HSV-TK /高热的可能机制结合131 i-antiafpmcab-gcv治疗肝癌的团簇

文摘

我们之前的研究结果显示出良好的治疗效果的组合自杀基因HSV-TK核素131我和磁性流体高热(瘤)肝癌利用磁性纳米颗粒作为连接器,远比任何单一治疗,没有副作用。这种联合治疗可能是一个合格的策略治疗肝癌症。然而,目前尚不清楚如何结合疗法治疗效果。在最近的研究中,探索的可能机制radionuclide-gene疗法结合治疗肝癌细胞瘤组织,细胞,和分子水平,为其临床应用提供理论和实验数据,我们检测了细胞凋亡诱导的联合治疗和研究蛋白质的表达与细胞凋亡相关的如生存素、推荐、bcl - 2、p53、和核蛋白质Ki67参与细胞增殖,检测VEGF和MVD与肿瘤组织的血管生成和分析治疗后的病理变化。结果表明,联合治疗显著诱导肝癌细胞凋亡。生存素的表达,VEGF、p53、bcl - 2,推荐,Ki67, VEGF蛋白和微血管密度(MVD)在治疗后都减少了。治疗机制可能参与Ki67的差别,对这些基因的表达导致肿瘤细胞增殖抑制和存活素的抑制,bcl - 2, p53,推荐-蛋白表达诱导肿瘤细胞凋亡,负调节VEGF蛋白表达,并减少血管内皮细胞,从而导致肿瘤血管生成抑制微血管密度减少和肿瘤细胞坏死。这些发现提供了另一种基本的数据支持和理论基础的联合治疗的临床应用。

1。介绍

我们都知道,癌症已成为危害人类健康的头号杀手,发病率和死亡率最高的。毫无疑问,放疗、化疗,温热疗法,生物疗法有助于抗肿瘤治疗在很大程度上,但每个人都有自己的优点和缺点,他们很难彻底治愈癌症。鼓舞人心,综合治疗,基于多学科联合治疗策略和(或)多重方法的特定方式的各自特性,表明恶性肿瘤治疗的巨大潜力。这不是一个简单的重叠的一些协议,但投入使用合理互补的优势,导致一个有效的合作(1]。研究表明,超过两个的组合治疗方案可以获得更好的抗肿瘤效果比任何单方参与(1- - - - - -5]。在我们之前的研究中,我们有机结合自杀基因,核素内照射,磁性流体高热(瘤)治疗肝癌采用磁性纳米颗粒作为铰链。在细节,pHRE-Egr1-HSV-TK利用PEI-Mn转染到肝癌细胞_0.5锌_0.5菲₂O₄纳米颗粒(PEI-MZF-NPs)作为基因转移载体,随后131年i-antiafp McAb-GCV-BSA-NPs介入到肝癌,然后是肿瘤定向在交变磁场加热采用PEI-MZF-NPs磁性媒体。因此,在131年我和高热杀死肿瘤细胞,核素照射使Egr1催化剂诱导HSV-TK基因表达,尤其是表达式可以增强在缺氧一定是固体癌症,导致基因的多个目标造成影响,放射性核素对肝癌和高烧。结果表明,radionuclide-gene结合对肝癌细胞瘤有很好的治疗作用,远比任何单一药物疗法;此外,没有发现明显的副作用1]。它可能是一个适用的肝癌症治疗的策略。然而,如何联合治疗对肝癌起到治疗作用?的机制是什么?这还不清楚。

