对间充质组织的刺激有关[42］.与NNGO组相比，NOG组的成纤维细胞MMP2表达下调。MMP-2水平降低可能与组织重塑受损有关，导致病理性胶原沉积和组织纤维化[43］.MAPK13是四种p38 MAPKs之一，在细胞外刺激(如促炎细胞因子)引起的细胞反应、调节表皮角质形成细胞分化和凋亡中发挥重要作用。我们的研究结果表明，这些deg与成纤维细胞对硝苯地平的敏感性密切相关，并参与癌症中的蛋白多糖和肌动蛋白细胞骨架的调节。非政府组织的发育可能受RAS、MAPK/ERK和RAP1信号通路的调控。

为了进一步确定NGO的作用机制，我们分析了NGO与NNGO组、NGO与CP组、NGO与NOR组之间的重叠基因表达。基于PPI网络分析，我们识别了TGFB2、ITGA8、ITGA11、FGF5、PLA2G4D、PLA2G2F、PTGS1、CSF1、LPAR1、CCL3和NKX3-1等关键基因。TGFB2抑制IL-2依赖性t细胞的生长。在罗红霉素治疗的大鼠中，TGFB2表达下调与环孢素诱导的氧化石墨烯减少相关[44］.FGF5通过激活ERK1/2在调节细胞增殖中发挥重要作用[45］.ITGA8在器官发生中发挥作用，可能通过调节间充质细胞向上皮结构的招募[46］.ITGA11是一种胶原受体[47］.ITGA11基因在肝星状细胞(肝脏特异性肌成纤维细胞)中的下调显著降低了转化生长因子β-诱导分化及纤维化参数[48］.它可能参与纤维原性信号传导。LPAR1是一种溶血磷脂酸受体，与肌动蛋白细胞骨架重组、细胞迁移、分化和增殖有关。LPAR1激活G蛋白触发胞质Ca^２＋涌入。LPAR1在损伤反应中促进纤维化和细胞迁移[49，50］.CCL3(也称为巨噬细胞炎症蛋白-1α)是CC趋化因子家族成员。它被归类为巨噬细胞衍生的炎症介质[51］.PLA2是一个酶超家族，催化自由脂肪酸和溶血磷脂的生产[52］.PLA2调节il - 1β-诱导趋化因子表达[53]，这可能与非政府组织期间的炎症有关。雄激素调控的同源结构域转录因子NKX3-1在早期前列腺发育中发挥作用，作为前列腺特异性肿瘤抑制因子[54］.CSF1促进促炎趋化因子释放并调节膜皱折、细胞粘附和细胞迁移[55］.PTGS1介导前列腺素E2 (PGE2)的产生，促进血管平滑肌细胞增殖。这些因子参与花生四烯酸代谢和PI3K/AKT信号通路。

总之，本研究显示了许多可能与硝苯地平诱导的牙龈过度生长有关的次数。虽然我们的研究仅说明了成纤维细胞在该过程中的作用，但它提供了重要信息和某种方向，以进一步研究这种情况下的分子机制。然而，这项研究有一些局限性。主要局限性缺乏细胞中的验证实验和小样本尺寸。因此，需要更大的研究组和进一步研究来澄清这些基因或信号途径。

数据可用性

所有用于支持这项研究结果的数据都包含在文章中。

的利益冲突

作者声明没有利益冲突。

作者的贡献

燕琴菊和李娟黄同样贡献了这项工作。Y. J.和S. W.为概念和设计和稿件写作做出了贡献;L. H.和S. W.负责临床样本;和S. Z.促成了概念和设计，手稿编辑和稿件的最终批准。

致谢

本研究由国家自然科学基金(81570965)和复旦大学华山医院初始基金(8157030373)资助。

补充材料

表S1:主要重叠基因列表。图S1:(A-C) NGO组相对于NOR、CP和NNGO的deg的GO分析。(D-F) KEGG分析。图S2: NGO与其他组的RNA-Seq分析。(A)火山图识别褶皱变化及统计学意义。(B)差异表达基因(DEGs)的蛋白-蛋白相互作用网络。（补充材料）

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