Shogaol对BALB / C小鼠在实验诱导结肠炎中肠道干细胞标志物表达的影响

抽象的

目的。本研究旨在研究生姜酚类成分Shogaol对右旋糖酐硫酸钠(DSS-)诱导的小鼠溃疡性结肠炎(UC)的影响，并与用于治疗溃疡性结肠炎的免疫抑制化疗药物6-硫鸟嘌呤(6-TG)进行比较。材料与方法.将36只成年、雄性和雌性BALB/c小鼠随机分为6组：第1组（对照阴性）未暴露于DSS且未接受任何治疗，第2组（对照阳性）暴露于DSS但未接受任何治疗，第3组暴露于DSS且接受0.1%的治疗 mg/kg 6-硫鸟嘌呤，以及暴露于DSS并经10、20和40处理的第4、5和6组 在第56天，检查小鼠的疾病活动指数（DAI）并将其处死。检查小鼠结肠的长度测量、组织学指数评分以及CD133和CD34干细胞标记物的表达。结果．Shogaol显示更好的疗效比6-TG修理DSS-exposed小鼠的结肠粘膜损害的CD133和CD34表达的水平在结肠隐窝和戴的分数,结肠长度测量,与组织学指数由Shogaol显著降低小鼠的治疗,特别是20和40毫克/公斤体重剂量。结论．本研究结果表明，生姜源物质Shogaol口服治疗dss诱导的UC效果优于常规免疫抑制化疗药物6-TG。

1.介绍

溃疡性结肠炎是一种结肠和直肠的慢性炎症性疾病，其特征为血性腹泻、肠粘膜溃疡以及粘膜层内的中性粒细胞和淋巴细胞浸润[1，2]。环境变化、基因变异和肠道微生物等多种原因被认为与UC病因有关[3.，4］.dss诱导结肠炎，从形态学和病理生理特征来看是UC模型的一种形式[5，6[普遍用实验使用以评估治疗效果，并实现用于治疗UC的新化合物的分子基础[5，7］.

许多经典用于治疗UC的治疗剂，如6-硫鸟嘌呤（也称为6-TG或2-氨基-6-巯基嘌呤），都是免疫抑制剂，并且由于UC通常在老年患者中发生，因此存在感染引起并发症的真实风险[8］.此外，6-TG治疗通常伴有不良副作用，如肝毒性、肾毒性和骨髓抑制，导致贫血、白细胞减少和血小板减少[9，10］.

Shogaol，一种在生姜根茎中发现的化合物(生姜罗斯科)[11，12，已被广泛报道其众多药理特性，包括抗炎、镇痛、解热、抗氧化和抗癌特性[13，14］.

定义潜在干细胞（SC）的性质包括通过非染色体共同分析的自我更新，分化能力和非对称细胞分裂[15］.这些特性和一些簇差异(CD)膜和细胞质标记，如CD133, CD29, CD44, CD166 (ALCAM)， EpCAM, ALDH1A1，和ALDH1B1已经被鉴定来研究这些特性和分离推定的SC [16］.据报道，CD133，也被称为PROML1或突起蛋白，表现出一种特征性的表达模式，定位于结肠腺体的管腔表面[17］.

CD34是一种跨膜唾液酸蛋白，它作为造血干细胞的标记物已经被广泛使用了近30年，最近更多地用于其他干细胞/祖细胞类型[18］.

本研究旨在探讨Shogaol通过激活干细胞，以CD133和CD34作为结肠隐窝干细胞自我更新和分化能力的标志物，在DSS诱导的UC中修复结肠损伤的可能作用。

2.材料和方法

2．1．动物

36只雄性和雌性BALB/c小鼠(2-3月龄)购自苏莱曼尼大学兽医学院动物之家(伊拉克苏莱曼尼亚省)。为小鼠提供自来水和标准食物随意并被允许在实验开始前一周适应一周。小鼠在空调壳体中的密度为6 /笼，室温 ，相对湿度 ，并交替12小时的光/暗周期。实验是在整个周期的光周期内完成的。本研究中所有涉及小鼠的程序都是人道地进行的，并根据《实验室动物护理和使用指南》进行，并获得了苏莱马尼大学兽医学院伦理委员会的批准。

