芦荟素通过抑制MAPK信号通路抑制卵巢癌SKOV3细胞生长和转移

摘要

芦荟素是芦荟的有效成分，在抗炎、抗紫外线、抗菌等方面具有重要作用。我们研究了芦荟素在卵巢癌细胞生长和转移中的作用及其可能的机制。结果表明，芦荟素对细胞活力和克隆具有剂量依赖性的抑制作用。它将细胞周期阻滞在s期并诱导SKOV3细胞凋亡。在体内实验中，观察到芦荟素能抑制肿瘤的生长。此外，它还能抑制癌细胞在SKOV3细胞中的迁移和侵袭。有趣的是，随着芦荟素剂量的增加，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号家族的成员磷酸化程度降低。这提示芦荟素通过MAPK信号通路发挥抗癌作用。我们的数据也强调了芦荟素作为一种新型治疗卵巢癌药物的可能性。

1.介绍

卵巢癌是妇科常见的三大恶性肿瘤之一，发病率居第三位。根据最近的一项统计，美国每年有22280例卵巢癌新发病例，其中估计有15500例患者死于这种恶性肿瘤[1］．影响卵巢癌发生发展的因素是多方面的;目前，它被认为是一种多步骤疾病，涉及多个基因的协调相互作用，以及细胞内多个分子和形态变化的积累。手术、化疗和放疗是卵巢癌的三种主要治疗方案。不幸的是，由于有限的治疗策略，预后仍然很差，除了晚期诊断[2，3.］．因此，寻找一种新的治疗卵巢癌的方法迫在眉睫。

中医有着几千年的临床实践历史，在维护亚洲人民健康方面发挥着重要作用，并在世界各地得到越来越多的应用。芦荟在中国有着悠久的药用历史;目前，由于其抗炎活性、紫外线保护、抗关节炎特性、伤口和烧伤愈合能力以及抗菌/抗癌特性，它经常被用于草药[4- - - - - -6］．芦荟中含有多种生物活性成分，其中包括芦荟大黄素。芦荟大黄素具有抗增殖作用，诱导细胞凋亡[7- - - - - -9］．它还能在神经外胚层肿瘤中产生抗癌活性[10]，鼻咽癌[11，肺鳞状细胞癌[12，肝癌细胞[13]、胃癌[14，以及前列腺癌[15］．芦荟大黄素通过氧化应激和持续激活c-Jun n -末端激酶(JNK)诱导凋亡细胞死亡[16］．以往的研究表明，芦荟大黄素通过s期阻滞人舌鳞癌SCC-4细胞，诱导细胞死亡[17］．本作者之前的一项研究也表明mTORC2是芦荟大黄素的靶点，芦荟大黄素能强烈抑制PTEN损失引起的AKT活化[18］．

芦荟素是芦荟的另一有效成分。芦荟素已被证明是一种有效的选择性酪氨酸酶抑制剂，对黑色素生成具有直接抑制作用[18］．然而，人们对芦荟素在抗癌活动中的作用知之甚少。目前所有可用的文献几乎都没有揭示芦荟素在人类癌症中抗癌活性的信号通路。在本研究中，我们评估了芦荟素对多种卵巢癌细胞系生长的抑制作用。结果表明芦荟素可以杀死卵巢癌细胞。我们进一步证明，芦荟素通过抑制MAPK信号级联的激活，在细胞周期的s期抑制卵巢癌细胞并诱导凋亡。这导致了培养细胞的生长抑制以及肿瘤在小鼠体内的局部生长和扩散的减少，显示出芦荟素在卵巢癌治疗中的临床前活性。

