体外培养条件下衰老对NK细胞数量及增殖的影响

摘要

自然杀伤细胞(NK)群体、表型和功能的年龄相关变化直接归因于多种疾病和感染的风险。据预测，这将是死亡率上升的主要原因。根据CD56的表面密度，NK细胞又细分为两种类型，如CD56^明亮的和CD56^昏暗的细胞，代表细胞因子的产生和细胞毒性。在我们的研究中，我们检测了不同年龄组(41岁至80岁)的NK细胞群体及其亚群的年龄相关变化。我们发现，无论男女，总淋巴细胞计数都随着年龄的增长而显著下降。然而，总免疫细胞水平也随着年龄的增长而下降，令人惊讶的是，总NK细胞数量显著增加，大部分NK细胞是CD56^昏暗的．随后，我们评估了NK细胞的增殖潜能，我们的结果显示，NK细胞的增殖能力随着年龄的增长而下降。总的来说，我们的研究结果证明，随着年龄的增长，循环NK细胞的数量会增加。然而，与年轻组(<41岁)相比，随着年龄增长的增殖率下降。

1.导言

自然杀伤细胞(NK)被认为是抵抗病毒感染和病毒转化细胞的主要防御淋巴细胞。其防御系统的覆盖范围已扩大到包括抗菌素反应[1，2]，消除衰老细胞[3.，炎症的消除[4，5]，诱导过继免疫反应[6，7］.这些潜在的NK细胞被鉴定为CD56阳性和CD3阴性，它们分布在我们大多数的器官和组织中，特别是外周血、皮肤、淋巴结、骨髓、胸腺、肝脏、肠、肺、子宫等。NK细胞根据其CD56表达的表面密度分为两种不同的种群，即CD56^明亮的和CD56^昏暗的NK细胞;它们都有独特的功能特征[8］.简单地说,CD56^明亮的NK细胞是循环系统中最小的(10%)细胞群，具有低或无细胞毒性反应。然而，这种NK细胞子集产生一系列影响免疫调节的细胞因子和趋化因子，因此这些细胞通常被称为“细胞因子制造者”。相比之下,CD56^昏暗的NK细胞在循环系统中占主导地位(90%)，是天然和抗体依赖性细胞毒性的有效介质[9，10］.NK细胞的绝对数量及其NK^明亮的: NK^昏暗的这一比例随着年龄的增长而降低，这可能是老年人更容易患多种疾病、感染和癌症的原因之一。

生理衰老是一个进化保守的过程，与免疫细胞(包括NK细胞)的功能缺陷或受损有关。NK细胞功能受损称为NK细胞免疫衰老。年龄相关的NK细胞免疫衰老有助于提高病毒感染和癌症诱导的发生率。此外，NK细胞介导的衰老细胞消除随着衰老而下降，导致衰老细胞在组织或器官中积聚，破坏组织稳态及其功能。NK细胞介导的衰老细胞消除是一个由NK完成的直接消除(迁移、识别、结合和消除其靶标)过程^昏暗的细胞通过颗粒胞吐途径[3.］.然而，最近的一项研究推测，随着年龄的增长，NK细胞穿孔素的表达模式和迁移能力下降^昏暗的细胞，直接影响NK细胞介导的对衰老细胞的细胞溶解。与NK细胞不同^昏暗的细胞、总种群、表型和功能^明亮的细胞因衰老而衰退，这是由于免疫调节差、炎症分解差和适应性免疫诱导差。一项研究考察了衰老对NK细胞细胞因子产生的影响^明亮的并报道了细胞因子(IFN-γ，MIP-1α如IL-8等)在老年NK细胞中明显降低^明亮的在年轻NK细胞中^明亮的细胞(11］.