据悉,放疗、化疗、基因治疗和温热疗法有自己的抗肿瘤机制,全面的和复杂的。他们会以各种方式发挥抗肿瘤作用。例如,他们可能诱导肿瘤细胞凋亡,抑制细胞增殖,抑制肿瘤血管生成、诱导细胞坏死。其抗肿瘤作用也可能是联合行动的结果不同的方式(6- - - - - -9]。在当前的研究中,进一步研究antihepatoma radionuclide-gene疗法结合的效果,探索可能的机制在组织、细胞、分子水平,并为其临床应用提供理论依据和实验数据,结合的凋亡诱导治疗研究;蛋白质的表达变化与细胞凋亡相关的如生存素、推荐、bcl - 2、p53、和核蛋白质Ki67参与细胞增殖进行了分析;VEGF和MVD与肿瘤组织的血管生成相关检测;和治疗后病理变化被观察到。

2。材料和方法

2.1。主要材料

的膜联蛋白V-FITC /π装备从英杰公司公司购买。生存素、Ki67推荐,bcl - 2、p53、VEGF、MVD免疫组织化学用品从细胞信号技术公司购买。HepG2细胞线提供的生物化学和细胞生物学研究所中国科学院上海生物科学研究所。PHRE-Egr1-HSV-TK建成之前(1]。对照组肝肿瘤组织,放射性核素,确定集团radionuclide-gene集团和radionuclide-gene-MFH组来自之前的研究(1]。

2.2。方法

2.2.1。细胞凋亡分析流式细胞分析仪

通过PEI-MZF-NPs PHRE-Egr1-HSV-TK是转染作为文献[1]。转染细胞(细胞HepG2 / TK) subcultivated在培养板6井。实验落入这些组:(1)负对照组(没有转染HepG2细胞);(2)131年我集团(HepG2细胞转染,称为核素集团);(3)radionuclide-gene集团(pHRE-Egr1-HSV-TK / 131 i-antiafpmcab-gcvgroup);(4)细胞瘤组(HepG2细胞没有转染);和(5)radionuclide-gene-MFH组(pHRE-Egr1-HSV-TK / 131 i-antiafpmcab-gcv /细胞瘤组)。孵化24 h后,每组相应增加131 i-antiafpmcab-gcv-bsa-nps(最终浓度:200μCi), PEI-MZF-NPs(最终浓度:10 g / l), 131我(最终浓度:200μCi)、DMEM。组(3)孵化为48 h O 37°C条件下的0.1%₂,5%的公司₂和N₂平衡气体(缺氧条件)。孵化后24 h在常规条件下,集团(4)是由一个高频加热器加热1 h(30 4千瓦,230 Hz,)然后继续在常规条件下培养了23 h。孵化24 h后37°C以上缺氧条件下,集团(5)是由一个高频加热器加热1 h(30 4千瓦,230 Hz,)然后继续培养23 h在缺氧条件下在37°C。组(1)和(2)在常规条件下培养48 h。

分别收集每组的细胞,然后用Annexin-V-Fluos标记。在黑暗在室温下15分钟孵化后,分析了细胞的凋亡与流式细胞分析仪(FCM,有利的SE, BD公司,美国)。

2.2.2。细胞超微结构检查

检测细胞超微结构变化,治疗后肿瘤组织(1]在4%戊二醛固定,随后制成超薄部分,沾染了醋酸双氧铀及柠檬酸铅,然后在TEM (H600、日本)。

2.2.3。免疫组织化学检查

进一步确认组合疗法的疗效,探索结合疗法的机制抑制肿瘤细胞增殖和诱导细胞凋亡和肿瘤血管生成,影响生存素,Ki67,推荐,bcl - 2、p53、VEGF蛋白和肿瘤组织中MVD与不同的干预措施进行了免疫组织化学(包含IHC)测定。IHC histostain-plus包程序。治疗后肿瘤组织中MVD与免疫组织化学分析“热点”标签CD34在目前的研究方法。详细的特殊抗体CD34被包含IHC用来标记内皮细胞,然后内皮细胞数在光学显微镜(日本奥林巴斯)。最后,微血管是间接测量(10,11]。