2．2.慢性结肠炎的诱导与朔胆碱治疗

除阴性对照组外，所有小鼠均诱发溃疡性结肠炎。通过将小鼠暴露于3%DSS（分子量40%）来诱导UC kDa）通过饮用水进行四个周期（每个周期包括5天的DSS暴露，然后在正常水上间隔7天）[19］.将小鼠分为6组，每组6只，分别为:1组(阴性对照):未接触DSS和未处理的正常饮水动物;2组(对照阳性):DSS暴露无治疗;第3组:DSS暴露后用0.1 mg/kg 6-硫鸟嘌呤治疗(法国Biochem Chemopharma) [20.];第4、5和6组:DSS暴露后分别给予10、20和40 mg/kg b.w (Shogaol, Sigma-Aldrich)。所有治疗(除3% DSS暴露外)以单次每日剂量口服灌胃14天(4天治疗，1天无治疗间隔)。

2.3.结肠炎的评估

在DSS暴露和Shogaol治疗期间，使用疾病活动指数评分(DAI，表)评估小鼠的结肠炎1)取决于体重减轻、粪便浓度和直肠出血[21］.

第56天实验结束后，切除结肠并检查其长度、粪便稠度和大体外观。结肠远端立即固定在10%福尔马林中，并根据Kiernan进行一系列组织病理学准备[22］.4片组织切片μ.m厚度，用标准H和E技术染色，安装在玻片上，光镜下观察，并用组织学指数评分(表2)评估溃疡性结肠炎的严重程度[23].结肠的所有组织学评估均由两名专业病理学家以双盲方式完成。

2.4。组织微阵列组件

H和e染色玻片上最具代表性的区域被仔细选择并标记。组织微阵列(TMA)是使用组织微阵列仪器(TMA Builder, Thermo Scientific™)收集的，该仪器由薄壁，不锈钢，冲孔针和针芯组成。针芯与冲孔针紧密贴合，用来排空和转移针的内容。该仪器用于在接收块上钻孔，确定阵列岩心在X-Y位置排列3行(每行4个岩心)，单个阵列之间的增量为2毫米，冲孔深度为3毫米。

4 .组织切片μ.，从每个组织芯片块中获得，使用旋转切片机(徕卡)进行免疫组化染色。切片固定在涂有胶粘剂的载玻片上，55℃二甲苯脱蜡3次(每次5分钟)，用100、90、70%乙醇和蒸馏水多次冲洗再水化(每次2次，每次5分钟)。抗原回收是在250ml 10 mmol/L柠檬酸钠(pH 6.0)中，在Dako高压锅中加热20分钟。

2.5。免疫组织化学染色

内源性过氧化物酶活性通过将载玻片浸入0.3%的过氧化氢酶中15分钟并用PBS洗涤来阻断( ),然后用3%山羊血清覆盖切片约1小时以阻断非特异性结合。随后将载玻片分为2组:第一组与兔抗cd133多克隆抗体(1:100,San Francisco Biorbyt, USA)在4℃下孵育过夜，第二组与兔抗cd34单克隆抗体(1:100,Dako, Germany)孵育过夜。然后用PBS ( ),将生物素化的山羊抗兔二抗（Envision，Bio Sb）孵育30分钟，并用PBS洗涤（ ）.然后，切片在辣根过氧化物酶链霉亲和素(EnVision, Bio SB)中孵育30分钟，PBS (3 × 2分钟)洗涤，DAB底物显像10分钟，苏木精反染，按照标准程序脱水，盖上盖。

