1。介绍
自然杀伤(NK)细胞被认为是主要的防御淋巴细胞对病毒感染和病毒转化细胞。防御系统的覆盖范围已经扩大到包括抗菌反应(
1,
2),消除衰老细胞(
3),解决炎症(
4,
5],感应过继免疫反应(
6,
7]。这些潜在的NK细胞被认为是CD56阳性和CD3消极,他们位于我们大部分的器官和组织,特别是外周血、皮肤、淋巴结、骨髓、胸腺、肝脏、肠、肺、子宫、等等。NK细胞分为两个不同的种群基于CD56的表面密度表达式,即CD56明亮的和CD56昏暗的NK细胞;他们都有独特的功能特性(
8]。简单地说,CD56明亮的NK细胞代表最小(10%)循环系统和人口较低或没有细胞毒性反应。然而,这NK细胞子集产生一系列细胞因子和趋化因子影响免疫调节,因此这些细胞通常被称为“细胞因子生产商。“相比之下,CD56昏暗的NK细胞主要(90%)在循环系统,是自然和锁定细胞毒性的有效介质(
9,
10]。NK细胞和NK的绝对数量明亮的:NK昏暗的比受损老化,原因可能是老年人更容易一些疾病,感染和癌症。
生理衰老是一个进化守恒的过程与有缺陷的或受损的免疫细胞的功能,包括NK细胞。NK细胞的受损的功能被称为NK细胞免疫衰老。与年龄有关的NK细胞免疫衰老导致病毒感染和癌症诱导的高发病率。同时,NK细胞消除在衰老和衰老细胞下降导致衰老细胞组织或器官的积累会损害组织内稳态和它们的功能。NK细胞消除衰老细胞直接消除(迁移、识别、绑定和消除他们的目标)过程是通过NK昏暗的通过颗粒胞外分泌细胞通路(
3]。然而,最近发现推测在老化穿孔素和迁移能力的表达式模式NK的下降昏暗的细胞,它们直接影响着对衰老细胞NK细胞介导细胞溶解。与NK昏暗的细胞总数、表型和NK的函数明亮的细胞减少由于老化,这是归因于可怜的免疫调节,可怜的解决炎症,可怜的诱导适应性免疫。一项研究调查了老化对NK细胞因子生产的影响明亮的细胞和报道,细胞因子(干扰素的生产
γ,MIP-1
α,引发等)显著降低老年NK明亮的比年轻的NK细胞明亮的细胞(
11]。
几项研究表明NK细胞数量和亚种群在不同老化CD56的增加昏暗的人口和CD56的减少明亮的人口(
12- - - - - -
15]。在老年人,NK细胞活性下降已被证明是与许多疾病的发病率和严重程度增加,如冠心病(
16),肝纤维化(
17],传染性疾病和癌症[
18]。因此,积极的NK细胞水平较高的活动是自然健康的前提
19,
20.]。在癌症患者中,我们证明,更多的NK细胞导致更高质量的生活(
21]。NK细胞是重要的先天免疫系统的主机早期防御。他们也有一个独特的函数作为免疫调节细胞因子的主要来源,他们部分调节monokine生产。为了做到这一点,在目前的研究中,我们直接NK细胞的绝对数量和子集相比在不同年龄的男性和女性数量并检查各个年龄组的NK细胞扩张潜力良好定义的协议。
2。材料和方法
2.1。PBMC隔离和量化
外周血获得40捐赠者来自不同年龄组(41到80岁),在没有重大医疗疾病或癌症病史。所有登记捐助者签署知情同意表格经医学研究伦理委员会批准,马来西亚大学医学中心,马来西亚。NK cell-containing外周血单核细胞(PBMCs)被孤立lymphoprep (Axis-Shield诊断有限公司,奥斯陆,挪威)密度梯度介质。孤立PBMCs免费洗两次与镁和钙磷酸盐缓冲盐水(PBS)。PBMCs数在一个自动细胞计数(美国Nexcelom生物科学)。
2.2。NK细胞体外<斜体> < /斜体>扩张
孤立PBMCs终于resuspended NK细胞扩张媒体包含10%自体血浆和700国际单位/毫升- 2。暂停PBMCs被播种密度1×106/毫升/我们早些时候描述的协议
22]。
2.3。流式细胞术分析
流式细胞术分析进行描述和量化外周血NK细胞群和培养细胞使用特定抗体尤其是CD56-PE和NK CD3-PC5(美国贝克曼库尔特公司)。染色是按照制造商的指令执行。染色细胞被洗和resuspended PBS和分析流式细胞术(FC 500年,贝克曼库尔特公司,美国)。获得的数据进行了分析使用级软件提供的制造商。
2.4。统计分析
每组数据都表达了平均值和标准误差(SE)至少三个独立实验的进行。统计比较使用学生的组织进行了分析
t以及。的值
#
,
@
,
∗
P
<
0.05
被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。老化对淋巴细胞计数的影响
研究人群包括40个人(
n
=
20.
男性和
n
=
20.