免疫组织化学结果评估如下(12- - - - - -14]。推荐、bcl - 2、VEGF蛋白表达在肿瘤细胞的细胞膜和细胞质。生存素存在于细胞膜、细胞质或细胞核。P53和Ki67蛋白质在细胞核积累。淡黄色到棕色污点在细胞质中,细胞膜、细胞核被认为是积极的。没有区别肿瘤和地面被定义为负的污渍。分别阳性细胞和总细胞数,然后是阳性细胞百分比(PP)和积极的指数(PI)按照下列公式计算。 。染色细胞(SC)得分根据页(0 =不得分;11% - -25% = 1;26% - -50% = 2;51% - -75% = 3;> = 4 75%)。染色强度(SI)得分如下:- = 0;黄色= 1;棕黄色= 2;布朗= 3。 PI > 3 means it is positive.

2.2.4。组织病理学检查

肿瘤组织不同的干预措施在4%中性甲醛固定,然后切割并且沾染了他,最后把他组织病理学的光学显微镜分析。

2.2.5。统计分析

值显示为平均数±标准差。数据用SPSS 23.0分析程序。一个值< 0.05被认为是重要的。

3所示。结果与讨论

3.1。诱导肿瘤细胞凋亡

诱导肿瘤细胞凋亡是一种常用的抗肿瘤机制对化疗和放疗,而温热疗法不仅能诱导细胞凋亡本身还能明显增强放疗和化疗引起的细胞凋亡。流式细胞术分析的结果表明,131年核素内照射我,和自杀基因TK / Egr1一定是所有驱动诱导肝癌细胞凋亡,但这三个的联合应用更强的效果。radionuclide-gene-MFH组的细胞凋亡率达到80.36%,远高于14.44%的核素,23.13%的细胞瘤组,radiation-gene组的25.83%,和5.68%的负对照组(表1)。

细胞超微结构检查通过TEM (H600、日本)也认证代表凋亡细胞的形态学特征包括karyopyknosis,染色质缩合、凋亡的身体,细胞质空泡形成nuclide-gene-MFH组(图1 (b))。相比之下,肝癌细胞生理盐水对照组是常规的形状,大核仁和细染色质(图1(一)),这表明诱导癌细胞凋亡也是radionuclide-gene结合细胞瘤的抗肿瘤机制有效治疗肝癌,放射性核素的联合,自杀基因HSV-TK,瘤凋亡诱导可以有一个很好的协同效应。

进一步证实凋亡诱导的联合治疗,探索如何诱导肿瘤细胞凋亡的协同作用在分子水平上,我们发现一些蛋白质的表达与细胞凋亡相关的如生存素、bcl - 2,推荐和p53在治疗后包含IHC在这项研究。

细胞凋亡迄今为止发现的最强的抑制因子,生存素癌症发展和预后密切相关。这是几乎正常组织中表达,但在许多恶性肿瘤如肝癌和胃癌。通过抑制凋亡蛋白酶的活性,过表达生存素蛋白可以支持肿瘤细胞逃避细胞周期检查点监测的G2 / M过渡,抵抗细胞凋亡DNA损伤或突变,导致异常细胞分裂和增殖15- - - - - -18]。antiapoptosis基因bcl - 2,这是研究最广泛、最深入到目前为止,在许多人类恶性肿瘤广泛表达。bcl - 2细胞凋亡的关键调节器,可以广泛抑制各种刺激来抑制细胞凋亡,从而获得细胞生命延长。bcl - 2过表达可以增强细胞抵抗大多数DNA损伤,但它不能防止伤害自己,也不能促进DNA损伤修复。已经证实,bcl - 2可以抑制细胞凋亡由p53蛋白分子传感器的DNA损伤但不能抑制p53搬到细胞核和增长由p53被捕。因此,bcl - 2可能发挥作用在细胞凋亡的信号激活后达到目标分子DNA损伤(19- - - - - -23]。P53基因与人类密切相关的肿瘤的发现到目前为止。强烈与凋亡相关的监管。野生型分子充当警察,监测细胞基因组的完整性。一旦DNA是受伤,p53蛋白将积累和激活修复受损的DNA修复系统。如果修复失败,p53蛋白能诱导细胞凋亡而死。一旦缺失或突变,p53基因将失去监控功能,不能防止细胞增殖和诱导细胞凋亡。结果,损坏和不匹配的DNA进入S期细胞,从而导致基因突变和染色体畸变,最终出现致癌作用。然而,野生型p53蛋白的半衰期太短被包含IHC检测,而突变型p53蛋白可以很容易地检测到包含IHC长半衰期。因此,p53蛋白的包含IHC检测癌组织通常被认为是突变型p53基因产物。 Studies have shown that most cancers are accompanied with mutant p53 overexpressed. The excessive mutant p53 protein not only loses the role of “police” but also serves as a tumor-promoting factor to resist and eliminate the functions of normal p53 [24- - - - - -26]。推荐,新发现的一种apoptosis-inhibiting因素,可以抑制半胱天冬酶和半胱天冬酶9 3/7活动块基于凋亡受体或线粒体凋亡通路。它在人体正常组织几乎不表达,但在许多人类恶性肿瘤包括肝癌(12,27,28]。

