胎次依赖性含铁血黄素和脂褐素在生殖衰老小鼠卵巢中的积累

摘要

卵巢卵泡池的逐渐衰退导致生殖老化。后者还伴有与年龄有关的疾病，包括各种类型的癌症。事实上，卵巢癌(OC)的最高发病率发生在绝经后，而OC的风险明显受到先前生育时期的胎次记录的调节。我们在C57BL/6小鼠模型中探讨了年龄平价关系，并在此通过常规组织化学方法和自体荧光描述了生殖衰老小鼠卵巢中存在的非血红素铁(含铁血黄素)和“年龄色素”脂褐素的沉积。此外，8-OHdG加合物在卵巢基因组DNA中进行了鉴定。处女卵巢含铁血黄素和脂褐素明显高于经多囊卵巢。8-OHdG也观察到同样的模式。我们的结论是，在小鼠卵巢中，零脂诱导铁和脂褐素的长期积累，并伴随对DNA的氧化损伤。由于脂褐质是一个被广泛接受的衰老标记和考虑到最近提出的角色lipofuscin-associated铁的活性氧(ROS)在衰老细胞,这些研究表明,一个可能的致病机制未产妇有助于增加绝经后卵巢OC风险。

1.介绍

衰老的特征是组织和细胞的累积损伤，破坏体内平衡，增加疾病的风险。氧化应激失调伴随抗氧化防御功能低下是这种损伤的主要特征[1］．在哺乳动物卵巢中，这种与年龄相关的氧化还原失衡伴随着卵泡-卵母细胞储备的数量和质量的急剧下降。这一过程在女性更年期达到顶峰，这是一种生殖标志，其特征是主要的全身内分泌、代谢和炎症改变，这共同导致包括各种类型癌症在内的慢性疾病的更高风险[2］．

关于卵巢癌(OC)，死亡率和发病率在绝经后早期显著增加。此外，OC风险受前生育期生育史的影响，包括口服避孕药的使用和胎次记录。多奇偶性降低而零奇偶性增加OC风险[3.］．这一流行病学证据的基础可能是孕酮的肿瘤抑制效应和/或不同程度的排卵撕裂和卵巢表面上皮(OSE)修复应激，卵巢表面上皮是OC的候选细胞类型之一[4］．

哺乳动物生育后卵巢的年龄相关变化包括各种生化和形态变化，包括类固醇生成能力受限[5- - - - - -7，抗氧化基因表达减少，同时氧化损伤增加[8]，促性腺激素和类固醇激素受体残留表达[9，10以及间质纤维化、血管重塑、OSE内陷和上皮包涵囊肿增多[11］．与本研究相关的是，非血红素铁和“年龄色素”脂褐素也被报道在老年小鼠卵巢中[12，13］．然而，迄今为止，上述与年龄相关的变化都与奇偶历史无关。在目前的工作中，我们扩展了之前的一项研究，对绝经后早期(20个月大)的雌性C57BL/6小鼠进行了研究，这些小鼠在未产和经产方案中均得到了维持[14］．下面详细显示的结果表明，与OC风险增加相关的无氧状态促进了铁(含铁血黄素)和脂褐素沉积的积累，并伴随有氧化性DNA损伤。我们讨论了这种胎次依赖现象可能在育龄期开始的可能机制，以及它如何与生育后年龄OC发病机制有关。

2.材料和方法

2．1．动物及样本收集

雌性C57BL/6小鼠按照智利大学医学院生物伦理委员会之前批准的编号0536的方案进行处理。最近已详细描述了对处子和经产两个实验组的护理和监测[14］．在如下所示的年龄，对一组动物实施安乐死以收集卵巢进行组织化学和自体荧光研究，对另一组动物实施安乐死以提取卵巢DNA并随后进行8-羟基-d-鸟苷(8-OHdG)检测。多胎动物至少有2窝(范围2 - 7)。经胎组平均仔数为3.8窝。