一些研究表明，随着CD56的增加，NK细胞的数量和亚群会随着年龄的增长而变化^昏暗的和CD56的减少^明亮的人口(12- - - - - -15］.在老年人中，NK细胞活性降低已被证明与许多疾病的发病率和严重性增加有关，如冠心病[16]，肝纤维化[17]、传染病及癌症[18］.因此，具有较高活性的NK细胞是自然健康的先决条件[19，20.］.在癌症患者中，我们已经证明NK细胞数量越多，生活质量越好[21］.在先天免疫系统中，NK细胞是早期防御的重要宿主。它们也有一个独特的功能，作为免疫调节细胞因子的主要来源，它们部分调节单因子的产生。为了做到这一点，在本研究中，我们直接比较了男性和女性群体在不同年龄点的NK细胞及其亚群的绝对数量，并以明确的方案检测了各自年龄组的NK细胞扩展潜力。

2.材料和方法

2.1.PBMC分离和定量

40名献血者的外周血来自不同的年龄组(从41岁到80岁)，没有严重的疾病或癌症史。所有登记的捐赠者都签署了由马来西亚大学医学中心医学研究伦理委员会批准的知情同意书。采用淋巴准备(Axis-Shield Diagnostics Ltd.， Oslo, Norway)密度梯度培养基分离含NK细胞的外周血单个核细胞(PBMCs)。用镁和无钙磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗分离的pbmc两次。使用自动细胞计数器(美国Nexcelom Bioscience)对pbmc进行计数。

2．2．天然杀伤细胞在体外扩张

最终将分离的pbmc重悬在含有10%自体血浆和700iu /ml IL-2的NK细胞扩增培养基中。悬浮质粒以1 × 10的密度播种⁶/ml，按照我们之前描述的协议[22］.

２．３．流式细胞术分析

使用NK特异性抗体，特别是CD56-PE和CD3-PC5，进行流式细胞术分析，以鉴定和量化外周血和培养细胞中的NK细胞群（Beckman Coulter Inc.，美国）。按照制造商的说明进行染色。将染色的细胞洗涤并重新悬浮在PBS中，并通过流式细胞仪（FC 500，Beckman Coulter Inc.，USA）进行分析。使用制造商提供的CXP软件分析获得的数据。

2.4.统计分析

每组的数据均表示至少三个独立实验的平均值和标准误差(SE)。各组间的统计比较采用Student’s进行分析t以及。的值^{， ，} 被认为具有统计学意义。

3.结果

３．１．衰老对淋巴细胞计数的影响

研究人群由40人组成( 男性和 女性)，被分成四组，每组5男5女;1组(41 ~ 50岁)、2组(51 ~ 60岁)、3组(61 ~ 70岁)、4组(71 ~ 80岁)。使用自动分析仪对不同年龄组的绝对淋巴细胞计数进行分析，结果显示平均淋巴细胞计数随着年龄的增长而显著下降(图)1(一)）.每升PB中淋巴细胞的平均数量为3.12×10⁹0.25±2.8×10⁹0.13±2.6×10⁹±0.08,2.4×10⁹±0.09(41-50岁、51-60岁、61-70岁、71-80岁)。与男性相比，在所有年龄组中，女性的淋巴细胞计数都要低得多(图)1 (b)）.这些结果表明，女性比男性更容易感染疾病，并伴随着更快的衰老。

3.2.老龄化对NK细胞群的影响

分析各年龄组外周血NK细胞的百分比。CD56的中位数百分比⁺随着年龄的增长，NK细胞数量显著增加，CD56的表达模式为7.3 ± 1.5%（41-50岁），9.6 ± 1.8%（51-60岁），10.8 ± 2.3%（61-70岁）和14.7 ± 3.0%（71-80岁）（图2(一个)）.50岁以后，CD56⁺与相应的男性相比，女性的NK细胞数量显著减少(图)2 (b))接下来，我们分析了CD56的NK细胞亚群⁺NK^昏暗的和CD56⁺NK^明亮的在不同年龄组中，CD56的表达模式存在显著差异⁺NK^昏暗的和CD56⁺NK^明亮的在所有年龄组。然而，成熟的CD56⁺NK^昏暗的细胞群主要存在于所有年龄组，而不成熟的CD56数量极少或可忽略⁺NK^明亮的在所有年龄组中均发现细胞群(图)2 (c))这一信息表明，成熟NK细胞（CD56）的数量增加⁺NK^明亮的)可能是长寿NK细胞积累的结果，也可能是清除衰老细胞的常规过程受损的结果。