2.6。Immunofluorescent染色

将组织切片覆盖少量(PBST 0.1% Triton) 10分钟，使组织切片通透。切片在PBS ( ）在室温下用PBST中含有5%牛血清的封闭溶液孵育30分钟，然后将切片损坏并在一个黑暗的培养罐中（在4℃的黑暗罐中）孵育，并用一个主抗体（多克隆兔抗CD133抗体，旧金山BioByt，美国），在PBS中洗涤。 ）与异硫氰酸荧光素(FITC)结合的二抗在深色瓶中孵育1小时(San Francisco Biorbyt, USA)， PBS洗涤( ),使用安装介质用盖玻片覆盖，用指甲油密封，并在-20或+4°C的黑暗中储存。

2.7。CD133和CD34染色解释

在不了解临床和病理信息的情况下，由两名独立病理学家以盲法对结肠隐窝中CD133和CD34的免疫组化染色进行半定量评估。在结肠隐窝上皮细胞的细胞质和/或膜反应性病例中，CD133染色被视为阳性s、 结肠粘膜固有层间质细胞（巨噬细胞、成纤维细胞和/或肥大细胞）的胞浆反应性和结肠隐窝上皮的膜反应性病例的CD34染色呈阳性。

在CD133和CD34的IHC染色中，阳性染色的上皮细胞的范围通过五点量表估计为无染色或0表示<5%、1表示5-25%、2表示25-50%、3表示50-75%和4表示>75%阳性染色。CD133和CD34的染色强度分为三个级别：弱（+1）、中等（+2）和强（+3）。将阳性反应程度和染色强度水平相乘，得出0-12范围内的总染色分数[24- - - - - -26]CD133的免疫荧光染色呈阳性，表现为粘膜隐窝上皮细胞质中FITC标记的二级抗体出现明亮的苹果绿荧光。免疫荧光染色的免疫反应强度分为三个级别：弱（1+）、中等（2+）和强（3+）[27］.

2.8。统计分析

采用SPSS 22.0软件(SPSS, Chicago, IL, USA)进行统计学分析。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)检验DAI评分和结肠长度，对实验组间的变异进行统计分析。结果如下所示 错误（SE），以及 被认为具有统计学意义。

3.结果

3．1.疾病活动指数(DAI)评分

疾病活动指数的结果（图1）揭示了对照负小鼠的零分，与对照阳性小鼠“DSS暴露而没有治疗”的对照症状没有疾病症状，其在粪便，腹泻和直肠出血中表现出突出的血液（得分12）。另一方面，第3组（DSS暴露和6-Tg处理），第4组（DSS暴露和10mg / kg BW Shogaol处理），第5组（DSS暴露和20mg / kg BW Shogaol治疗）和第6组（DSS暴露和20mg / kg BW Shogaol处理）分别为5,5,4和3。

3.2。结肠长度测量

与阴性对照组小鼠相比，显著降低( ）对照阳性组“未经治疗的DSS暴露”小鼠的平均结肠长度明显减少( ）在6-硫鸟嘌呤、10 mg/kg BW和20 mg/kg BW处理组小鼠中。另一方面，40 mg/kg体重的Shogaol治疗组小鼠的平均结肠长度仅出现微小的无显著性下降(图2和表3.）.

3．3.慢性结肠炎的组织学评分评估

与结肠形态正常的对照组小鼠相比，dss暴露组小鼠的结肠炎症程度不同，表现为炎症细胞浸润、上皮糜烂或溃疡、上皮增生、杯状细胞丢失、和异常的隐窝形态“隐窝缺失、不规则或脓肿”(图3.）.总的组织学指数评分范围从0(对照组阴性小鼠的结肠表面正常)到10(对照组阳性小鼠的结肠严重炎症)。的总组织学指数治疗组的小鼠结肠5组3 DSS曝光6-TG治疗,“7组4“DSS暴露10毫克/公斤合著Shogaol治疗,“5组5”DSS曝光20毫克/公斤合著Shogaol治疗,“只有1组6“DSS曝光40毫克/公斤合著Shogaol治疗。”