2．2.组织化学方法

解剖卵巢( 维珍; 多产的;平均年龄20.5±1.7个月)在1%对甲醛中固定，室温下pH 7.2 8小时，石蜡包埋。只要有可能，应包括输卵管和子宫角的远端部分。根据组织样本大小，3 ~ 6个切片，5μM厚度的，放在一个单一的载玻片。在组织化学染色之前，切片用二甲苯去脂，用浓度降低的乙醇溶液(95-70-50%)再水合，然后用蒸馏水去离子水。按常规进行苏木精-伊红(HE)染色。Perls染色测定含铁血黄素(非血红素铁)，方法是将切片置于新鲜配制的2.5%亚铁氰化钾和2.5%盐酸溶液中孵育30分钟。用蒸馏水短暂洗净后，用0.1%藏红花素复染溶液浸泡10秒。为了演示I型胶原纤维,货车Gieson方法是由第一个染色细胞核5分钟Weigert刚做好的0.5%的铁苏木精解,然后水冲洗5分钟,孵化与朱红色年代0.1%和0.02%醋酸溶液饱和苦味酸5分钟。用HE、Perls和van Gieson染色的切片在浓度增加的乙醇溶液中脱水，然后二甲苯孵育，并安装在Entellan®(Merck, Germany)中。亲脂苏丹黑B (SBB)染色显示脂褐素的存在。这是在脱水至70%乙醇的载玻片中进行的。在80%乙醇中制备饱和~1%的SBB新鲜溶液，搅拌2小时，纸张过滤。 Sections were incubated with this solution for 5 min and sequentially washed in 70% and 50% ethanol and distilled water. Safranin counterstain was applied for 5 min. Slides were mounted in glycerin and immediately imaged. All staining protocols were performed at room temperature.

2．3.自发荧光

组织切片经脱脂、再水合和风干后在ScanArray Lite荧光扫描仪(Perkin Elmer, USA)中分析，激发波长为543 nm，分辨率为5μM和35-50%的激光功率。使用ScanArray Express软件(Perkin Elmer, USA)捕获TIFF图像并使用伪彩色(彩虹调色板)。

2．4．DNA分离和8-OHdG免疫斑点杂交

卵巢标本一旦解剖，立即用QIAshredder微离心柱(QIAGEN，美国)均质。根据制造商的说明，用AllPrep试剂盒(QIAGEN, USA)提取匀浆。将RNA和蛋白质片段保存并冷冻以供进一步分析。dna在260 nm处用Epoch分光光度计(Biotex, USA)进行定量。免疫斑点杂交试验是基于Shi等人[15将100 ng基因组DNA在95°下变性5分钟，冷藏，沉积在Amersham Hybond-N+尼龙膜上(GE Healthcare, UK)。dna在UVC交联剂中共价连接30秒(Hoefer Scientific, USA)。然后在封闭试剂(Cod NIP552 GE Healthcare, UK;(4% PBS)，室温摇匀1小时。将8-OHdG (15A3)单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology, USA)在PBS中以1:10 00稀释，在4°C条件下应用于膜上16-18小时。PBS冲洗5次，每次3分钟，用PBS 1:2稀释RTU Vectastain Universal试剂盒(Vector Laboratories, USA)的过氧化物酶偶联抗小鼠IgG/抗兔IgG生物素化二抗，室温下加入膜中45分钟。此外，在PBS中洗涤5次，每次3分钟，并应用上述ABC试剂盒的Streptavidin试剂30分钟。最后,200年μL的1:2缓冲稀释SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate (Thermo Scientific, USA)，在室温下遮光孵育5min，检测点印迹信号。通过Image Studio Digits v3.1软件(LI-COR，美国)操作的C-DiGit®印迹扫描仪对膜进行扫描。该软件直接量化了化学发光信号的强度。卵巢基因组DNA从一个年轻的(3个月大)老鼠氧化的方法在体外以芬顿反应混合物作为阳性对照。PBS作为阴性对照。

2．5．图像分析及统计

使用ImageJ1软件分析自动荧光和组织化学TIFF图像[16］．简单地说，以HE染色为指导，OSE所描绘的整个卵巢区域被标记徒手画的关键。然后将图像转换为灰度(RGB stack)，并根据其直方图为每一幅图像设置与原始阳性染色一致的灰度阈值。在红色通道中进行了自荧光、Perls和SBB定量。自动荧光图像之前与反函数。得到了正信号的面积测量功能和表达为最初定义的卵巢总面积的百分比。采用GraphPad Prism 5.0软件，采用非参数Mann-Whitney检验处理不同染色方法、自体荧光和点印迹试验之间具有统计学意义的差异 ．结果用平均值±平均值的标准误差绘制。

