机场核心计划 分析细胞病理学 2210 - 7185 2210 - 7177 Hindawi 10.1155 / 2018/1289103 1289103 研究文章 Parity-Dependent含铁血黄素和脂褐质积累的繁殖年龄小鼠卵巢 http://orcid.org/0000 - 0003 - 0522 - 5754 Urzua Ulises 查孔 卡洛斯 埃斯皮诺萨 雷纳托 马丁内斯 塞巴斯蒂安。 埃尔南德斯 妮可 Sanchez-Alcazar 何塞。 Laboratorio de Genomica Aplicada Departamento de Oncologia Basica y我们 Facultad药物 智利大学 圣地亚哥 智利 uchile.cl 2018年 15 3 2018年 2018年 07年 11 2017年 08年 01 2018年 15 3 2018年 2018年 版权©2018 Ulises Urzua et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

卵泡池的逐步下降导致生殖老化。后者是伴随着与年龄相关的疾病,包括各种类型的癌症。事实上,卵巢癌的死亡率最高(OC)发生在绝经后期而OC风险显著调制以前肥沃的生活中通过奇偶校验记录。我们走近age-parity关系在C57BL / 6小鼠模型和所描述的存在nonheme铁(含铁血黄素)和存款的“老年斑”脂褐质在繁殖年龄小鼠卵巢通过应用传统的组织化学方法和自体荧光。此外,8-OHdG卵巢基因组DNA加合物是评估。含铁血黄素和脂褐质都明显高于原始而多产的卵巢。同样的模式是8-OHdG观察。我们得出结论,未产妇诱发铁的长期积累和脂褐质伴随DNA的氧化损伤小鼠卵巢。由于脂褐质是一个被广泛接受的衰老标记和考虑到最近提出的角色lipofuscin-associated铁的活性氧(ROS)在衰老细胞,这些研究表明,一个可能的致病机制未产妇有助于增加绝经后卵巢OC风险。

 洋底Nacional de Desarrollo Cientifico y学府 1130292 1。介绍

组织及细胞老化的特征是累积损伤,损害体内平衡,增加疾病的风险。氧化应激与抑郁并发特异表达的抗氧化防御是这种损害的一个主要特征 1]。哺乳动物卵巢,这与年龄相关的氧化还原平衡是平行的陡峭的衰减follicular-oocyte储备的数量和质量。这个过程在更年期女性的高潮,生殖特征表现为重大的系统性内分泌、代谢和炎症改变,导致慢性疾病包括各种类型的癌症的风险更高( 2]。

关于卵巢癌(OC),早期绝经后期死亡率和发病率显著增加。此外,OC风险由生殖历史在调制前的生活包括使用口服避孕药和奇偶校验记录。多胎产减少而未产妇增加OC(风险 3]。流行病学证据的基础将是一个肿瘤suppressor-like孕激素的影响和/或不同程度的排卵的撕裂和修复卵巢表面上皮(OSE)压力,OC的候选细胞类型之一被认为起源于( 4]。

生育年龄相关变化的哺乳动物卵巢组成各种生化和形态学改变包括限制steroidogenic能力( 5- - - - - - 7),降低抗氧化基因表达加上增加氧化损伤( 8),剩余的表达促性腺激素和类固醇激素受体( 9, 10)以及增加基质纤维化,血管重塑,大阪证交所内陷,上皮包涵囊肿( 11]。与本研究相关,nonheme铁和“老年斑”脂褐质在小鼠卵巢(岁也报道 12, 13]。然而,到目前为止,没有上述与年龄相关的变化与平价的历史。在目前的工作中,我们扩展先前的研究在早期绝经后女性C57BL / 6小鼠年龄相当于(20个月大),这是维护在未生育过的,多产的方案 14]。详细结果如下所示表明,未产妇,OC的风险增加相关的条件,促进三价铁的积累(含铁血黄素)和脂褐质存款,随之而来的氧化DNA损伤。我们讨论这parity-dependent现象的可能机制可能发起在肥沃的生活和如何在生育年龄与OC发病机理。