包含IHC在这个研究的结果表明,生存素,bcl - 2, p53,推荐-蛋白质都是积极的生理盐水对照组。bcl - 2和推荐-蛋白质染色颗粒棕黄色或棕色在细胞膜和细胞质,与细粒度的棕黄色或棕色染色和生存素蛋白表达在细胞膜,细胞质,细胞核,p53蛋白存在于细胞核。与对照组相比,存活素,bcl - 2,推荐,和p53蛋白表达在不同程度削弱了所有的实验小组,显示阳性细胞的数量很少,更轻的染色,和更低的π。PP bcl - 2蛋白的放射性核素集团已从生理盐水对照组无统计学差异( ),但其积极的强度明显降低,其π降至12 8。bcl - 2页生存素的,推荐和p53蛋白在其他实验群体都是统计不同于生理盐水对照组( )除了PP放射性核素的bcl - 2蛋白组,但四个蛋白的表达radionuclide-gene-MFH下降最显著,和π只有1,这表明这些基因的表达被完全抑制(数字2- - - - - -5和表2- - - - - -5)。这表明,内部接触放射性核素,radiation-gene疗法,和细胞瘤诱导肝癌细胞凋亡可能是意识到生存素表达下调表达,bcl - 2, p53,推荐-基因。三种治疗方法的组合可以得到最致命的细胞凋亡,具有明显的协同效应。

3.2。抑制肿瘤细胞增殖

恶性肿瘤的最基本的生理特征是不灭,和增殖活性与肿瘤生物学行为密切相关,特别是肿瘤侵袭、转移和预后。我们之前的结果,如细胞增殖的抑制率、细胞形态学变化,和大众的抑制率和体积抑制率异种移植肝癌,表明,单药治疗和联合治疗对肝癌抗增殖的影响,但131年我的目标联合治疗,HSV-TK,使用磁性纳米颗粒细胞瘤(Mn_0.5锌_0.5菲₂O₄)作为运营商获得最强的抑制效果,远比任何涉及单一疗法(1]。