2.材料和方法

2．1．试剂与细胞培养

芦荟素购自中国北京国家药品和生物制品控制研究所，HPLC检测纯度≥95%。抗MMP-9、MMP-2、GAPHD的一抗购自中国香港Abcam公司。抗MEK、ERK、JNK和p38 MAPK的抗体来自Cellular Signaling Co (NY, USA)。卵巢癌细胞系OV-1063, CoC1, Cao V-3, OVCAR3和SKOV3购自美国型培养库(ATCC, USA)，并保存在Dulbecco 's modified Eagle 's培养基(DMEM) (Invitrogen, CA, USA)中。卵巢癌细胞系添加10%胎牛血清(FBS, Invitrogen)和100 U/ml青霉素/链霉素(Sigma, St. Louis, MO, USA)。细胞在37°C、5% CO的湿化气氛中培养₂．细胞每2 d传代一次，以获得指数增长。

2．2．免疫印迹分析

用转染细胞提取总蛋白。用BCA试剂盒(Beyotime，南通，中国)对提取的蛋白进行定量。将等量的50 ng蛋白加载到12%的SDS-PAGE凝胶上，然后转移到PVDF膜上(孔径= 0.45)μm) (Millipore, Billerica, MA, USA)。在室温下，用5%脱脂牛奶三磷酸盐吐温20 (TBST)封闭60分钟后，用相应的一抗在4°C孵育过夜。然后用TBST清洗膜三次，再用二抗室温孵育1小时。采用增强化学发光(ECL)溶液进行免疫反应。同时检测GAPHD作为负荷对照。

2．3.细胞活力测定和菌落形成测定

以5 × 10的密度将SKOV3细胞接种到96孔板中^3.细胞/孔，培养过夜，然后用不同浓度(0,2.5,5,10,20,40)的芦荟素处理μM)孵育48小时或与5μ芦荟素处理24、48、72 h。使用3-[4,5-二甲基噻唑-2-yl]-2,5-二苯基溴化四唑测定法(MTT, Sigma, St. Louis, MO, USA)评估芦荟素处理后的细胞活力，如前所述[19］．为了确定芦荟素对细胞生长的长期影响，我们进行了菌落形成试验。简单地说，在6孔板中每孔镀500个细胞。细胞培养10 d，菌落用结晶紫染色。这些染色的菌落随后被拍照并手工计数。

２.４.细胞周期分析

分别用不同浓度的芦荟素(0、2.5、5、10)处理SKOV3细胞μm）48小时。然后，用80％冷乙醇固定skov3细胞，并在37℃下孵育含有1mg / ml rNasea的0.5％Triton X-100溶液30μm。然后通过根据先前的报告用PI染色的流式细胞术检测细胞周期[20.］．

2．5．赫斯特33342年染色

通过染色质凝聚和Hoechst 33342片段染色观察细胞核组装形态的变化，鉴定凋亡细胞。不同浓度芦荟素处理48 h后，用PBS洗涤细胞，用5μg/ml Hoechst 33342试剂，37℃，黑暗10分钟。荧光显微镜观察细胞核DNA染色。每组随机选取5个显微镜视野进行计数。

2．6．膜联蛋白V /π分析

用不同浓度的芦荟素处理SKOV3细胞48 h。根据制造商的说明书，使用Annexin V/PI细胞凋亡试剂盒进行细胞凋亡分析。收集细胞，用冷PBS洗涤两次，以1 × 10的密度重悬⁶细胞在100 /毫升μL的结合缓冲液含5μl Annexin V-FITC和1μL PI PI工作解决方案（100 μg / ml)。室温黑暗孵育30分钟后，用流式细胞仪(BD Biosciences)分析样品。

2.7。伤口愈合实验

将SKOV3细胞接种于6孔板，用不同浓度的芦荟素(0、2.5、5和10)处理μM) 24小时。然后,10μ用无菌移液管尖端在每个孔的中心形成一个等宽的垂直交叉。生长24 h后，观察刮伤创面细胞，每组在200倍尼康显微镜下拍照。