 2。材料和方法 2.1。动物和样品收集

女性C57BL / 6小鼠处理协议下0536号以前生物伦理学委员会批准,智利大学医学院。保健和监测两组实验,维珍和多产的,最近详细描述( 14]。下面的年龄表示,动物的一个子集是安乐死收集卵巢autofluorescent组织化学的研究,和第二个子集是安乐死卵巢DNA的提取和后续8-hydroxy-d-guanosine 8-OHdG化验。多产的动物至少有2窝(范围2 - 7日)。平均数的窝多产的组为3.8。

 2.2。组织化学方法

解剖卵巢( n = 10 维珍; n = 10 多产的;平均年龄为20.5±1.7个月大)固定在1% p-formaldehyde, pH值为7.2 8小时在室温下,嵌入石蜡。只要有可能,输卵管和子宫角的远端部分都包括在内。不同的组织样本大小,3到6部分,5 μ米厚度,被安置在一个幻灯片。组织化学染色前,部分是deparaffinized二甲苯和水化与乙醇解浓度下降(95 - 70 - 50%)蒸馏去离子水紧随其后。Hematoxylin-eosin(他)染色是根据常规协议完成的。波尔斯染色确定含铁血黄素(nonheme三价铁)是由孵化部分刚做好的解决方案的2.5%亚铁氰化钾和2.5%盐酸为30分钟。经过短暂的用蒸馏水,0.1%红色染料复染色的解决方案是申请了10秒。为了演示I型胶原纤维,货车Gieson方法是由第一个染色细胞核5分钟Weigert刚做好的0.5%的铁苏木精解,然后水冲洗5分钟,孵化与朱红色年代0.1%和0.02%醋酸溶液饱和苦味酸5分钟。沾染了他的部分,波尔斯和van Gieson在乙醇脱水方案增加浓度紧随其后的是二甲苯孵化,并安装在Entellan®(默克公司、德国)。亲脂性的苏丹黑B (SBB)染色用于演示的脂褐质。这是在幻灯片进行脱水70%乙醇。新的饱和~ 1% SBB解决方案是准备在80%乙醇,搅拌2小时,过滤。 Sections were incubated with this solution for 5 min and sequentially washed in 70% and 50% ethanol and distilled water. Safranin counterstain was applied for 5 min. Slides were mounted in glycerin and immediately imaged. All staining protocols were performed at room temperature.

 2.3。自发荧光

组织部分deparaffinized,水化,风干在ScanArray Lite荧光扫描仪分析(美国珀金埃尔默)使用543 nm作为激发波长,决议的5 μm和激光功率的35 - 50%。TIFF图像捕获和伪彩色(彩虹调色板)通过使用ScanArray表达软件(美国珀金埃尔默)。

 2.4。DNA隔离和8-OHdG Immunodot-Blot化验

切割后,卵巢样本立即均质QIAshredder微型离心机旋转列(美国试剂盒)。匀浆提取AllPrep工具包(美国试剂盒)制造商的指示。RNA和蛋白质分数保存和冷冻进行进一步分析。dna在260 nm的量化时代分光光度计(美国Biotex)。施immunodot-blot分析基于et al。 15ng)与修改如下:100整除的基因组DNA变性在95°5分钟,在冰冷冻,沉积到Amersham Hybond-N +尼龙膜(英国通用电气医疗集团)。dna共价结合30秒在短波紫外线交联剂(美国Hoefer科学)。膜被孵化在阻塞试剂(鳕鱼NIP552通用电气医疗集团,英国;准备在PBS 4%) 1小时在室温下用颤抖的。单克隆8-OHdG (15 a3)抗体(美国圣克鲁斯生物技术)稀释1:1000年在PBS和应用于膜16小时在4°C。与PBS 5洗后,3分钟,在peroxidase-coupled anti-mouse免疫球蛋白/ anti-rabbit免疫球蛋白生物素化的二次抗体RTU Vectastain普遍,ABC工具包(向量实验室、美国),稀释1:2 PBS和添加到膜在室温下45分钟。进一步在PBS 5洗3分钟,完成,上述ABC工具包的链霉亲和素试剂申请30分钟。最后,200年 μL (1: 2 buffer-diluted SuperSignal西方毫微微化学发光底物(美国热科学)是用于检测孵化的点状信号5分钟在室温下免受光。膜被扫描C-DiGit®污点扫描仪通过数字图像工作室v3.1软件操作(美国LI-COR)。化学发光信号的大小与这个软件直接量化。从一个年轻的卵巢基因组DNA(3个月)鼠标氧化的一个 在体外芬顿反应混合物作为积极的控制。PBS是用作负控制。