ki - 67是一个核扩散标记参与有丝分裂。它提供了一个明显的周期性现象在细胞周期:没有在G0阶段表达,然后出现在G1期中期或晚期阶段,然后逐渐增加在S期和G2期,随后有丝分裂期达到峰值,最后阶段的细胞分裂后期迅速消失。因为它的半衰期短,快速降解细胞周期后,ki - 67蛋白被认为是最可靠的指标,评估肿瘤细胞的增殖活动。通常,ki - 67是越多,更活泼的细胞增殖。其标签指数应用于评估癌症治疗的疗效[29日- - - - - -31日]。因此,Ki67蛋白质是选择代表核扩散水平和测试在这个研究。结果表明,内部接触放射性核素,radionuclide-gene治疗,及其组合都下调Ki67的表情,但Ki67表示至少在联合治疗组(radionuclide-gene-MFH集团)及其扩散指数小得多比任何其他组(图6和表6)。如此推断降级Ki67表达式可能会抑制肝癌扩散的方法之一。其机制可能参与以下。降低Ki67的表达手段抑制DNA合成,从而抑制肿瘤细胞质和细胞核的复制,最终导致细胞有丝分裂阻断和细胞增殖抑制。组合内部的放射性核素,radionuclide-gene疗法,和细胞瘤Ki67表达最强烈的抑制作用,具有明显的协同效应。

3.3。抑制肿瘤血管生成

肿瘤的生长和转移依赖于肿瘤新生血管形成。一般来说,肿瘤没有血管生成主要依赖于相邻供应氧气和营养的血液流动系统色散和带走代谢产物。在这种情况下,肿瘤细胞凋亡率通常是非常高的和肿瘤休眠或最终回归。然而,一旦新血管生成,肿瘤将迅速增长,甚至转移。VEGF和MVD均良好的指标来反映肿瘤血管生成(32- - - - - -35]。

VEGF,特定的血管内皮细胞有丝分裂原,是最重要的一个积极的调控因子在血管生成过程中,发挥着重要的作用在肿瘤血管生成。其功能主要涉及三个方面:(1)增加血管通透性。具体而言,VEGF是已知最强的渗透增强剂,它可以增加血管的通透性,促进血浆蛋白和纤维蛋白原外渗,造成细胞外基质的变化,并最终促进新血管生成和新矩阵的形成;(2)促进血管内皮细胞的有丝分裂和刺激血管内皮细胞增殖和血管生成;和(3)VEGF可以诱导蛋白水解酶的表达,组织因素,间质胶原酶,激活因子VII释放,改变细胞外基质,调节内皮细胞迁移和入侵。因此,它有利于血管生成。一句话,VEGF与肿瘤细胞不仅可以诱导肿瘤血管生成,也可以改变新血管的结构,从而导致血管的异常功能以支持肿瘤生长,帮助肿瘤细胞“逃脱”转移。研究表明,在正常组织VEGF表达极低,在相当高的肝癌和其他恶性肿瘤。VEGF蛋白被应用作为肿瘤预后的指标和转移(36,37]。MVD是一个广泛使用的指标来评估血管增生程度和反映肿瘤浸润的潜在能力,复发和转移在一定程度上。它可以用来作为肿瘤预后的独立预测指标(38,39]。CD34是最受欢迎的和特殊的标记血管内皮细胞,并且可以直接反映肿瘤MVD的表达水平。通常,CD34越多,越高MVD。“热点”的免疫组织化学的方法通常是采用MVD CD34蛋白的分析考试(10,11]。探索细胞瘤的影响,放射性核素131我自杀基因HSV-TK,及其对肝癌血管生成的组合,由包含IHC VEGF蛋白研究,MVD变化分析了由标签CD34免疫组织化学“热点”的方法治疗后的肿瘤组织在目前的研究。