３．３．衰老对NK细胞增殖的影响

在第0天，从不同年龄组中平均或多或少地接种数量相近的pbmc，然后在NK细胞特异性培养基中让细胞生长14天。14 d后采用台台蓝排除法计数。NK细胞在所有年龄组均成功培养，纯度均在90%以上。不同年龄组间NK细胞折叠度变化情况，培养14天后，男女NK细胞折叠度随年龄增长均显著降低(图)3(一个)）.流式细胞术分析显示，复制的NK细胞多为CD56⁺NK^明亮的细胞在所有年龄组，而CD56的数量非常少⁺NK^昏暗的在所有年龄组中均观察到细胞（图3 (b)）.这些结果提示CD56⁺NK^明亮的细胞在所有年龄组的表达是相同的，尽管在不同年龄组之间NK细胞折叠率的变化在男性和女性中随着年龄的增长显著下降。

4.讨论

在使用更新的方法和策略的情况下，操纵更占优势。最明显的改变是免疫功能的放松，这使老年人更易受感染[19］.研究表明，与NK细胞数量较多的人相比，NK细胞数量较少的老年人死亡率较高[23］.此外，从老年供体中分离的细胞毒性显著降低[24］.另一方面，有研究报告说，NK细胞在健康的老年人身上产生更好的细胞毒性[25，26］.我们的数据显示，外周血淋巴细胞总数随着年龄的增长而下降。Chidrawar等人也证实了淋巴细胞随着年龄增长而下降[27］.相反，男性总淋巴细胞计数高于女性。在男性中，饮酒、吸烟和压力水平与较高的淋巴细胞计数有关[28］.

结果显示，CD56的数量^明亮的NK细胞随着年龄的增长而减少，这可能对老年人NK细胞的功能有很大的影响[27］.我们的数据也与早期的一项研究一致，该研究表明CD56的水平^明亮的与CD56相比，四组NK细胞均较低^昏暗的.随着年龄的增长，NK细胞总数增加；然而，与年龄相关的增加可能是老年人中长期存在的NK细胞的积累[29].尽管老年队列中存在大量NK细胞，但溶解能力较低[24］.

在本研究中，我们使用优化方案从不同年龄组的健康捐赠者中产生大量活化的NK细胞。临床门IL-2的使用在NK细胞的发育、活化和扩增中起着至关重要的作用[30.，31］.在IL-2存在的情况下，我们获得了最佳的fold expansion从60 ~ 100倍，并且扩展的NK细胞主要由CD56组成^明亮的负责先天免疫反应和细胞因子产生的人群[27，32］.然而，老年队列细胞的数量在14天内并没有达到100倍。未成熟CD56的低数量^明亮的在老年人队列中，细胞可以延缓折叠变化[24］.

在我们的研究中，我们发现淋巴细胞和CD56的数量^明亮的NK细胞随年龄增长而减少，CD56细胞数量减少^昏暗的NK细胞增加。然而,在在体外IL-2的激活，CD56的表达^明亮的总的来说，我们的优化方案成功地扩大了CD56的数量^明亮的NK细胞。然而，需要一种更详细的方法来评估这些变异NK细胞群体的细胞毒性活性。