 2.5。图像分析和统计

Autofluorescent与ImageJ1组织化学的TIFF图像分析软件( 16]。简单地说,使用他的污点作为指导,整个卵巢区划定的大阪证交所是标明 徒手画的关键。然后图像转换为灰度(RGB堆栈),基于其直方图,灰色的阈值设置为每个单独的图片在一致性与原阳性染色。自体荧光,波尔斯,SBB量化是在红色通道完成。以前的逆转Autofluorescent图像 反函数。领域的积极信号得到的 测量函数和被表示为一个百分比的最初定义的卵巢总面积。统计上显著的差异条件在不同染色方法,自体荧光,点状化验是解决使用非参数Mann-Whitney GraphPad Prism 5.0软件测试 p < 0.05 。结果绘制的平均值±标准错误的意思。

 3所示。结果与讨论 3.1。含铁血黄素在C57BL / 6岁的卵巢

微量铁含量是必要的p450细胞色素和卵巢的菲斯中心含有酶的活动,主要是卵泡类固醇合成。改变铁代谢与多囊性卵巢综合征( 17人类卵巢异位囊肿),( 18),和其他不太常见的卵巢疾病。年老的老鼠卵巢报道积累nonheme铁( 12),但是没有链接到平价历史文献中提出的日期。数据 1(一)和 1 (b)显示了他污点处女卵巢,20.6个月大的时候,放大的球状细胞显示brown-yellowish细胞质颗粒染色匹配的细胞内的含铁血黄素沉积的典型描述。同意观察卵巢的12个月(52周)老C57BL / 6 12),22个月大CD1、14 - 17个月大的老鼠CB6F1 [ 19),这些放大细胞可能是泡沫多核“巨型”巨噬细胞被夷为平地的成纤维细胞所包围。经典的帕尔的普鲁士蓝(以下简称为波尔斯)方法如图 1 (c)和 1 (d)提供了一个增强的三价铁的检测灵敏度扩展到更大的区域的卵巢,虽然并不是每一个扩大巨噬细胞集群在图 1 (b)含有含铁血黄素的图吗 1 (d)。该模式表明,铁吸收和积累可能会选择性地对某些族群卵巢巨噬细胞。帕尔明显染色细胞图所示 1 (d)可能对应于含铁血黄素拉登巨噬细胞(高),在其他组织主要是由红细胞(RBC)吞噬作用的结果 20.]。虽然事件需要红细胞间隙尚未系统研究在老鼠的卵巢,在postovulatory microhemorrhages前 黄体从卵泡remains-sometimes称为(CL)的形成 集团u 年代hemorrhagicum——将铁的来源从红血球,一生排卵后积累的形式随着年龄的问题。另一个可能的含铁血黄素的泄漏源将红细胞渗透在卵巢血管。的确,人类绝经后卵巢血管变化描述( 11]。对于女性,子宫内膜异位可以在卵巢红细胞铁的来源和有关的风险增加发展中透明细胞和endometrioid上皮OC ( 21]。

含铁血黄素C56BL / 6岁的卵巢。他污点(a, b)和帕尔染色(c, d)处女卵巢的20.6个月大。箭在(b)表明brown-yellowish含铁血黄素颗粒。(d)箭头显示含铁血黄素拉登巨噬细胞(高)。酒吧(a)和(c) = 200 μm;酒吧(b)和(d) = 20 μm。

