PDE4和EPAC1通过CAMP途径协同促进直肠癌癌

摘要

客观的．探讨cAMP直接激活的交换蛋白1 (Epac1)和磷酸二酯酶4 (PDE4)在直肠癌中的表达水平及其与临床病理指标的关系。此外，我们还评估了PDE4和Epac1与a激酶锚定蛋白95、连接蛋白43、细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白E1的关系。方法．采用PV-9000两步免疫组化方法检测44例直肠癌组织标本和16例癌旁组织标本中的蛋白表达。结果直肠癌组织中PDE4蛋白表达阳性率高于癌旁组织（59.09%对12.5%）， ）．Epac1也得到了类似的结果(55% vs. 6.25%， ）．在直肠癌中，PDE4和Epac1与分化程度、组织学类型和淋巴结转移无显著相关性( ）．观察到PDE4与Epac1、PDE4与Cx43、PDE4与cyclin E1、Epac1与Cx43之间的相关性 ）．检查的其他蛋白质对之间没有相关性( ）．结论．PDE4和Epac1在直肠癌组织中表达水平升高，提示这两种蛋白可能参与了直肠癌的发生发展。同时，PDE4与Epac1、PDE4与Cx43、PDE4与cyclin E1、Epac1与Cx43的相关性提示这些蛋白具有协同促进直肠癌的作用。

1.介绍

信号转导是细胞实现正常生理过程的必要过程。PDE4酶特异性水解cAMP，降低细胞内cAMP水平，使cAMP依赖蛋白调节细胞信号转导[1.］．PKA是cAMP信号通路的下游，是一种重要的蛋白激酶。AKAP95是一个PKA-锚定蛋白，锚定PKA RII亚基;锚定的PKA可以催化靶向蛋白磷酸化，确保并扩大cAMP通路的信号转导[2.,3.］．Cyclin D和Cyclin E蛋白可以促进哺乳动物中G1相的细胞增殖，而Akap95作为中间体可以帮助来自细胞周期蛋白D / E-AKAP95-PKA复合物的细胞周期蛋白D / E和PKA RII亚基[4.］．被cAMP直接激活的新型交换蛋白(Epac)是一种多功能分子，参与多种细胞过程[5.］．Epac蛋白包括两个亚型，即Epac1和Epac2，它们都在许多组织和器官中表达[6.,7.］．不同的器官和不同的发育阶段也表现出不同[8.］．我们之前报道了Cell Cycle中的AKAP95和CX43之间的组合关系[9］．有研究提到Epac可以调节Cx43促进缝隙连接形成和细胞间通讯[10］．

上述研究结果表明PDE4，EPAC，AKAP95，CX43和CyclIn D / E具有一些关联。使用免疫组织化学方法评估在16个剖腹产瘤组织样本中44个直肠癌样品中PDE4和EPAC1的蛋白质表达。分析了各种蛋白质的缔合。

2。材料和方法

2.1. 肿瘤来源

从辽宁医科大学第一附属医院收集44例病理确诊为浸润性直肠癌的组织标本，患者年龄39～79岁，平均60岁 ± 8、 男性28例，女性16例。共有38例、4例和2例患者分别患有管状或乳头状腺癌、粘液腺癌和印戒细胞癌。癌细胞分别在4例、36例和4例患者中高度、中度和低分化。共有23例患者有淋巴结转移；15例患者出现淋巴结转移d无淋巴结转移，其余6例淋巴结转移情况不明。此外，癌旁组织至少3例取自正常直肠组织 44名患者中有16名患者离癌组织1厘米远。还对癌旁组织进行了病理检查，以确认癌细胞的缺失。该研究方案得到了中国厦门大学公共卫生学院医学伦理委员会的批准。

２.２.试剂和方法

所有标本均在10%中性甲醛中固定，石蜡包埋，并切成4个连续切片 μm。根据制造商的说明，PV-9000两步免疫组化染色试剂盒（中山金桥生物科学公司，北京，中国）用于蛋白质表达分析。测定涉及DAB染色和苏木酰基备受染色。兔抗人类肽1抗体购自Abcam（英国剑桥），而小鼠抗人PDE4单克隆抗体来自Santa Cruz（达拉斯，德克萨斯州，美国）。PBS用作阴性对照样品。

2.3.判断阳性表达的标准

棕黄色染色被认为是蛋白质的阳性表达，而没有棕黄色染色表明没有蛋白质表达。每个部分随机评估十种不同的大功率场，每场肿瘤细胞均计数。使用阳性至全细胞的比例用作评估阳性蛋白表达的度量：“ - ” - “ - ”<10％棕色;“±”，“≥10％和<25％;“+，”≥25％和<50％;“++”≥50％和<75％;和“+++”≥75％。对于数据分析，“ - ”和“±”被认为是负表达和“+”，“++”和“+++”的正表达式。

3.统计分析

评估蛋白质表达的阳性率^2.试验并被Spearman的等级相关分析评估。 被认为具有统计学意义，并使用SPSS13.0软件对数据进行分析。

4.结果

4．1.PDE4和Epac1蛋白在直肠癌组织中的表达

我们之前评估了直肠癌组织，发现与癌旁组织相比，AKAP95、cyclin E1和cyclin D1的阳性率更高。同时，Cx43的阳性率低于癌旁组织。这些发现表明，AKAP95、cyclin D1和cyclin E1可能促进癌症的发生，而Cx43蛋白则抑制癌症的发生[11］．