2.8。Transwell迁移和入侵分析

Transwell室与聚碳酸酯过滤器(8μm孔径)，购自美国纽约康宁公司。对于transwell迁移试验，将指定剂量芦荟素处理的SKOV3细胞胰酶化，并用无fbs的DMEM培养基洗涤三次。细胞以2 × 10的密度重悬于无fbs的DMEM中⁵细胞/ml，接种到上腔室(100μl).对下室，加入600 ml含10%胎牛血清的DMEM培养基。然后让细胞迁移12小时，然后用结晶紫染色细胞膜。在随机选择的5个区域中，使用光学显微镜手动计数已转移到滤膜下表面的细胞。对于侵袭性测定，腔室预先涂有50μl(在无血清DMEM培养基中1:30稀释)。协议与迁移分析中描述的相似。

2.9。小鼠异种移植和转移模型

利用SKOV3细胞建立卵巢癌异种移植瘤模型。简单地说，6周龄无胸腺裸鼠随机分为三组:对照组()、芦荟素组(20 mg/kg，)和(40毫克/公斤，)．所有小鼠按照泰州市中心医院伦理委员会的指导方针在SPF级条件下饲养。每组小鼠取SKOV3细胞(2 × 10⁶)注射到右侧。实验组小鼠每天注射芦荟素(20 mg/kg或40 mg/kg)，连续3周。然后监测老鼠的肿瘤生长情况。每周两次测量肿瘤长度(L)和宽度(W)。肿瘤体积(TV)计算为．接种7周后处死所有小鼠并解剖肿瘤。将切除的肿瘤称重并拍照。裸鼠注射1 × 10，诱导肺转移⁶横向尾静脉的Skov3细胞。1个月后，将小鼠安乐死，使肺被除去他染色。所有的努力都是最大限度地减少痛苦。动物实验的协议由泰州市中心医院的伦理委员会批准。

2.10。统计分析

所有数据都表示为平均值±标准偏差（SD）。使用学生评估组之间的差异t以及。差异与值小于0.05被认为有统计学意义。

3.结果

3．1.芦荟素抑制卵巢癌细胞生长的剂量和时间依赖的方式

为了评价芦荟素对卵巢癌的毒性作用，我们用不同浓度(0、2.5、5、10、20、40)的芦荟素处理5种人卵巢癌细胞系μM)和不同时间(24、48、72 h)。MTT实验显示芦荟素对多种卵巢癌细胞株具有浓度依赖性和时间依赖性的杀伤作用(图)1(一)和1 (b))．SKOV3细胞系对芦荟素的敏感性高于其他细胞系。芦荟素具有明显的强毒作用，IC50值在5左右μM在SKOV3细胞系中表达。因此，我们选择SKOV3细胞系作为后续功能分析的最佳细胞模型。用芦荟素2.5 ~ 10处理SKOV3细胞株μM体外。我们采用了0、2.5、5和10的剂量μal aloein和表演菌落形成测定。目测观察到，菌落的大小较小，随着AloOSin的剂量增加（图1 (c))．定量分析进一步显示，随着芦荟素剂量的增加，菌落数量也会减少(图)1 (d))．同样，随着芦荟素剂量的增加，单克隆的平均面积也逐渐变小(图)1 (e))．这些数据表明芦荟素以剂量和时间依赖性的方式抑制卵巢癌细胞的生长。

3．2．芦荟素抑制SKOV3细胞周期并促进细胞凋亡

我们进一步研究了芦荟素对卵巢癌细胞系存活率的影响机制。评估细胞周期进展。结果表明，芦荟素处理SKOV3细胞后，细胞周期受到抑制。更重要的是，随着芦荟素剂量的增加，G2/M期细胞比例逐渐下降。相比之下，芦荟素处理的SKOV3细胞中s期细胞的百分比增加(图)2(一个))．结果表明，芦荟素能使细胞周期阻滞在s期，且呈剂量依赖性。Western blot进一步证实SKOV3细胞经芦荟素处理后S-G2/ m相关蛋白cyclin A、CDK2和cyclin D1水平下调(图)2 (b))．