一个变种的卵巢含铁血黄素沉积模式中观察到目前的工作更少的扩散,也就是说,局限于巨噬细胞集群的帕尔强信号,常见的卵巢皮质(没有显示)。更重要的是,信号强度、扩展和含铁血黄素沉积数量高岁处女(未生育过的)相比,在多产的卵巢。准确地量化这一观察,Perls-positive信号区域卵巢总面积的百分比测定卵巢的两个条件(见材料与方法)。图 2(一个)表明nonheme铁(含铁血黄素)数量明显高于未生育过的相比,多产的卵巢。未产妇意味着没有CL在生殖生命救援。事实上,nonfertile周期期间,碳碳图案配体2 (CCL2)细胞因子刺激巨噬细胞渗透促进CL回归与孕激素和催乳prostaglandin-E合成由黄体细胞的损失( 22]。因此,假设postovulatory出血红细胞的起源卵巢铁在老化,多产的卵巢受到排卵的暂停时间中不溶性含铁血黄素可能是铁和用于合成p450细胞色素酶支持CL孕期孕激素合成。在这方面,这将是有趣的来确定整个巨噬细胞浸润不同条件进行了研究。然而,作为灵长类动物卵巢中描述,其他免疫细胞包括中性粒细胞,自然杀伤细胞,T -淋巴细胞参与luteolysis [ 23),最终可能相互作用,调节高级别的命运。

岁Semiquantification含铁血黄素,脂褐质,8-OHdG卵巢。百分比的积极信号领域(一)波尔斯, n = 8 每组(b) SBB, n = 7 每组,相对于卵巢总面积与ImageJ1提取软件。(c) 8-OHdG在孤立的基因组DNA, n = 6 每组;非盟=化学发光测量任意单位与数字图像工作室软件(详情,请参阅材料和方法)。 ∗ ∗ p < 0.005 ,非参数Mann-Whitney测试。

 3.2。脂褐质在C57BL / 6岁的卵巢

也称为ceroid或“老年斑”,脂褐质是一个细胞内,交联,异构(protein-lipid-carbohydrate和金属痕迹)氧化物质形成的溶酶体受损和/或蛋白酶体活性( 24]。脂褐质随着年龄的增加,各组织被认为是衰老细胞的标志( 25]。如图 3,我们使用自体荧光和SBB染色证明脂褐质在小鼠卵巢> 20个月大。SBB是众所周知的具体识别脂褐质从而允许检测衰老细胞( 26, 27]。我们观察到一个好的两种方法之间的对应,也就是说,在很大程度上与自体荧光与SBB污渍。值得注意的是,没有检测到信号在输卵管,卵巢韧带,或子宫角,表明脂褐质积累只在年老的老鼠卵巢(图 3)。这个发现支持这样的看法,即卵巢经历早期生物老化相对于其他主要器官( 28]。图像量化后,我们发现,处女卵巢显示更高水平的脂褐质相对于多产的卵巢(图 2 (b))。类似于含铁血黄素,脂褐质和平价的关系尚未报道。听起来合理认为处女卵巢经验不间断和重复在凋亡细胞吞噬需求来自不通的毛囊和nonfertile回归CL。溶酶体效率降低随着年龄的增长,结果是一个过载半消化状态的细胞碎片,聚合和氧化。相比之下,排卵的暂停在多产的小鼠妊娠期间减少了不通的和黄体吞噬负载。此外,氧化损伤较低的多产的卵巢(见下文),溶酶体活动将被保留和脂褐质形成最小化。重要的是,在一个B6C3F1应变与化学诱导estropause OC小鼠模型,分析了双光子激发荧光显微镜和组织化学方法显示显著的年龄和disease-dependent卵巢(脂褐质含量 13]。此外,lipofuscin-referred ceroid-colocalized diaminobenzidine -帕尔(DAB)增强染色在中年卵形的巨噬细胞(8个月),扩大巨噬细胞的年龄(12个月)小鼠卵巢( 12),确认一个额外的巨噬细胞的作用在铁和脂褐质年龄相关性比参与folliculogenesis存储进一步,排卵,黄体动力学和血管完整性( 29日, 30.]。鉴于灵敏度有限的常规波尔斯方法相比,本研究中使用的模型包括,由浅野DAB-enhanced过程( 12),我们无法确定精确的hemosiderin-lipofuscin colocalization在我们的样本。在这方面,复杂的分布格局不同卵巢巨噬细胞(子集 31日除了他们相对普通的年龄相关性分数相对于年龄( 19)表明,含铁血黄素和脂褐质存储能力可能有所不同。

