一种灵敏快速检测脑组织中甲醛的方法

摘要

现有的检测脑样本中甲醛(FA)的方法价格昂贵，需要复杂的实验程序。在这里,我们建立了一个高度敏感的和有选择性的分光光度法,基于FA与无色反应试剂的反应4-amino-3-penten-2-one (Fluoral-P)生成黄色化合物,3,5-diacetyl-1, 4-dihydrolutidine (DDL),可在室温下的分光光度计检测到420海里。灵敏度响应时间点为1h，最适衍生反应pH为6.0。对FA的检出限(LOD)和定量限(LOQ)均为0.5μM和2.5μM,分别。使用这种方法，在注射了FA的小鼠的大脑和阿尔茨海默病患者的尸检海马组织中检测到异常高水平的FA。这一发现表明，改进的氟- p法可以有效地测量大脑中的FA水平。

1.介绍

甲醛（FA）是一种工业化学产品，广泛用于制造建筑材料和家用产品，并在室内环境中从多种来源释放，如刨花板、家用产品和胶合板[1];因此，大量工人和居民不可避免地接触到FA [2].初步研究表明，气态FA可导致致癌物和胎儿畸形[3.]，临床和流行病学调查发现，与工作有关的FA会导致头痛、焦虑、疲劳、睡眠障碍，特别是认知障碍[4，5］.此外，动物实验的结果一直显示，气态FA暴露会导致异常行为，包括空间记忆缺陷[6- - - - - -8］.

有趣的是，在暴露于外源性脂肪酸的人体内发现了异常水平的内源性脂肪酸[9]，以及老年老鼠和大鼠[10]，在患有认知障碍的健康老年人中[11]，以及患有阿尔茨海默病（AD）的患者[12].文献证据表明，直接侧脑室注射过量FA到动物模型中会导致中枢神经系统损伤，特别是记忆明显受损[13- - - - - -16］.这些数据有力地支持了海马体中过量的FA会导致认知缺陷的观点。

鉴于FA的神经毒性作用，已经开发了各种分析方法来检测动物组织中的FA。最早的测定脑组织中FA的方法（~0.16–0.24 使用气相色谱/质谱（GC-MS）进行分析[17］.另一种灵敏的检测肝脏中FA的方法是利用高效液相色谱和紫外检测器(HPLC-UV) [18，19].最近，使用高效液相色谱和荧光检测器（HPLC-Fluo），我们发现有0.25–0.32 正常成年小鼠和大鼠海马中的mM FA[20.］.虽然这些现有的方法提供了一些准确和超灵敏的检测大脑中的FA的方法，但一些缺点，如费用，复杂的实验程序和有害的分析试剂，限制了它们的实际应用。因此，需要一种简单、灵敏、高效的测定生物样品中痕量FA的方法。

在此,我们报告一个高度敏感的和有选择性的分光光度法检测FA小鼠的大脑中已经建立了在室温下用无色试剂——4-amino-3-penten-2-one (Fluoral-P)有选择地与足总反应生成有色化合物,3,5-diacetyl-1, 4-dihydrolutidine (DDL)。因此，这种改进的氟- p法适用于脑FA的检测和FA的神经毒性评价。

2.材料和方法

2．1.试剂和化学FA溶液

37% (w/v；Sigma-Aldrich，圣路易斯，美国);4-氨基-3-戊二酮(氟-p, CAS: 1118-66-7)http://TCIchemicals.com、日本);盐酸(HCl, 1 N, Sigma-Aldrich，圣路易斯，美国);氢氧化钠(NaOH, 2n, Sigma-Aldrich);二甲基亚砜(DMSO, Sigma-Aldrich，圣路易斯，美国);三氯乙酸(TCA, Sigma-Aldrich，圣路易斯，美国);去离子水(milliq水);磷酸盐缓冲盐水(PBS, 1 mM，北京化工大学，中国);使用生理盐水(NS，北京化工大学)进行试验。

