Staurosporine诱导非小细胞肺癌A549细胞中多倍体巨型癌细胞的产生

抽象的

在staurosporine (SSP)存在下培养A549非小细胞肺癌(NSCLC)细胞，可导致浓度依赖的增殖减少或缺乏。这种增殖抑制伴随着多倍体巨细胞(PGCCs)的产生，其特征是通过结晶紫染色、BrdU和DiI标记、流式细胞术和视频延时分析确定的细胞扁平化、细胞大小增加、多倍体和多核。持续SSP处理A549细胞可使PGCCs保持静息状态至少2个月。去除SSP后，A549 PGCCs重新开始分裂，并表现出与PGCCs原来源细胞难以区分的增殖模式和细胞形态。因此，ssp处理的A549细胞为PGCCs的可逆生成及其后续实验分析提供了一个简单可靠的实验模型。

1.介绍

肿瘤细胞通常会获得对侮辱的抵抗力，否则会干扰这些细胞的增殖和或生存潜力。例如，通过表达多药耐药泵或降低循环率，可以产生对抗增殖治疗的耐药性。特别是肿瘤干细胞具有长期自我更新、增殖率低、抗肿瘤药物和辐射能力强等特点[1，2］．导致增殖率降低的另一种有趣的可能性是发生可逆肿瘤细胞衰老或多倍体巨型癌细胞（PGCC）的产生。这种特征在于多核和细胞周期骤停的细胞在几乎三十年前首先表现为首先表征[3.，4］．就像肿瘤干细胞的情况一样，这些细胞对干扰肿瘤细胞增殖的药物(如破坏dna的药物)具有耐药性。此外，PGCCs已被证明具有干细胞样的特性，因为它们在体外形成球状体，并在小鼠体内产生肿瘤[5，6］．最近，也有研究表明PGCCs可以作为卵裂球样干细胞[7］．因此，PGCC可能在肿瘤异质性，茎和抵抗中起到基本作用[6］．

PGCC和衰老细胞之间的关系仍然是一个讨论问题，因此也缺少标准化的命名。PGCC被描述为不可逆地在G0 / G1或G2 / M状态下不可逆转地被捕的流动性肿瘤细胞β牛乳糖活动(8，9］．相反，由于缺乏，PGCC也表征了不是衰老β牛乳糖染色(10］．此外，被描述为处于“假衰老”状态的癌细胞亚群具有重启增殖的潜力，因此能够反复引发癌症[11］．

据我们所知，描述高产PGCCS的易于处理协议的数量受到限制。已经报道了作为培养的卵巢癌细胞系以及原发癌症中的少量群体存在的PGCC的富集。Cocl.₂治疗这种培养物，这种培养物模仿缺氧条件，导致正常癌细胞的死亡，而巨型细胞仍然活着[10］．在结肠癌细胞中，Cocl₂治疗导致产生具有干细胞特征的PGCCs [12］．

小激酶抑制剂staurosporine (SSP)是一种来自细菌的生物碱Streptomyces Stauroporeus.．由于其广泛的抑制剖面，分子不是临床兴趣[13］．在详细的研究中，已显示SSP与代表人类Kinome的大多数激酶相互作用[14］．在细胞水平上，SSP以多方面的方式干扰细胞迁移，增殖，分化和生存[15，16］．此外，我们最近显示SSP将小细胞肺癌细胞的转化为含有神经元的过程造成表型[17]，由此具有较高的底物特异性的不同SSP类似物更受SSP诱导效果的广泛模式[18］．

在这里，我们描述了用SSP持续治疗提供了一个简单的程序来生成和维持大量可逆生长阻滞的PGCC非小细胞肺癌(NSCLC) A549细胞。

2。材料和方法

2.1。细胞系和培养条件

NSCLC A549细胞在DMEM 10%胎牛血清(FCS)中维持。

2.2。细胞增殖和活力测定

结晶紫法和LDH法测定细胞活力和增殖能力:结晶紫法将细胞接种于96孔板，在正常培养基中培养过夜，然后在不含或含实验化合物的含1% FCS的DMEM中进一步培养。用甲醛固定细胞，用0.05%结晶紫染色1 h，水洗，风干。150年μ每孔加入L甲醇，测量540nm处的光密度。如前所述，通过从Roche的“LDH细胞毒性测定试剂盒”进行了LDH测定[19］．