然后进行Hoechst 33342染色，观察细胞核形态。在对照细胞中，细胞核呈弱而均匀的蓝色，而在芦荟素处理的细胞中，可以观察到一些明亮的染色质凝聚和核碎裂(图)2 (c))．随着芦荟素浓度的增加，含有浓缩染色质的凋亡细胞核数量显著增加。综上所述，芦荟素可能导致SKOV3细胞凋亡。Annexin V-FITC/PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡。如图所示3 (d)，在SKOV3细胞系中，芦荟素处理后，凋亡后期显著增加，呈剂量依赖性。凋亡是一种caspase依赖性的程序性细胞死亡。当用不同浓度的芦荟素处理SKOV3细胞时，western blot检测到caspase-3、caspase-9和PARP1的显著蛋白裂解(图)2 (e))．western blot检测促凋亡和抗凋亡线粒体蛋白Bax和Bcl-2的水平。芦荟素增加了SKOV3细胞中Bax的表达，相反降低了Bcl-2的表达。这些不同的凋亡检测结果揭示了细胞凋亡的显著特征，这强烈提示芦荟素介导的抑制卵巢癌细胞生长与凋亡增强密切相关。

3．3.芦荟素抑制卵巢癌异种移植瘤的生长

我们利用SKOV3细胞建立了卵巢癌异种移植模型。实验组每天分别注射芦荟素20 mg/kg和40 mg/kg，连续注射7周。定期监测肿瘤大小。4周后，实验组和对照组的肿瘤体积有所不同，7周时差异显著。对照组肿瘤体积明显大于实验组(图)4(一)和4 (b))．切除肿瘤的平均重量在实验组和对照组之间也有显著差异;对照组肿瘤最大，实验组肿瘤较小(图)4 (b))．此外，在芦荟素处理的异种移植瘤中，通过检测增殖细胞核抗原(PCNA)和cleaved caspase-3分别可以观察到更少的增殖细胞和更多的凋亡细胞(图4 (d))．这些数据表明芦荟素在体内有抑制卵巢癌生长的作用。

3．4．芦荟素抑制SKOV3细胞的迁移和侵袭

随后评估芦荟素对SKOV3细胞转移的影响。如图所示3(一个)，与对照细胞相比，较高剂量的AloOSin抑制了伤口闭合过程;大约70％的伤口闭合在10中受到抑制 μ米浓度的aloesin（图3 (b))．在transwell实验中，芦荟素处理后迁移的细胞和被侵袭的细胞在视觉上受到抑制(图)3 (c))．大多数对照细胞迁移到下表面，而80%的细胞在2.5后迁移到下表面μ当芦荟素剂量增加到10时，只有20%的细胞成功迁移μM(图3 (d)左面板)。在侵袭试验中，70%的细胞在2.5小时后做到了这一点μ当芦荟素剂量增加到10时，只有25%的细胞成功侵入μM(图3 (d)右面板)。此外，芦荟素对MMP-2和MMP-9的剂量依赖性降低(图)3 (e))．为了评价芦荟素在体内对肿瘤转移的作用，我们建立了实验性肺转移的动物模型。我们通过静脉注射将SKOV3细胞接种于免疫缺陷裸鼠的尾部。与PBS治疗组相比，芦荟素治疗组小鼠的肺转移菌落数量明显减少(图)3 (f)和3 (g))．此外，没有芦荟素治疗的小鼠肺部肿瘤结节的发生率比芦荟素治疗的小鼠更高(图)3 (h))．我们的数据表明芦荟素在体内和体外都能抑制卵巢癌细胞的转移。

3．5．芦荟素抑制MAPK信号通路的磷酸化

Western blot分析显示，芦荟素处理SKOV3细胞后，MAPK家族成员，这是一种丝氨酸-苏氨酸激酶，调节多种细胞功能。虽然MEK、ERK、MAPK和JNK的总蛋白水平保持不变，但这四种蛋白的磷酸化水平显著降低。这一结果表明，芦荟素处理后MAPK信号通路被灭活(图)5)．