女性)被隔离分成四组,每组包含5男性和5女性;组1(每周岁),组2(51-60岁),组3(61 - 70年),和组4(71 - 80年)。绝对淋巴细胞数在不同年龄组使用一个自动分析器执行和结果表明,平均淋巴细胞计数明显降低老化(图
1(一))。PB的淋巴细胞的平均数量每升3.12×1090.25±2.8×1090.13±2.6×109±0.08和2.4×10951-60±0.09岁的每周,61 - 70,和71 - 80岁,分别。相比男性,淋巴细胞数显著降低在所有年龄组女性(图
1 (b))。这些结果表明,女性非常容易受到疾病和陪伴比男性更快衰老。
淋巴细胞总数是由一个自动分析器。(a)在老化,无论男女,淋巴细胞计数显著下降。(b)然而,淋巴细胞计数低很多的女性相比,在几乎所有不同年龄的男性性别。
P
>
0.05
。&之间的年龄群体。
∗
在同样的年龄段。#男性相比年龄每周。@女性相比年龄每周。
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3.2。人口老龄化对NK细胞的影响
的百分比的外周血NK细胞进行了分析每个年龄组。CD56的平均百分比+对老化NK细胞明显增加。的表达模式CD56(每周岁)分别为7.3±1.5%,9.6±1.8%(51-60岁),10.8±2.3%(61 - 70年),和14.7±3.0%(71 - 80年)(图
2(一个))。在50岁后,CD56+NK细胞数量显著减少在相对应的女性比男性性别(图
2 (b))。接下来,我们分析了NK细胞CD56的子集+NK昏暗的和CD56+NK明亮的在不同的年龄群体。有一个显著的变化观察CD56的表达模式+NK昏暗的和CD56+NK明亮的在所有年龄组。然而,CD56成熟+NK昏暗的细胞群主要出现在所有年龄组,,非常小的或不成熟的CD56的微不足道+NK明亮的细胞群被发现在所有年龄组(图
2 (c))。这些信息表明,增加成熟的NK细胞(CD56人口+NK明亮的)在人口老龄化可能导致长期积累的NK细胞或消除increased-senescence细胞的受损的常规过程。
NK细胞群被流式细胞术量化。(一)NK细胞群在两性衰老顺序增加。(b)然而,NK细胞人口大减,在几乎所有的女性不同年龄分的价格相比男性性别。(c)流式细胞仪的图像CD56-positive NK细胞群在不同的年龄点。
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>
0.05
。
∗
年龄组之间,而相应的每周年龄组。#男性相比年龄每周。
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3.3。老化对NK细胞扩张
平均或多或少类似数量的PBMCs来自不同年龄组被播种在0天,然后与NK细胞被允许生长14天特异性培养基。14天之后,用台盼蓝排斥法执行。NK细胞成功种植在所有年龄组,纯度90%以上。对NK细胞折叠不同年龄组之间变化,经过14天的文化、NK细胞褶皱变化显著减少在衰老在男性和女性性别(图
3(一个))。流式细胞仪分析显示,大部分的NK细胞CD56复制+NK明亮的细胞在所有年龄组,而CD56的最小数量+NK昏暗的细胞被观察到在所有年龄组(图
3 (b))。这些结果表明,CD56+NK明亮的细胞也同样表现在所有年龄组即使NK细胞褶皱变化不同年龄组之间显著减少在衰老的雄性和雌性。
NK细胞生长及其子集被流式细胞术分析。(a)所有年龄组的NK细胞明显划分和制造几乎90%以上纯度。细胞褶皱显著增加在所有年龄组男女双方经过14天的文化。与老龄化相比,NK细胞生长在老年人明显低于年轻人。14天培养CD56 (b)流式细胞术分析明亮的和CD56昏暗的NK细胞亚群在不同年龄设置。
P
>
0.05
。
∗
在培养前后NK细胞之间。#之间的年龄群体。
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4所示。讨论
操作更主要的老化与更新的方法和策略。最明显的修改是放松管制的免疫功能有助于老年人易受感染的增加人
19]。研究表明,低数量的NK细胞有关老年人的高死亡率的风险与个体相比有更高的NK细胞数量(
23]。此外,显著降低细胞毒性细胞指出隔绝老年捐助者(
24]。另一方面,有研究报道,NK细胞产生更好的细胞毒性在个人健康老化
25,
26]。我们的数据表明,外周血淋巴细胞总数下降与年龄。Chidrawar等人也被证明是淋巴细胞在衰老的衰落(
27]。相反,总淋巴细胞计数在男性比女性高。酒精的摄入量、吸烟和压力水平高与淋巴细胞计数在男性
28]。
研究结果表明,CD56的数量明亮的NK细胞会随着年龄的增长而减少,这可能会有一个很大的命题NK细胞功能的老年人(
27]。我们的数据也与早期的研究一致表明,CD56的水平明亮的NK细胞和CD56相比,所有四组低昏暗的。总NK细胞随着年龄的人口高;然而,与年龄相关的增加可能是一个长期积累NK细胞在老年人
29日]。溶解能力较低,尽管大量的NK细胞出现在一个上了年纪的人群
24]。
在这项研究中,我们使用了优化协议产生大量的激活NK细胞从不同年龄人群的健康的捐赠者。临床使用的门- 2在NK细胞发展中扮演重要角色,激活和扩张
30.,
31日]。在2的存在,我们获得最佳折叠扩张从60 - 100倍和NK细胞主要是由CD56的扩大明亮的负责人口先天免疫反应和细胞因子的生产(
27,
32]。然而,老年人口群体细胞没有14天内达到100倍。不成熟的CD56的数量少明亮的细胞可能会推迟褶皱的变化在一个上了年纪的人群
24]。
在我们的研究中,我们已经表明,淋巴细胞和CD56的数量明亮的NK细胞CD56的随着年龄的增长而下降昏暗的NK细胞增加。然而,在
在体外激活- 2、CD56的表达式明亮的细胞高和褶皱的变化增加了。总的来说,我们优化协议设法扩大CD56的数量明亮的NK细胞。然而,需要进行更复杂的方法来评估这些变体NK细胞的细胞毒性活动人群。