２.２.设备

冰箱(海尔集团，北京，中国);pH计(PHS-3C)，上海仪器电学仪器股份有限公司，中国上海）；可调高速均质器(中国常州良友实验仪器厂FSH-2A);型号ZD2011584来自Millipore (Nepean, Ontario, Canada);SP-Max 2300A多skan光谱微板分光光度计(上海生物科技有限公司闪光光谱);Morris水迷宫(上海生物威尔有限公司，中国，上海)被用于本研究。

２.３.化学溶液的制备

FA原液(100 mM, 12.3 mL):将FA溶液(0.1 mL, 37%)移入12.2 mL的PBS (1mm, pH分别为4.0,5.0,6.0,7.0)。FA工作液为0.001、0.01、0.1、1和10 mM, pH分别为4.0、5.0、6.0和7.0。氟尿嘧啶储存液(500mm): 0.05 g溶于1ml DMSO中，4°C冰箱保存不超过2个月。氟- p工作溶液为0.5、5和50 mM, pH分别为4.0、5.0、6.0和7.0。三氯乙酸(10%,w/v)在PBS (1 mM, pH 6.0)中制备，置于黑暗中。

２.４.脑组织匀浆和提取

Morris水迷宫试验后，用戊巴比妥钠(10 mg/kg，腹腔注射(i.p))麻醉小鼠，颈脱位处死小鼠。立即用医用剪刀取出脑组织，用冰冷的PBS冲洗，然后用0.1 mM的PBS (pH 6.0)均质，脑重量与PBS体积的比例为1:4。将脑匀浆按1:2的体积比加入10%的TCA溶液中。最后，混合物在4°C, 12,000 ×g离心10分钟，上清液在−80°C冷冻，待进一步使用。

2．5．脑FA分析方案

2.5.1。衍生反应的最佳pH和时间

确定的最佳pH值导数在室温下反应Fluoral-P和足总之间,五0.1毫升整除的不同浓度的FA标准解决方案(0.001,0.01,0.1,1和10 mM, pH值为4.0,5.0,6.0,和7.0,分别地)被添加到五瓶为了准备一系列的校准标准。此外，将0.8 mL的PBS (pH分别为4.0、5.0、6.0和7.0)移液到一个单独的小瓶中，然后将0.1 mL 5 mM氟- p溶液(pH分别为4.0、5.0、6.0和7.0)加入到每一个小瓶中。将这些混合物移液到96孔板中，在室温下分别孵育0、15、30、60、120和180 min，并在420 nm处用分光光度计定量染色衍生物DDL的强度。

涵盖0.001–1的FA浓度范围的校准曲线 嗯,准备好了。对于常规分析，每天准备一次一点校准（一式两份），用于脑样本的定量计算。

2.5.2。一天之内和每天的变化

对照脑样本( )分析第1天DDL浓度，分别评估0、15、30、60、90、120和180 min内FA浓度的变化。另一组分别在第1、7和14天测定每日FA浓度的变化。

2.6。动物

所有指定的无病原体成年雄性C57BL/6小鼠( 6周龄，18-20 g)，由首都医科大学实验动物资源(中国北京)提供，标准饲养条件(光照-暗循环12 h，湿度70%-80%，25±1℃)，自由提供食物和水。所有动物实验均按照国家卫生研究院《实验动物护理与使用指南》进行，并经首都医科大学科研管理处批准(AEEI-2015-032)。

2.7。FA注射后的FA代谢及Morris水迷宫试验

用18只成年正常小鼠腹腔注射FA (0.6 mM, 0.5 mL)或生理盐水(0.5 mL) 30 min，观察FA在成年正常小鼠大脑中的代谢。18只小鼠进行Morris水迷宫试验。9只小鼠注射FA (0.6 mM, 0.5 mL;连续7天，每次迷宫评估前30分钟。控制老鼠( )，腹腔注射生理盐水(0.5 mL)，进行与上述相同的实验。所有涉及Morris水迷宫的空间训练和记忆提取实验均如前所述进行[12，13］.