4.讨论

卵巢癌仍然是世界各地女性健康的一大威胁;据估计，只有大约30%的患者有5年的生存率[21］．芦荟素是中草药芦荟的有效成分，已被证明具有抗炎、防紫外线和抗菌的特性[4- - - - - -6］．本研究探讨了芦荟素对卵巢癌的治疗价值及其可能的作用途径。

芦荟素暴露导致了剂量和时间依赖性的所有卵巢细胞系的活力下降。在菌落实验中，芦荟素以剂量依赖性的方式抑制SKOV3细胞的克隆潜能。芦荟素处理SKOV3细胞，阻滞细胞周期，G2/M期随着芦荟素浓度的增加而迅速下降。SKOV3细胞在芦荟素处理后出现明显的剂量依赖性凋亡增加，尤其是晚期凋亡。此外，芦荟素在体内对肿瘤有明显的抑制作用。总之，我们的数据表明芦荟素对卵巢癌有潜在的抗癌作用。我们还研究了芦荟素对SKOV3细胞的迁移和侵袭;这些细胞的迁移和入侵能力较弱。远处转移标志物MMP-2和MMP-9在芦荟素治疗组中也降低，这进一步支持了芦荟素的抑制。总的来说，我们的数据表明芦荟素有抑制卵巢癌细胞生长和转移的潜力。

此外，我们的数据显示，芦荟素处理SKOV3细胞后，MAPK信号通路磷酸化水平(p-ERK, p-JNK和p-p38 MAPK)降低，表明芦荟素可能调控卵巢癌中的MAPK信号通路。哺乳动物的MAPK家族由ERK、p38和JNK组成，每个成员都有几个亚型:ERK1到ERK8;p38α(MAPK14),人们β(MAPK11),人们γ(MAPK12)和p38δ(MAPK13);和JNK1 (MAPK8)、JNK2 (MAPK9)、JNK3 (MAPK10)。每个MAPK信号级联至少由三层组成:一个MAPK激酶(也称为RAF)、一个MAPK激酶(也称为MEK)和一个MAPK激酶。活化的MAPKs使许多底物磷酸化，从而调节许多重要的细胞过程，如分化、增殖、存活和细胞粘附。本研究观察到芦荟素剂量依赖性地降低ERK、JNK、p38 MAPK和MEK的磷酸化水平，提示芦荟素调控MAPK信号通路。然而，之前的研究发现，在U937白血病细胞中，只有p38和JNK/MAPK参与了芦荟介导的细胞凋亡。有趣的是，ERK与上述活动没有关联，这与我们的数据相矛盾。我们推测，这种矛盾可能是由于不同的癌症类型，如果这是真的，不同的机制可能是芦荟素介导的抗癌活性在不同的癌症类型。然而，还需要做更多的工作。

综上所述，本研究证实芦荟素是一种抑制卵巢癌肿瘤生长和转移的新型治疗化合物。芦荟素的抗癌活性可能是通过MAPK信号通路实现的。我们的数据强调了芦荟素作为一种新型治疗卵巢癌药物的可能性。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