3.结果与讨论

3．1.老年C57BL/6卵巢中的含铁血黄素

微量铁对p450细胞色素和FeS中心含有卵巢的酶活性是必要的，主要是卵泡类固醇的合成。铁代谢改变与多囊卵巢综合征有关[17]、人类卵巢子宫内膜异位症囊肿[18和其他不太常见的卵巢疾病。据报道，年老老鼠的卵巢会积聚非血红素铁[12，但迄今为止的文献中并没有提及同等值史的联系。数据1(一)和1 (b)显示20.6个月大的处女卵巢HE染色，扩大的球形细胞显示棕黄色胞浆颗粒，符合细胞内含铁血黄素沉积的典型描述。与12个月(52周)龄C57BL/6的卵巢观察结果一致[12]、22月龄CD1小鼠和14-17月龄CB6F1小鼠[19，这些增大的细胞可能是泡沫状的多核巨噬细胞，被扁平的成纤维细胞包围。经典的波尔斯普鲁士蓝(以下简称波尔斯)方法如图所示1 (c)和1 (d)通过扩大对卵巢更大区域的敏感性，增强了对铁的检测，尽管图中并非每个扩大的巨噬细胞簇1 (b)图1 (d)．这种模式表明，铁的摄取和积累可能是选择性的某些亚群的卵巢巨噬细胞。图中可见明显的波尔斯染色细胞1 (d)可能对应于含铁血黄素的巨噬细胞(HLM)，在其他组织中主要是由红细胞(RBC)吞噬形成的[20.］．虽然小鼠卵巢中需要红细胞清除的事件还没有系统的研究，但排卵后的微出血在此之前黄体(CL)由卵泡残留物形成，有时称为集团u年代hemorrhagicum——可能是从红细胞中获取铁的来源，在终生排卵后，红细胞会随着年龄的增长以HLM的形式积累。另一种可能的含铁血黄素来源是老年卵巢渗透性血管中红细胞的渗漏。确实，绝经后人类卵巢的血管变化已经被描述[11］．就女性而言，子宫内膜异位症可能是卵巢中红细胞铁的来源，并与透明细胞和子宫内膜样上皮性OC的风险增加有关[21］．

在本研究中观察到的一种卵巢含铁血黄素沉积的变异模式弥漫性较低，即局限于具有更强Perls信号的巨噬细胞簇，通常见于卵巢皮质(未显示)。更重要的是，与经多囊卵巢相比，老年处女(未生育)卵巢的信号强度、延伸和含铁血黄素沉积的数量更高。为了准确量化观察结果，测量两种情况的卵巢中perls阳性信号面积占卵巢总面积的百分比(见材料和方法)。数字2(一个)结果显示未产卵巢中含铁血黄素含量明显高于经产卵巢。“无生育权”的意思是在生殖生命上没有CL拯救。事实上，在非生育周期中，C-C基基配体2 (CCL2)细胞因子刺激巨噬细胞浸润，促进CL回归，黄体细胞失去孕酮和黄体营养前列腺素- e合成[22］．因此，假设在衰老过程中卵巢铁是排卵后出血的红细胞来源，经产卵巢遭受排卵暂停期，在此期间，含铁血黄素中的不溶性铁可能被释放出来，用于合成p450细胞色素酶，支持妊娠期间CL合成孕酮。在这方面，确定整个巨噬细胞浸润是否在不同的研究条件下是有意义的。然而，正如在灵长类动物卵巢中所描述的，其他免疫细胞包括中性粒细胞、自然杀伤细胞、T淋巴细胞和b淋巴细胞参与了黄体溶解[23并最终与HLM相互作用并调节其命运。