如图7和表7页和π的VEGF蛋白在放射性核素90.64±4.33%和12组,分别显著高于对照组77.06±6.10%和8。放射性核素的MVD组33.2±3.56%,显著高于对照组(图20.6±3.51%8),这表明核素治疗增加VEGF基因表达并促进微血管的形成。这可能是肿瘤的生存的自我保护减少辐射对肿瘤血管毒性。它也可能是缺氧造成的自适应性辐射。MVD和VEGF蛋白在其他实验群体减少和他们的PP和π的VEGF和MVD均小于放射性核素组和对照组( ),但它是最小的radionuclide-gene-MFH组。radionuclide-gene治疗后结合磁性流体高热,PP和π的VEGF蛋白只有9.32±2.33%和1,分别和MVD只是3.2±0.84%,远低于在其他组( )(数据7- - - - - -9和表7)。深蓝磁性材料与普鲁士蓝染色观察肿瘤组织的细胞瘤组和radionuclide-gene-MFH集团(数字9 (d)和9 (e))。线性相关分析VEGF和MVD之间表现出显著的正相关关系(图10, ),进一步证实了VEGF在肿瘤血管生成的重要作用。上述数据表明,自杀基因和磁性流体高热可以下调VEGF表达,抑制血管生成,降低微血管密度,和抵制VEGF的表达和微血管密度的增加引起的放射性核素,显示一个明显的放射线增减效应。然而,放射性核素的结合应用,基因,抑制肿瘤血管生成和细胞瘤显示最强的,比任何单一疗法,这表明血管生成抑制可能是另一个重要机制radiation-gene疗法结合治疗肝癌的磁性流体高热。

3.4。诱导肿瘤细胞坏死

)染色法分析表明,肿瘤细胞在生理盐水对照组密集并积极增生。出血和坏死不同程度在所有实验观察组,但它是最严重的一个radionuclide-gene-MFH组与大面积坏死的癌症组织像“地图”,坏死区沾染了红色,凝固坏死肿瘤细胞,细胞核崩解或失踪。许多点状或片状坏死主要是放射性核素组,细胞瘤组和radionuclide-gene组(图11)。

流式细胞仪分析显示每个实验组一定程度的坏死,坏死率为5.89%,9.99%,9.35%,和23.02%的放射性核素组,确定集团radionuclide-gene集团分别和radionuclide-gene-MFH组。显然,三个合并后集团的坏死率最高,显著高于其他组,表明核素,自杀基因和磁场感应加热均可诱发肝癌坏死,但三个联合治疗可能产生明显的协同效应(表1)。可能的机制如下。体温过高可能会导致蛋白质变性和损害细胞膜、线粒体膜、溶酶体膜、内质网。细胞膜损伤可能会导致渗透率的增加,Na⁺和Ca^{+ +}流入,最终细胞肿胀和坏死。反过来,前体药物GCV自杀基因HSV-TK,放射性核素131我容易进入细胞,发挥治疗作用。溶酶体membranolysis可能会导致大量的酸裂解酶被释放,导致进一步破坏细胞膜和细胞质流出口。最后,细胞死亡。更重要的是对线粒体损伤。在正常细胞线粒体通常不到,在肿瘤细胞中,线粒体结构被破坏后,肿瘤细胞的有氧代谢是无序的。随后,ATP酶减少和ATP合成障碍,最终导致肿瘤细胞变性或坏死,而自杀基因HSV-TK和放射性核素131我大大加剧了这一角色。除了血管生成抑制体温过高和自杀基因,根据解剖学特点,肿瘤血管对热敏感,辐射,和许多化疗药物。Radiation-gene疗法结合磁性流体高热也可以直接摧毁原始肿瘤血管的结构和功能,导致血管舒张,组织充血,血液流动停滞,并最终肿瘤组织因缺血坏死。

4所示。结论

放射性核素的hepatoma-targeted疗法相结合,自杀基因,并与有机PEI-MZF-NPs呈现一个明显的互补协同效应。它有一个很好的抗癌效果,远比任何单一疗法。Ki67的差别其机制可能参与对这些基因的表达导致肿瘤细胞增殖抑制和存活素的抑制,bcl - 2, p53,推荐-蛋白表达诱导肿瘤细胞凋亡,负调节VEGF蛋白表达,并减少导致肿瘤血管生成抑制血管内皮细胞和微血管密度下降,诱导肿瘤细胞坏死。这些发现提供了一个基本的数据支持和理论依据联合治疗的临床应用。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

工作是由中国国家自然科学基金资助(81571797)和333年计划江苏的基础,中国(BRA2017173)。

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