本研究由泰州市医学科学基金资助(15yw02)。

参考

1. R. Siegel, D. naishaham和A. Jemal，《癌症统计，2012》，CA:临床医生的癌症杂志，第62卷，第10-29页，2012。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. 王涛等，“长链非编码rna在卵巢癌中的作用与机制”，国际妇科癌症杂志，卷。25，pp。566-569,2015。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. M. Brinkhuis, M. A. Izquierdo, J. P. Baak等人，“在晚期卵巢癌中多药耐药相关标记物的表达，它们与定量病理肿瘤特征和预后的关系，”分析细胞病理学，卷。24，pp。17-23,2002。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. “银离子对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌作用的机理研究”，“银离子对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌作用的机理研究”，生物医学材料研究杂志，第52卷，第662-668页，2000。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. T. Reynolds和a . C. Dweck，《芦荟胶:最新评论》民族药物学杂志， 1999年第68卷第3-37页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. B. Vazquez, G. Avila, D. Segura, and B. Escalante，“芦荟凝胶提取物的抗炎活性”，民族药物学杂志，卷。55，PP。69-75,1996。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. D.开场，E. Savic，Z.Ramic等，“芦荟 - 大蛋白抑制成人人类角质形成细胞的增殖，”美容科学杂志，卷。63，pp。297-302,2012。视图:谷歌学术搜索
8. C. Tabolacci, S. Oliverio, A. Lentini et al，“芦荟大黄素对人U937单细胞白血病细胞的抗增殖和分化剂”，生命科学，第89卷，第812-820页，2011。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. P. Suboj, S. Babykutty, P. Srinivas, S. Gopala，“芦荟大黄素通过激活人结肠癌细胞caspase-6诱导G2/M细胞周期阻滞和凋亡”药理，卷。89，pp。91-98,2012。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. T.Pecere，M.V.Gazzola，C. Mucignat等，“Aloe-Emodin是一种新型的抗癌剂，具有针对神经分区肿瘤的选择性活性”，“癌症研究，第60卷，第2800 - 2804,2000年。视图:谷歌学术搜索
11. Lin M. L. Lin, Y. C. Lu, J. G. Chung等，“芦荟大黄素通过caspase-8介导的线粒体死亡途径诱导人鼻咽癌细胞凋亡”，癌症的信， 2010年，第291卷，第46-58页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. 李海志，“蛋白激酶C在芦荟大黄素和大黄素诱导肺癌细胞凋亡中的作用”，英国药理学杂志，第134卷，第1093-1103页，2001。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. “芦荟大黄素的抗增殖活性是通过p53依赖和p21依赖的凋亡途径在人肝癌细胞系中发挥的，”生命科学，第71卷，1879-1892页，2002年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. “芦荟大黄素对胃癌细胞生长的抑制作用及其对碱性磷酸酶活性的抑制作用”，癌症生物学与治疗，第6卷，第85-88页，2007。视图:谷歌学术搜索
15. K. Liu, C. Park, S. Li等，“芦荟大黄素通过靶向mTOR复合物2抑制前列腺癌，”致癌作用，第33卷，1406-1411页，2012。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. “氧化应激和JNK持续激活在芦荟-大黄素介导的人肝癌细胞凋亡中的重要作用”，致癌作用，第28卷，1937-1945页，2007。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. T.H. Chiu，W.W.Lai，T.C.Hsia等，“芦荟 - 大蛋白，通过人舌鳞癌SCC-4细胞的S-Papse Arck和Caspase依赖性途径诱导细胞死亡”抗癌的研究， vol. 29, pp. 4503-4511, 2009。视图:谷歌学术搜索
18. Y. H. Jin, S. J. Lee, M. H. Chung等人，“芦荟素和熊果苷通过不同的作用机制以协同的方式抑制酪氨酸酶活性，”药物研究档案，第22卷，第232-236页，1999。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. Li S.， Dong P.， Wang J.等，“淫羊藿苷是一种天然黄酮醇苷，通过ROS/ jnk依赖的线粒体途径诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡，”癌症的信，第298卷，第222-230页，2010。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. 冬凌草甲素通过线粒体途径诱导胆囊癌细胞凋亡和细胞周期阻滞，"BMC癌症，卷。14，p。217,2014。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. w·奥伯莱格纳(W. Oberaigner)，“欧洲卵巢癌的存活率:在过去十年中，不同国家的差异并没有缩小，”Acta Mocologica.，第51卷，第441-453页，2012。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

版权

版权所有©2017张丽倩等。这是一篇发布在知识共享署名许可协议，允许在任何媒介上不受限制地使用、传播和复制，但必须正确引用原作。