数据可用性

由于保密原因，本研究期间生成和/或分析的数据集不公开，但可根据合理要求从相应作者处获得。

的利益冲突

作者声明，本论文的发表不存在任何利益冲突。

参考文献

1. C. L. Small, S. McCormick, N. Gill等人，“NK细胞在宿主对急性细胞外防御中起着关键的保护作用金黄色葡萄球菌肺部细菌感染"免疫学杂志，第180卷，第1期。8, pp. 5558-5568, 2008。浏览：出版商的网站|谷歌学者
2. S.Schmidt，L.Tramsen，M.Hanisch等人，“人类自然杀伤细胞表现出抗肿瘤的直接活性来自烟曲霉属真菌菌丝，但不对抗静止的分生孢子，”传染病杂志第203卷第2期3, pp. 430-435, 2011。浏览：出版商的网站|谷歌学者
3. A. Sagiv, A. Biran, M. Yon, J. Simon, S. W. Lowe, V. Krizhanovsky，“颗粒胞外分泌介导衰老细胞的免疫监测”，致癌基因，第32卷，第2期第15页，1971-1977,2013。浏览：出版商的网站|谷歌学者
4. F.B.Thoren，R.E.Riise，J.Ousback等人，“人类NK细胞通过NKp46和Fas依赖机制诱导中性粒细胞凋亡，”免疫学杂志，第188卷，第4期，1668-16742012页。浏览：出版商的网站|谷歌学者
5. S. N. Waggoner, M. Cornberg, L. K. Selin，和R. M. Welsh，“天然杀伤细胞作为调节抗病毒T细胞的变阻器，”自然，第481卷，第2期。7381, pp. 394-398, 2012。浏览：出版商的网站|谷歌学者
6. A.Martín-Fontecha，L.L.Thomsen，S.Brett等人，“诱导NK细胞向淋巴结募集提供IFN-γ对于T_H1启动。”自然免疫学，第5卷，第12号，第1260-1265页，2004年。浏览：出版商的网站|谷歌学者
7. M. Vitale, M. Della Chiesa, S. Carlomagno等，“nk依赖的DC成熟是由TNF介导的α和干扰素γNKp30触发受体结合后释放，“血，第106卷，第2期。2，页566 - 571,2005。浏览：出版商的网站|谷歌学者
8. M. A. Cooper, T. A. Fehniger和M. A. Caligiuri，《人类自然杀伤细胞亚群的生物学》，免疫学的趋势第22卷第2期11，页633 - 640,2001。浏览：出版商的网站|谷歌学者
9. 鲍恩霍费尔，库斯，韩德胜。鲍姆和t。L. Whiteside，“CD56优先凋亡”^昏暗的癌症患者的自然杀伤细胞亚群欧洲免疫学杂志第33卷第3期1，页119-124,2003。浏览：出版商的网站|谷歌学者
10. A. Chan, D. L. Hong, A. Atzberger等人，“CD56^明亮的人NK细胞分化为CD56^昏暗的细胞:与外周成纤维细胞接触的作用免疫学杂志第179期1，页89-94,2007。浏览：出版商的网站|谷歌学者
11. J.Hazeldine和J.M.Lord，“老龄化对自然杀伤细胞功能的影响以及对老年人健康的潜在后果，”老龄化研究综述，第12卷，第2期4，第1069-1078页，2013。浏览：出版商的网站|谷歌学者
12. B. Sanchez-Correa, I. Gayoso, J. M. Bergua等，“急性髓系白血病患者NK细胞中DNAM-1表达的降低”，免疫学和细胞生物学，第90卷，第5期。1, pp. 109 - 115,2012。浏览：出版商的网站|谷歌学者
13. R. Solana, C. Campos, A. Pera，和R. Tarazona，“衰老对NK细胞亚群的塑造”，当前免疫学观点， vol. 29, pp. 56-61, 2014。浏览：出版商的网站|谷歌学者
14. R.Solana、G.Pawelec和R.Tarazona，“衰老与先天免疫，”免疫力，第24卷，第2期5，页491-494,2006。浏览：出版商的网站|谷歌学者
15. I. Gayoso, B. Sanchez-Correa, C. Campos等人，“人类自然杀伤细胞的免疫衰老”，先天免疫杂志，第3卷，第2期。4, pp. 337-343, 2011。浏览：出版商的网站|谷歌学者
16. Ł。Hak, J. Myśliwska, J. Więckiewicz等，“冠心病患者的NK细胞间隔”，免疫和老化，第4卷，第4期。1, p. 3, 2007。浏览：出版商的网站|谷歌学者