2.3。BrdU标记

溴脱氧尿苷(BrdU)标记，贴壁A549细胞与10μM Brdu（Sigma）在DMEM 10％FCS在CO中的37°C下4小时₂孵化器。然后用磷酸盐缓冲的盐水（PBS）洗涤细胞三次，并在室温下（RT）在含有4％甲醛的PBS中固定10分钟。将细胞在PBS中洗涤两次，并在4N HCl中孵育在室温下含有1％Triton X-100的10分钟。用PBS洗涤后，将细胞用2％牛血清白蛋白（BSA）封闭10分钟。然后将细胞与在PBS中稀释的抗Brdu抗体（Sigma）孵育，在室温下稀释30分钟，用PBS洗涤，用抗小鼠IgG-Cy3（Sigma）在室温下在黑暗中孵育30分钟，洗涤再次，并嵌入用于荧光显微镜分析。

2.4。DII标签

用于用vybrant DII（Thermo Fisher），悬浮液A549细胞（1×10⁶在无血清DMEM中每5ml细胞)与DiI孵育，最终浓度为10μ在37°C下保温30分钟。然后细胞在DMEM中洗涤三次，最后在DMEM 10% FCS中接种到培养皿中，并在使用化合物前过夜。

2.5。流动细胞术分析

在BD FACSCanto II仪器上进行流式细胞术，使用FlowJo软件分析数据。如前所述分析细胞周期状态[17，18］．简单地说，将A549细胞胰酶化，在PBS中收集，按照BD BrdU Flow试剂盒制造商的说明进行固定和渗透，与抗人Ki67 FITC结合抗体(BD Pharmingen)孵育，并用DAPI进行反染色以排除碎片和坏死细胞。

2.6。视频时间流逝分析

将细胞置于24孔板上过夜。延时分析前1小时，加入SSP至最终浓度为50 nM，分析如下所述[20.］．简而言之，将板转移到加热（37℃），加热（5％CO₂/air)，加湿器安装在倒置显微镜(徕卡DM ire2hc Fluo)上，带有电动交叉工作台。每10分钟记录一次图像，持续24小时。

2.7。细胞尺寸分析

A549细胞在DMEM 10% (FCS)中培养，在50 nM SSP存在或不存在的情况下。取显微照片，用ImageJ (http://www.imagescience.org/）.

结果

３．１．Staurosporine抑制A549细胞增殖

A549细胞在不同浓度的staurosporine存在下培养1 ~ 6天，其增殖活性呈浓度依赖性下降。不同批次的A549细胞对SSP诱导的生长抑制的敏感性不同，但一般情况下，在50 nM的SSP存在下，可以观察到几乎完全的抑制。典型实验如图所示1，将细胞孵育长达6天。如在这种类型的实验中，没有进行培养基的变化;当存在较低或低SSP浓度时，增殖率在较长的时间内较长时间减少。为了排除显性性细胞毒性效应，进行乳酸氢氢酶（LDH）测定。当细胞接受高达200nm SSP的24小时时，未观察到细胞毒性效应。

３．２．Staurosporine诱导PGCC形成

为了分析形态学变化，首先在低密度下播种A549细胞，并在没有或存在50 nM SSP的情况下培养21天。显微镜分析显示，在无SSP的情况下，肿瘤细胞持续增殖，4天后形成大片的融合细胞层岛。未处理的A549细胞，平均直径约为45μM作为分离细胞呈现出圆形到球状的形状和题联的小过程（图2（a））.与此相反，ssp处理的A549细胞在药物添加2小时后已经表现出相当程度的细胞平坦。细胞表面积的增加在前两天更为明显，但持续到21天(最新分析的时间点，图)2（b））.与未处理的细胞相比，表现出至少三倍较大直径的细胞被定义为PGCC。根据该标准，在SSP治疗2天后，50％A549细胞可以被指定为PGCC，并且经过更长的治疗，即8,14和21天，几乎无例外，100％的A549细胞可以被指定为pgccs。在SSP处理21天后，A549细胞显示平均直径230 μm，约为未处理细胞平均直径的5倍2（b））.偶尔也有直径在400到500以上的细胞μ米被观察到。在这种细胞群中，几乎不存在细胞分裂，例如通过视频时间渗透分析尤其揭示。

为了进一步强调没有细胞分裂，A549细胞用DII标记（图3.或者brdu（图4）.在未治疗的细胞中，由于大量细胞增殖导致培养时间在单细胞中减少DII标记，而在非促进的SSP处理的PGCC（图中，它变得更加保守（图3.）.必须注意的是，标签随着培养时间而变得均匀地分布，其具有独立于治疗的现象。此外，Brdu的标记实验显示SSP处理A549细胞中几乎消除的增殖（图4）.在视频时间流逝分析中也可以记录在SSP处理时不存在增殖和快速产生的扁平PGCC。我们也试图验证β-半乳糖苷酶的活性，但只能检测到残留的活性，在显微照片上不能明显显示。