3．4．CD133和CD34的表达

结肠组织切片的免疫组化染色显示不同组小鼠粘膜隐窝上皮细胞中胞质和膜状CD133表达的分数不同（图1）4）.第1组(阴性对照组)小鼠表达量最小(总分0);2组(阳性对照“未治疗DSS暴露”)局灶性、弱表达(总分1分);在3组(DSS暴露和6-TG治疗)中，结肠隐窝深部局灶性、弱-中度表达(总分4);第4组(DSS暴露和10 mg/kg b.w Shogaol处理)弱但弥漫性表达(总分3分);和适度分散表达式(得分总和6)不限于地穴利基也延伸到瞬态放大区域和分化colonocytes的顶端部分结肠隐窝在5组(DSS曝光和20毫克/公斤合著Shogaol治疗)和组6 (DSS曝光和40毫克/公斤合著Shogaol治疗)。

同样，结肠组织切片的免疫荧光染色显示不同组小鼠粘膜隐窝上皮细胞中胞质CD133表达分数不同（图1）5）.弱表达(+)是明显的小鼠组1(负控制)和组2(积极控制“DSS暴露没有治疗”),weak-moderate表达式(+ + +)在深的部分结肠隐窝老鼠组3 (DSS暴露& 6-TG治疗)和组4 (DSS暴露和10毫克/公斤合著Shogaol治疗),5组(DSS暴露+ 20mg /kg b.w Shogaol处理)和6组(DSS暴露+ 40mg /kg b.w Shogaol处理)小鼠中表达(++)。

与CD34免疫组化染色相关，可以看到黏膜隐窝上皮细胞的不同程度的膜性表达，以及结肠黏膜固有层间充质细胞(巨噬细胞、成纤维细胞和/或肥大细胞)的细胞质表达(图)6）.阴性对照小鼠的结肠粘膜隐窝和间充质细胞均无明显表达(总分0);对照组阳性小鼠(未处理DSS暴露)黏膜隐上皮膜性阴性表达和结肠黏膜间充质细胞胞浆弱表达(总分1);3组(DSS暴露和6-TG处理)小鼠的粘膜隐窝和间充质细胞弱-中表达(总分3分);4组(DSS暴露+ Shogaol处理)小鼠的粘膜隐窝和间充质细胞表达极少量(总分2);5组(DSS暴露+ 20mg /kg b.w Shogaol处理)和6组(DSS暴露+ 40mg /kg b.w Shogaol处理)小鼠的粘膜隐窝和间充质细胞中中度表达(总分6)。

4。讨论

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, IBD)作为一种炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)，被认为是一种重要且日益严重的全球卫生保健危机，其确切病因尚不清楚[28］.然而，肠道再生在肠粘膜的愈合中起着重要的作用[29］.与对照阴性小鼠的小鼠相比，对照阳性小鼠表现出溃疡性结肠炎的严重迹象（如傣族参数所示，包括粘附的结肠缩短和标记的结肠组织病理病变相关的血清粪便，腹泻和直肠出血。损伤（焦点侵蚀或溃疡）和粘膜粘膜粘膜或炎症细胞的透射性渗透。这些结果与一些相关的发现一致[30.，31报道了dss诱导的小鼠模型UC引起不良结肠异常，并伴有血便、腹泻和直肠出血。

另一方面，3组(DSS暴露和6- tg处理)和4、5和6组(DSS暴露后口服10、20和40 mg/kg BW shogaol，结果显示，DAI评分和结肠长度均低于阳性对照组小鼠。这些结果与作者[32]，使用Shogaol治疗急性溃疡性结肠炎，表明该化合物可保护小鼠免受DSS诱导的结肠炎引起的体重减轻，并且由于其抗炎作用，DAI评分显著降低，如表皮生长因子r的表达降低所示结肠组织切片中的受体。

有趣的是，第6组小鼠的组织学指数得分值（DSS暴露后口服剂量为40 mg/kg体重（shogaol）低于第3组小鼠的可比值（DSS暴露和6-TG治疗）此外，第6组小鼠结肠粘膜和粘膜下层仅出现少量炎性细胞浸润，无上皮损伤或增生，而第3组小鼠结肠切片出现中度变化，如粘膜和粘膜下层中度炎症，局部上皮糜烂，轻度上皮损伤增生和杯状细胞丢失。这些结果表明 mg/kg体重剂量的Shogaol在治疗UC方面可能优于6-TG，并且它们通常与Zhang等人的研究结果一致[33[谁表示，纳米颗粒的口服递送纳米粒子，能够在UC的小鼠模型中衰减结肠的炎症。