3．2．老年C57BL/6卵巢中的脂褐素

脂褐素也被称为蜡质或“年龄色素”，是一种细胞内的、交联的、氧化的异质(蛋白质-脂-碳水化合物和金属痕迹)物质，是由于溶酶体和/或蛋白酶体活性受损而形成的[24］．脂褐素随着年龄增长而增加，被认为是各种组织中衰老细胞的标志[25］．如图所示3.，我们使用自体荧光和SBB染色显示脂褐素在20个月大的>小鼠卵巢中。众所周知，SBB能特异性识别脂褐素，从而检测衰老细胞[26，27］．我们观察到两种方法之间有很好的对应关系，即自体荧光在很大程度上与SBB染色定植。值得注意的是，在输卵管、卵巢韧带或子宫角中未检测到信号，表明脂褐素只在老年小鼠卵巢中积聚(图)3.）.这一发现支持了一种观点，即相对于其他主要器官，卵巢经历了更早的生理衰老[28］．通过图像量化，我们发现处女卵巢的脂褐素水平明显高于经产卵巢(图)2 (b)）.与含铁血黄素相似，脂褐素与奇偶性之间的关系迄今尚未见报道。认为处女卵巢对来自闭锁卵泡和非受精、退行性卵巢的凋亡细胞有不间断和重复的吞噬需求，这听起来是合理的。随着年龄的增长，溶酶体的效率降低，其结果是过量的未完全消化的细胞碎片聚合和氧化。相反，经产小鼠妊娠期间的排卵暂停减少了闭锁和黄体吞噬负荷。此外，由于经胎卵巢的氧化损伤较低(见下文)，溶酶体活性将被保留，脂褐素的形成将被最小化。重要的是，在化学诱导的雌性暂停的B6C3F1品系OC小鼠模型中，双光子激发荧光显微镜和组织化学方法的分析显示卵巢中显著的年龄和疾病依赖的脂褐素含量[13］．此外，脂褐素-被称为ceroids -与二胺联苯胺(DAB-)增强的Perls染色共定位于中年(8个月大)和老龄(12个月大)小鼠卵巢的巨噬细胞[12，证实了巨噬细胞在铁和脂褐素年龄依赖性储存中的额外作用，而不是参与卵泡发生、排卵、黄体动态和血管完整性[29，30.］．考虑到与Asano灌注、dab增强手术相比，本研究中使用的常规Perls方法的灵敏度有限[12，我们无法在我们的样本中精确地确定含铁血黄素-脂褐素共定位。因此，不同卵巢巨噬细胞亚群的复杂分布模式[31]，以及相对于年龄的未被改变的年龄依赖部分[19提示其含铁血黄素和脂褐素的储存能力可能不同。

3．3.老年卵巢基因组DNA损伤

如上所述，衰老的特征是氧化还原平衡被破坏，这是由于抗氧化防御受损，ROS产生增加，或两者同时发生。我们假设，铁和脂褐素在老年小鼠卵巢的储存有助于基因组DNA的氧化损伤。数字2 (c)结果表明，处女卵巢DNA中8-OHdG水平高于经产卵巢，与含铁血黄素和脂褐素的模式相似。含铁血黄素是一种低可溶性铁蛋白聚合体，主要含有铁，但也含有大量的亚铁[32］．通过芬顿反应，亚铁可以产生高度活性的羟基自由基，对细胞成分造成损害。在哺乳动物的卵巢中，脂质、蛋白质和核酸的氧化损伤主要是由于卵巢储备逐渐下降而导致的抗氧化防御能力下降，而这是绝经的根本原因[8，33］．正常卵巢衰老过程中氧化还原平衡被破坏的主要决定因素尚未阐明。我们的研究结果表明，铁和脂褐素可能导致老年处女卵巢的氧化应激高于老年经胎小鼠卵巢。在这方面，我们很有兴趣看看各种毒物以及针对卵泡储备的转基因小鼠模型[34]也会引起铁和脂褐素的积累，进一步增加氧化应激。重要的是，随着年龄的增长，卵巢线粒体功能衰退，影响卵母细胞和卵泡的稳态[35，铁相关脂褐素被认为是一种线粒体独立的ROS来源。Höhn等研究表明，合成的脂褐素能够吸收亚铁，该复合物具有蛋白酶体抑制和ros形成能力[36］．此外，这些作者确定脂褐素对铁的吸收在~1.3时是饱和的μ摩尔铁(II)/毫克合成脂褐素，微量化学计量的亚铁离子在活的有机体内将需要产生产生ros的氧化还原活性表面。这一观点与我们的研究中老龄小鼠卵巢中含铁血黄素和脂褐素区域的不同大小是一致的(图)2(一个)和2 (b)）.

4.结论

OC的风险在绝经后增加，并随着产前分娩和口服避孕药的使用而降低。这些生殖行为的特征是全身暴露于孕酮(黄体酮)和排卵周期的减少。在这里，我们显示了血铁血黄素和脂黄素在生育后的小鼠卵巢(>20个月大)的差异积累的证据，根据其以往的胎次史。年老的处女卵巢中这两种色素的含量明显更高，这一发现与DNA氧化损伤水平的增加有关。根据形态学和其他作者的研究，这两种残余物质可能包含在多核放大的巨噬细胞簇中。如果含铁血黄素中的铁被还原为亚铁，亚铁在卵巢间质中扩散并被脂褐素摄取将是内源性ROS的重要来源。含铁血黄素和脂褐素作为胎次和年龄的作用在卵巢中积累的确切机制值得进一步研究。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

这项工作是由FONDECYT资助的。1130292，智利教育部。作者感谢Daniela Araya在组织学程序方面的帮助，Maria-Julieta González和Carmen Romero在图像捕捉方面的帮助，以及Aldo Solari慷慨赠送的印迹材料。我们非常感谢Manuel Suarez和Carola Perez在动物护理方面的帮助。

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