本研究进一步检测直肠癌标本中PDE4和Epac1蛋白水平。评估44例直肠癌和16例癌旁组织样本中PDE4和Epac1蛋白水平(见表)1.）．PDE4在直肠癌中的阳性表达率为59.09%(26/44)，高于癌旁组织标本的阳性表达率(12.5%，2/16， ）．直肠癌EPAC1的阳性表达率为55.00％（24/44），也高于剖腹症组织样本（6.25％，1/16， ）．PDE4和Epac1蛋白在直肠癌组织的细胞质中表达，并在细胞核中表达（图1.）．

在直肠癌中，PDE4和Epac1与分化程度、组织学类型和淋巴结转移无相关性( ）．

4．2．PDE4、Epac1、AKAP95、Cx43、Cyclin E1和Cyclin D1在直肠癌组织中的关系

我们检测了44例直肠癌标本中PDE4、Epac1与AKAP95、Cx43、cyclin E1、cyclin D1的关系。结果显示PDE4和Epac1之间存在相关性(表1)2.），pde4和cyclin e1（表3.)、PDE4和Cx43(表4.)， Epac1和Cx43(表5.） ( ）．对于其余的蛋白质对，未获得显著关联（数据未显示）。

5.讨论

Epac蛋白主要参与细胞的粘附、通讯、分泌和分化[5.]作为一种多功能信号分子，它在免疫、呼吸、神经、心血管和内分泌系统中具有多种独特的调节功能[12,13］．EPAC1存在于所有生物中，并且仅在腺组织和神经系统中发现EPAC2蛋白[14]最近有报道称Epac抑制剂ESI-09抑制胰腺肿瘤细胞的增殖[15]同时，Epac1在胃癌细胞中高表达[16］．本研究还证明了直肠癌组织样本中的高EPAC1表达水平，这可能表明该蛋白质在消化系统中促进癌症。

PDE是一种参与cAMP水解的酶。PDE4是PDE蛋白家族的成员；它特异性水解cAMP，使其在5分钟内失活 -AMP形成，结束下游信号转导[17]PDE4与多种肿瘤的发生有关，并在多种肿瘤组织中高度表达[18］．PDE4在直肠癌组织中表达水平高，这可能表明它也促进直肠癌的发生，证实了之前的报道。

同时，PDE4可以结合并激活下游的Epac蛋白，Epac蛋白是cAMP的下游靶点。Epac与cAMP高亲和力结合，激活Ras超家族小GTPases Rap1和Rap2，表明PDE4/cAMP/Epac1信号通路存在[18］．如图所示，PDE4与Epac1、PDE4与Cx43、Epac1与Cx43之间存在相关性( ）．这些发现表明PDE4，EPAC1和CX43蛋白的可能相互作用，其通常在直肠癌发生中发挥作用。

本研究还证实了PDE4和cyclin E1之间的相关性。细胞周期蛋白E1是细胞周期G1/S阶段的重要蛋白。PDE4与cyclin E1的结合提示两种蛋白可能在细胞增殖过程中对G1/S过渡具有协同作用。然而，PDE4与cyclin D1之间没有相关性。

兔心肌细胞Epac蛋白调控Cx43 ser368位点磷酸化，影响Cx43蛋白功能[10].研究证实Cx43在多种生物体中发挥肿瘤抑制作用[19–22］．在该研究中，EPAC1水平与CX43表达相关，进一步说明了对诱导直肠癌的密切关系。

在T细胞白血病患者中，PDE4和AKAP95水平与T细胞相关[23］．但如上所示，PDE4与AKAP95在直肠癌组织中无相关性。组织学差异引起的差异尚不清楚。在大鼠心肌细胞中，AKAP家族成员mAKAP可与Epac1结合调节信号传导，调节大鼠心肌肥大[24］．我们的实验研究显示Epac1和AKAP95蛋白水平之间没有相关性。这种现象可能与肿瘤发生有关，与AKAP家族成员不同或组织学差异有关。具体机制有待进一步评估。

综上所述，PDE4、Epac1、cyclin E1、Cx43在直肠癌中具有密切的相关性。这可能是直肠癌细胞周期调控的重要蛋白质网络。它可能成为未来新的治疗靶点。然而，这需要进一步研究。

数据可用性

(1)支持本研究结果的直肠癌组织中AKAP95、Cx43、cyclin E1、cyclin D1表达数据已在PubMed库中保存[PMID: 25973052或PMCID: PMC4396224]。先前的研究被引用在正文的相关地方作为参考[11］．（2）与AKAP95，CX43，Cyclin E1和用于支持本研究结果的Cyclin D1的PDE4和EPAC1的关联数据包括在制品中。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

作者的贡献

孔祥宇、艾刚好对这项工作贡献相当。

致谢

辽宁省教育厅资助(no . L2015022);大连市卫生和计划生育委员会资助(no . 2016);福建省自然科学基金资助项目(no . 2016J01407, no . 2015J01345);基金资助:厦门大学本科生创新创业训练计划资助项目(no. 2016X0433、no. 2015X0453);20720160060)。

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