结肠组织切片免疫组化染色结果显示，DSS暴露于不同组小鼠中，CD133表达程度不同，对照组为阴性表达。对照组呈局灶性弱表达;3组(DSS暴露+ 6-TG治疗)局灶性、弱-中度表达;第4组(DSS暴露+ 10 mg/kg b.w. Shogaol处理)弥漫性、弱表达;第5组(DSS暴露+ 20 mg/kg b.w. Shogaol处理)和第6组(DSS暴露+ 40 mg/kg b.w. Shogaol处理)呈弥散性中度表达。这些发现表明，在本研究中执行的不同类型的治疗导致了不同程度的dss诱导的结肠炎改善。在20和40 mg/kg b.w. Shogaol处理组中，CD133的表达不仅局限于隐窝位，而且还扩展到瞬时扩增区和结肠隐窝尖部分化的结肠细胞。6-TG治疗组结肠隐窝深部弱-中表达，提示Shogaol治疗UC可能优于6-TG。这一结果与Karim等人的发现一致[34研究发现，CD133在肠道再生中具有重要作用，其信号通路在调节肠道稳态中发挥重要作用。

不同组dss暴露小鼠的黏膜隐窝上皮细胞和结肠黏膜间充质细胞中也可见CD34的表达，而对照组的表达为阴性。对照阳性小鼠(DSS暴露未处理)的粘膜隐上皮无明显表达，间充质细胞中中度表达;在3组(DSS暴露和6-TG处理)，粘膜隐窝和间充质细胞中可见弱-中表达;在第4组中，粘膜隐窝和间充质细胞中均有少量弱表达;5组(DSS暴露+ 20 mg/kg BW Shogaol处理)和6组(DSS暴露+ 40 mg/kg BW Shogaol处理)粘膜隐窝和间充质细胞中均有中强表达。这些结果表明，20和40 mg/kg BW Shogaol处理的小鼠在dss诱导的UC肠道再生方面优于常规免疫抑制化疗药物6-TG处理的小鼠。这一发现与Pull等人的研究结果一致，Pull等人报道巨噬细胞的激活代表结肠上皮祖细胞生态位对损伤的适应性反应[35，这也与Stzepourginski的发现相一致等世卫组织指出，CD34+是IESC生态位内稳态的一个重要因素，它有助于肠道炎症和损伤后的修复[36］.

5.结论

目前的研究结果表明，生姜衍生物质Shogaol的口服治疗，尤其是20和40 在DSS诱导的UC治疗中，mg/kg体重剂量可能优于传统的免疫抑制化疗药物6-TG，因为后者的治疗通常伴随着不利的副作用，如肝毒性、肾毒性和骨髓抑制。DAI参数（血便、腹泻和直肠出血）结肠测量和组织病理学指数评分显示，由于舒高的抗炎作用，舒高在改善结肠炎方面的积极作用优于6-TG，IHC分析还显示舒高在激活CD133方面的作用优于6-TG，而CD133在肠道再生和调节肠道炎症方面具有重要作用肠道内环境稳定。此外，IHC结果显示，Shogaol在激活CD34方面比6-TG更有效，CD34通过激活间充质细胞在改善隐窝损伤方面发挥了重要作用，间充质细胞是肠道内环境稳定和损伤后干细胞生态位的主要组成部分。

数据可用性

所有用于支持本研究结果的数据均包含在本文中。

的利益冲突

作者声明没有利益冲突。

致谢

作者谨向苏莱曼尼大学兽医学院讲师Azad Kareem Saeed表示特别的感谢和感谢，感谢他在动物安乐死和组织取样过程中的善意支持和帮助。

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