17. F. Fasbender, A. Widera, J. G. Hengstler，和C. Watzl，《自然杀伤细胞与肝纤维化》，免疫学前沿，第7卷，第29期，2016年。浏览：出版商的网站|谷歌学者
18. A. Cerwenka和L. L. Lanier，《感染、炎症和癌症中的自然杀伤细胞记忆》，自然评论免疫学，第16卷，第2期，第112-123页，2016年。浏览：出版商的网站|谷歌学者
19. S. C. Castle， "年龄相关免疫功能障碍的临床相关性"临床传染病第31卷第1期2，页578-585,2000。浏览：出版商的网站|谷歌学者
20. K.Ogata，E.An，Y.Shioi等人，“免疫正常的老年人中自然杀伤细胞活性与感染之间的关系，”临床与实验免疫学号，第124卷。3，第392-397页，2001。浏览：出版商的网站|谷歌学者
21. B. Subramani, K. Ratnavelu, C. R. Pullai et al.，“自体免疫增强治疗:四期结肠癌病例报告”，肿瘤的信件，第5卷，第5期。5, pp. 1611-1614, 2013。浏览：出版商的网站|谷歌学者
22. B. Subramani, C. R. Pullai, K. Krishnan等，“体外激活和扩大自然杀伤细胞和T淋巴细胞对结直肠癌患者的疗效”，生物医学报告，第2卷，第2期4, pp. 505-508, 2014。浏览：出版商的网站|谷歌学者
23. E. Remarque和G. Pawelec，“t细胞免疫衰老及其在人类中的临床意义”，《临床老年学评论》，第8卷，第1期，第5-14页，1998年。浏览：出版商的网站|谷歌学者
24. A. Facchini, E. Mariani, A. R. Mariani, S. Papa, M. Vitale，和F. A. Manzoli，“在人类衰老过程中循环Leu 11+ (CD 16)大颗粒淋巴细胞数量增加和NK活性降低”，临床和实验免疫学第68卷第2期2，页340-347,1987。浏览：谷歌学者
25. P. Sansoni, A. Cossarizza, V. Brianti等，“健康老年人和百岁老人的淋巴细胞亚群和自然杀伤细胞活性”，血，第82卷，第2期9，第2767-2773页，1993。浏览：谷歌学者
26. t·b·l·柯克伍德(T. B. L. Kirkwood)和c·弗朗切斯基(C. Franceschi)说，“衰老真的像看上去那样复杂吗?衰老研究的新视角，”纽约科学院年报，第663卷，第2期1，第412-417页，1992。浏览：出版商的网站|谷歌学者
27. S. M. Chidrawar, N. Khan, Y. L. T. Chan, L. Nayak和P. a . H. Moss，“衰老与外周血CD56的下降有关^明亮的NK细胞。”免疫和老化，第3卷，第2期。第1页，2006年。浏览：出版商的网站|谷歌学者
28. A. J. L. Torres, A. L. D. Angelo, E. M. Netto等人，“巴西两个不同地区献血者中T淋巴细胞群体的参考范围”，巴西传染病杂志，第13卷，第2期3，页221 - 225,2009。浏览：出版商的网站|谷歌学者
29. 张彦宏，D.L.华莱士，C.M.德拉腊等人，”在活的有机体内人类自然杀伤细胞动力学:衰老和急性和慢性病毒感染的影响免疫学号，第121卷。2，页258-265,2007。浏览：出版商的网站|谷歌学者
30. 白介素-2在效应反应、耐受和免疫治疗的十字路口，"免疫力第38卷第2期1，第13-25页，2013。浏览：出版商的网站|谷歌学者
31. M. Croce, A. M. Orengo, B. Azzarone和S. Ferrini，“IL-15的免疫治疗应用”，免疫疗法，第4卷，第4期。9，第957-969页，2012。浏览：出版商的网站|谷歌学者
32. G. F. Torelli, C. Rozera, L. Santodonato等，“一种用于临床的体外扩展自然杀伤细胞的良好制造实践方法，”输血，第13卷，第3期，第464-471页，2015年。浏览：出版商的网站|谷歌学者

版权

版权所有©2018 Sellamuthu Subbanna Gounder et al。这是一篇发布在知识共享署名许可协议，允许在任何媒介中不受限制地使用、分发和复制，前提是原作被正确引用。