3.3。SSP诱导多倍体和多核A549细胞的形成

为了进一步分析SSP处理的A549细胞的生长特征，我们进行了FACS分析（图5）.当A549细胞血清饥饿32小时时，与在10％FCS存在下培养的细胞相比，观察到G0 / G1相中的预期累积（图5(一个)和5 (b)）.使用50nm SSP处理32小时32小时的A549细胞导致G2 / M相中累积细胞（图5(一个)和5 (b))，膜联蛋白V染色未见细胞凋亡迹象(未示)。主要的是，经50 nM SSP处理的细胞的FACS图谱提示了多倍体效应的存在，图谱向右半部分的显著位移表明了这一点(图)5(一个)和5 (b)）.dapi染色A549细胞的显微照片显示，在ssp处理的细胞中存在大量的多核PGCCs，而在未处理的培养中没有(图)5 (c))，多核PGCCs在较长培养时间后变得更加明显。

3.4。SSP诱导的PGCC A549细胞增殖抑制是可逆的

已用SSP治疗的A549细胞并在SSP去除后重新启动PGCC以增殖。然而，动力学依赖于常温孵育的持续时间。在已用SSP治疗的A549细胞中24小时，在随后的48小时内重新启动（图6(一)）.相反，在含SSP培养基中培养3周的A549细胞，在去除SSP后2 - 3周开始深度增殖，通常可以看到快速增殖的细胞克隆，位于一层仍然部分扁平的细胞(图)6(一)和6 (b)）.然而，详细的视频延时分析显示，部分细胞(≤3%)在去除SSP 48小时后已经开始分裂。

4.讨论

在过去几年中，PGCC在肿瘤的形成和进展期间涉及基本过程。因此，似乎必须在癌症生物学和治疗的不同方面提高癌细胞的亚群。对于这样的目的，需要简单的模型系统，以允许对这种细胞进行详细研究。在本研究中，我们已经证明SSP处理的A549细胞可以作为这样的模型系统。由于SSP治疗的A549 PGCC可以转培养并保持其PGCC表型，如果需要通过实验原因造成的平板的井状格式，可以容易地处理它们。此外，SSP的耗尽允许在另一种连续添加SSP时再次转化为PGCC的分隔细胞的再生。

我们的研究不允许在SSP耗尽时识别PGCC如何重新获得PGCC的精确机制，并且如果所有PGCC都能这样做。A549细胞含有侧面群，其包含具有干细胞性质的总细胞群的24％[21］．当该亚贫化过表达ABC转运蛋白时，可以在与非扫描群A549细胞相比，这些细胞在其响应中提出的响应不同。对于PGCC，已经提出了不寻常的不对称细胞分割，从而允许对不同程度的反差化[6，10］．我们观察到FACS分析，在SSP耗尽培养物的A549细胞中，多倍体量减少，但仍有待阐明的潜在细胞机制。如果在去蚀剂化异质细胞亚克酮期间，评估在治疗相关性质的异质细胞亚克酮，例如对药物或辐射的敏感性，则评估其有兴趣的兴趣。22］．

在高浓度下，SSP是凋亡的几乎一般的诱导剂，而且无论细胞类型如何都显示出在蛋细胞中的许多器官培养物中以及卵囊中挑选细胞死亡，即使蛋白质合成受到抑制[23］．在较低的浓度下，它会导致细胞周期停滞，通常伴随着细胞状态的改变。这些变化依赖于细胞密度、SSP浓度和SSP应用的动力学。例如，在A549细胞中，已经证明与SSP (i)在1 ~ 100 nM浓度下孵育48 h，可减少增殖细胞周期阻滞在G2/M细胞圆和凋亡的迹象在100 nM SSP [24[浓度为5nm，最多4天的浓度导致G0 / G1中的细胞周期停滞，从而在SSP浓度为10时仅观察到相当大的细胞毒性效应 μm [25］．这些数据可能表明，在不同浓度和不同时间段使用SSP对特定激酶的不同影响[14］．在初步实验中，我们发现，在连续存在的SSP中，一些胶质瘤细胞系分化为PGCC，尽管大多数细胞系仅表达了具有神经沸石的过程的高度分支细胞形态，如先前由我们向SCLC报告的PC12细胞[17，26］．

结论

PGCC是在癌症治疗的背景下解决的相关目标。然而，有条学的再胃部产生和培养这种细胞是有限的。我们在此记录的A549肿瘤细胞系中的SSP介导的PGCC生成呈现了一种简单的方法，其允许以可逆方式快速产生PGCCS，因此允许以各种井格式进行详细分析所需参数。然而，如果这种方法可以转移到来自其他主要人体肿瘤实体的其他细胞系的代表性数量，则仍有待确定。

数据可用性

用于支持本研究发现的数据可由通讯作者要求提供。

的利益冲突

没有利益冲突。

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