2.8。人体解剖样本

对年龄与载脂蛋白e相匹配的健康对照组的海马组织进行尸检^{ε3 /ε3}和载脂蛋白e的AD患者^{ε4 /ε4}基因型由荷兰脑库(NBB)提供(补充表1可在网上查阅)https://doi.org/10.1155/2017/9043134）.就人口统计数据而言，两组间无显著差异。

2.9。统计分析

使用GraphPad Prism版本5.01（美国加利福尼亚州圣地亚哥GraphPad软件公司）生成图表。使用SPSS软件版本21.0（美国伊利诺伊州芝加哥市SPSS公司）生成统计分析在Morris水迷宫实验中，Fisher的最小显著性差异用于事后比较，不同治疗组之间连续每天的差异通过单因素方差分析进行分析。对于其他实验，统计显著性通过单因素方差分析和Tukey's分析确定事后检验。数据表示为平均值 ± 三次独立实验的标准误差。 被认为具有统计学意义。

3.结果

3.1.FA、氟-P和DDL的紫外吸收峰

为了确认两种无色试剂(FA和Fluoral-P)之间的衍生反应所提出的机制，产生了一种有色化合物DDL [21，22)，我们首先观察氟- p与FA混合物颜色的变化。加入Floural-P后不久，生成黄色DDL(补充图2)，测定紫外吸收峰。结果表明，在无色的Fluoral-P溶液中，在420 nm处没有明显的吸收峰(图)1(一))，但添加FA溶液后，在420处出现明显峰值 在几秒钟内灵敏地检测到nm（图1 (b)和1 (c)）.值得注意的是，不同浓度的氟- p (0.5 mM)和FA之间有一个剂量依赖性的DDL吸收峰(420 nm)形成(图)1 (d)）.这些数据表明，FA衍生物DDL是FA分光光度检测的候选试剂。

３．２．FA衍生物- ddl反应条件的优化

为了提高该方法的灵敏度，我们探索了一些实验参数，如反应pH，反应时间和反应温度。首先，考察了在不同时间pH对衍生物反应中DDL生成的影响。结果表明，室温(25±1°C)下，随着pH (pH 4.0-7.0)范围的增大，DDL在0、15、30 min的紫外吸收值逐渐降低(图4)2(一个)，2 (b),2 (c)）.有趣的是，DDL的吸收值在pH 6.0时达到最大值0.379，但在第一个小时后显著下降(图)2 (d)）.

由FA(0.001、0.01、0.1和1 mM, pH 6.0)和Fluoral-P (0.5 mM, pH 6.0)分别在0、15、30和60 min测定的DDL标准曲线均呈线性( )，但四个回归方程的斜率之间存在显著差异(图)3(一个)和3 (b)）.结果表明，DDL衍生物反应的最佳反应条件为pH: 6.0;反应时间:1h;反应温度:室温。

３．３．FA检测的极限

其次，我们确定了该方法的检测上限，结果表明，当氟- p (0.5 mM, pH 6.0)加入溶液(pH 6.0)，或等于10 mM FA, 1 h，吸光度为420 nm。任何浓度高于10 mM(在最佳条件下)的FA在第一个小时内420 nm的紫外吸光度没有线性变化(图)3(一个)和3 (b))，表明该方法检测FA的上限为10 mM。

pH为6.0时，标准曲线1 h内FA的实际浓度分别为0.001、0.01、0.1和1 mM。标定曲线的回归方程为 和x + 线性回归系数为0.283(R的0.999(图3 (c)).在常规分析中，可使用一点校准（一式两份）代替校准曲线，但准备了新的校准曲线，以检查仪器系统是否存在偏差。检测限（LOD）和量化限（LOQ）按照上述方法，根据校准线回归线的置信区间计算[23- - - - - -25］.方法的检出限和定量限分别为0.5和2.5μ分别为M(图3 (d)）.