脂褐质在卵巢C56BL / 6岁。SBB (a)和543 nm绿色激光器自发荧光染色(b) 20.9个月大的处女卵巢。Ut =子宫角;Ovd =输卵管;Ovl =卵巢韧带;Ov =卵巢。酒吧(a)和(b) = 200 μm。图像与彩虹(b)获得了调色板。

 3.3。岁的基因组DNA损伤卵巢

正如上面提到的,老龄化的特点是破坏的氧化还原平衡由于受损的抗氧化剂防御,活性氧产量的增加,或者两者同时进行。我们假设的铁和脂褐质在年老的老鼠卵巢导致基因组DNA的氧化损伤。图 2 (c)表明,DNA的处女卵巢8-OHdG水平高于经产的卵巢,像含铁血黄素的模式和脂褐质。含铁血黄素是一种low-soluble铁蛋白聚合主要含有三价铁,还大量的二价铁( 32]。通过芬顿反应,二价铁能产生高度活性羟基自由基造成损害细胞组件。哺乳动物卵巢,氧化损伤脂质,蛋白质,和核酸主要归因于低迷的抗氧化防御同时进步的卵巢储备下降,更年期的根本原因 8, 33]。这破坏了氧化还原平衡的主要决定因素在正常卵巢老化尚未阐明。我们的研究表明,铁和脂褐质可能导致更高的氧化应激与老年人相比,老年人处女多产的老鼠卵巢。在这方面,这将是有趣的,看看各种毒物代理以及转基因小鼠模型针对毛囊储备( 34)也引起铁和脂褐质积累,进一步增加氧化应激。重要的是,随着卵巢线粒体功能衰减随着年龄的影响卵母细胞和卵泡内稳态 35)、铁相关的脂褐质提出了作为mitochondrial-independent活性氧的来源。霍恩等人表明,合成脂褐质能够吸收二价铁,和这个复杂的蛋白酶体抑制和ROS-forming能力( 36]。此外,这些作者认为铁吸收的脂褐质饱和~ 1.3 μ摩尔菲(II) /毫克的合成脂褐质,少量的化学计量亚铁离子 在活的有机体内需要生成一个ROS-producing redox-active表面。这个想法是一致的含铁血黄素的不同大小和脂褐质地区老年小鼠卵巢的研究(数据 2(一个)和 2 (b))。

 4所示。结论

OC的风险增加在绝经后期和减少平价和口服避孕药使用之前在肥沃的年龄。系统性接触孕酮(黄体酮)和减少这些生殖进行排卵的周期特征。这里我们表明微分积累含铁血黄素和脂褐质在生育小鼠卵巢(> 20个月大)根据其先前的平价的历史。岁virgin-nulliparous-ovaries包含更高数量的两个色素,这一发现与水平的提高氧化DNA损伤。基于形态学和其他作者的研究,这两种剩余物质将会包含在多核巨噬细胞肿大集群。只要三价铁存在于含铁血黄素是简化为二价铁,后者在卵巢基质的扩散和吸收的脂褐质将是一个重要的内源性活性氧的来源。含铁血黄素的确切机制和脂褐质积累卵巢平价和年龄的函数值得进一步研究。

 的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

 确认

这项工作是支持的FONDECYT批准号1130292,从教育部,智利。作者感谢阿瑞亚Daniela帮助组织程序,Maria-Julieta冈萨雷斯和卡门·罗梅罗的帮助与图像捕获、和奥尔多·索拉里吸墨水供应的慷慨的礼物。帮助动物保健曼努埃尔·苏亚雷斯和卡罗拉佩雷斯将非常感谢。

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