3．4．方法的重复性和稳定性

在一天的不同时间点分析9个重复的对照大脑样本，以评估一天内的变化。同样的大脑匀浆样本在不同的日子也被分析，以评估每天的变化。日变化数据汇总于表中1．这些数据表明，在一天内，脑样本中的FA浓度没有差异(平均水平:0.2705±0.0045 mM; )每日变化的结果表明，平均相对标准偏差小于5%（表1）2）.这些数据表明，该方法可以准确、准确地测定脑样本中FA的浓度。

3．5．脑游离脂肪酸分析及神经毒性评价

最后，为了研究该方法是否可以评估不同脑样本中FA水平的变化，我们在腹腔注射FA 30 min后检测FA注射小鼠的脑内FA含量( )这些来自AD患者海马组织的尸体解剖( )和年龄匹配的对照组( ）.结果表明，与对照组相比，注射FA的小鼠脑FA水平明显升高(con组:0.279±0.012 mM;FA组:0.395±0.017 mM; )(图4(一)）.更重要的是，这些注射了更高水平FA的小鼠比对照组小鼠在Morris水迷宫中的记忆行为表现出更严重的损害(补充图1)。此外，AD患者尸检样本中的FA浓度显著高于年龄匹配的对照组(con组:0.286±0.021 mM;AD组:0.420±0.013 mM; )(图4 (b)）.这些结果表明，我们新的分光光度法适用于检测大脑中的FA浓度，并表明过量的FA确实会导致认知障碍。

4.讨论

几十年前，无色试剂Fluoral-P被确定为废水、室内空气、白酒中快速检测FA的衍生试剂[22，26，27，但据我们所知，从未用于测量脑组织中的FA。在本研究中，建立了一种高选择性的荧光- p分光光度法，选择性地与FA反应生成一种有色化合物- ddl，用于脑样品中FA的灵敏测定。与GC/MS和HPLC方法相比，该反应方法的样品制备过程和衍生物相对简单直观。因此，该分光光度法在脑内FA的检测中具有广阔的应用前景。

大量证据表明，气态脂肪酸可导致动物和人类的认知障碍[5，8］.在衰老过程中，内源性FA的慢性积累被认为是偶发性年龄相关性痴呆的一个危险因素[10，28］.此外，在正常成年小鼠和猴子中，过量的FA已被发现有助于淀粉样蛋白片段的病理性聚集和tau蛋白的过度磷酸化[29，30.］.更重要的是，直接在动物模型的侧脑室内注射过量的FA会导致记忆衰退[13- - - - - -15］.因此，有必要确定生物组织中内源FA的浓度。

到目前为止，已经发展了多种检测内生FA的分析方法。例如，使用FA检测试剂盒，在给予侧脑室内注射甲醇的猴子的脑脊液中发现FA水平增加了两倍(0.016 mM) [31，从而导致认知障碍、ad样淀粉样斑块和tau蛋白过度磷酸化[30.］.使用HPLC-Fluo，发现人血液和尿液中的内源性FA浓度分别约为0.08和0.03 mM [12，32］.同样地，使用HPLC-UV测定2,4-二硝基苯肼(一种衍生剂)的含量，结果显示，正常的Sprague-Dawley大鼠和人类尿液中的FA浓度约为0.01 mM [33］.顶空气相色谱法显示，人尿中FA的浓度在0.019 - 0.048 mM之间[34］.此外，在本研究中检测到的对照小鼠脑样本中内源性FA浓度约为0.27 mM，这与之前使用HPLC-Fluo的报告一致[20.], HPLC-UV [19]和GC-MS [17］.

5.结论

使用这种改良的荧光-P法，在注射FA的小鼠脑样本中检测到异常高水平的FA（补充图3）综上所述，目前使用氟-P作为衍生试剂测定脑样本中FA的分光光度法是测定脑FA和评估过量FA神经毒性的成熟方法的简单、灵敏和可行的替代方法。

的利益冲突

两位作者宣称没有相互竞争的经济利益。

作者的贡献

岳祥培、张耀月、邢文文对这部作品都有贡献。

致谢

北京市教委科研共性项目(no . KM201510025014);北京市脑障碍研究所重大项目(no . ZD2015-08); CCMU自然科学基金项目(no . 2015ZR31, no . 2016JS09)。关键词:岩石力学，有限元分析，数值模拟，数值模拟

补充材料

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