). 31% of MDS-MSCs had chromosomal aberrations (der(3),del(6q),del(7p), loss of chromosomes) whose BM karyotypes were normal. Highest percentage of karyotypic abnormalities was observed in RCMD-MSCs. Patients with abnormal BM karyotypes had no aberrant MSC clones. Results show that in spite of presence of genetically abnormal clones in MDS-MSC populations, in vitro phenotypic and growth characteristics of MSCs in MDS remain unchanged. Further, the occurrence of genetic abnormalities in BM-MSCs in MDS could be considered as an autonomous event from that of their hematopoietic counterparts."> 新生骨髓增生异常综合征中间充质间质细胞的表型和细胞遗传学特征 - raybet雷竞app,雷竞技官网下载,雷电竞下载苹果
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分析细胞病理学
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分析细胞病理学/2016/文章

研究文章|开放获取

体积 2016 |文章的ID 8012716 | https://doi.org/10.1155/2016/8012716

A. J. I. S. Rathnayake, H. W. W. Goonasekera, V. H. W. Dissanayake， ＂间充质基质细胞的表型和细胞遗传学特征新创骨髓增生异常综合征"，分析细胞病理学， 卷。2016， 文章的ID8012716， 11 页面， 2016． https://doi.org/10.1155/2016/8012716

间充质基质细胞的表型和细胞遗传学特征新创骨髓增生异常综合征

a.j. i.s. Rathnayake，1，2 H. W. W. Goonasekera，1 和 V. H. W. Dissanayake1

1科伦坡大学医学院人类遗传学研究室，斯里兰卡科伦坡00800

2斯里兰卡，拉特马拉那，约翰·科特拉瓦拉国防大学医学院临床前科学系

学术编辑器:阿兰教堂
收到了 2016年4月29日(
修改后的 2016年7月02
接受 07年8月2016年
发表 2016年8月29日

摘要

骨髓间充质干细胞/基质细胞(MSCs)在造血过程中起重要作用。骨髓增生异常综合征(MDS)中骨髓间充质干细胞是否改变其特征仍有争议。我们描述了间充质干细胞新创既往文献中未报道的斯里兰卡MDS患者。我们还分析了不同MDS亚型的间充质干细胞。培养扩大MSCs，用流式细胞术进行表征，诱导MSCs向成骨和成脂分化。利用生长曲线和种群倍增次数测定生长特性。对间充质干细胞进行核型分析和FISH分析。各亚型间充质干细胞的细胞形态、分化潜能、CD标记物表达均与对照间充质干细胞相当。对照组MSCs与MDS-MSCs各亚型间生长无显著差异( )．31%的MDS-MSCs存在染色体畸变(der(3)，del(6q)，del(7p)，染色体丢失)，BM核型正常。RCMD-MSCs的核型异常率最高。bm核型异常的患者未发现异常的MSC克隆。结果表明，尽管MDS-MSC群体中存在遗传异常克隆，在体外MDS中MSCs的表型和生长特征保持不变。此外，骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)在MDS中的遗传异常的发生可以被认为是造血系统中相应基因异常的自发事件。

1.介绍

多能间充质干细胞(Multipotent mesenchymal stem/stromal cells, MSCs)是一组未分化的细胞，具有自我更新和分化为多种细胞谱系的能力，包括脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞[1，2]．其特点是表达CD73、CD90和CD105，缺乏CD34和CD45等造血标志物的表达[1]．骨髓间充质干细胞通过细胞间直接接触和分泌调节因子来调节造血、稳态和造血干细胞(造血干细胞)的维持[3.，4]骨髓间充质干细胞是造血干细胞功能生态位中最重要的组成部分，其生物学特性被认为在血液系统恶性肿瘤中会发生改变[5- - - - - -8]．

骨髓增生异常综合征(MDS)是一种复杂的骨髓造血干细胞疾病，其特征是外周血细胞减少、细胞发育不良和功能障碍，导致造血功能无效[6，7]．新兴的研究和在体外模型表明，该疾病并非简单地源于异常的HSC克隆，而是骨髓微环境中缺陷细胞及其与造血室复杂相互作用的综合结果[6，7]．骨髓间充质干细胞在MDS中的功能完整性及其在MDS发病机制和进展中的作用尚存争议[5- - - - - -12]．虽然有报道发现MDS的间质室在细胞遗传学和功能上都是正常的[10，11]，亦有研究显示间充质干细胞在细胞遗传学上有异常，在执行其正常功能时有缺陷[5，12，13]．主张MDS-MSCs观点的组均为正常组，研究表明MDS-MSCs的细胞形态、表面抗原表达、分化能力与正常MSCs相当，且无染色体畸变[10，14，15]．相反，其他一些研究报道了增殖和分化能力、免疫调节特性、细胞-细胞相互作用、信号通路和细胞遗传学特性的改变[13，16- - - - - -20.]．以前曾报道过造血干细胞和间充质干细胞间存在共存的遗传畸变[12，21- - - - - -23]，发现MSCs中的畸变在细胞遗传学异常的HSCs患者中更常见[21]．这种异常是同时发生在两个室间，还是以克隆关系发生，还是以独立的方式发生，目前尚不清楚[21- - - - - -23]．因此，有必要对其表型和细胞遗传学特性进行进一步研究，以解决现有的争议，更好地了解疾病生物学。

亚洲人群中MDS BM的细胞遗传学特征与西方人群存在差异;+8和del(7q)是亚洲MDS患者中最常见的细胞遗传学异常，而del(5q)已被报道为西方MDS患者中最常见的细胞遗传学异常[24- - - - - -29]．据报道，亚洲的发病年龄比西方国家要小[28，29]。大多数研究都是使用北美和欧洲人群进行的，而南亚MDS患者群体的数据很少。因此，尽管之前已经报道了MSCs的生物学特征和细胞遗传学特征[9，12，21- - - - - -23由于细胞谱的人群差异，进一步探索不同种族MDS患者的表型和细胞遗传学特征非常重要[29，30.]．此外，比较不同MDS亚型间充质干细胞特征的研究还很有限。因此，为了更好地了解MDS- mscs的特点，弥补南亚背景资料的不足，本研究选取了既往文献未报道的斯里兰卡原发性MDS患者进行研究。

在这项研究中，我们分析了新诊断的骨髓间充质干细胞的形态、免疫表型、分化能力、生长和细胞遗传学特征新创斯里兰卡的MDS患者群体。我们还比较了不同MDS亚型间充质干细胞的特点。

2.材料和方法

2．1.病人

20名患者被诊断患有新创MDS从斯里兰卡的3家三级护理综合医院(斯里兰卡国立医院、科伦坡南方教学医院和科伦坡北方教学医院)和一家癌症护理医院(Maharagama国家癌症研究所)招募。招募2013 - 2015年在上述医院报告的患者。MDS的诊断依据是临床表现、外周血计数、BM抽吸、环钻活检报告和BM核型，并根据2008年WHO分类分为不同亚型。排除继发性MDS及其他慢性疾病患者。除原发性/继发性骨髓衰竭综合征外，还有5名有接受骨髓抽吸作为诊断检查的适应症的患者被纳入研究作为对照组。这项研究是根据赫尔辛基宣言(2008年)开展的。科伦坡大学医学院伦理审查委员会批准了该方案(ERC-12-40)，并从上述医院获得了招募其患者参加所述研究的所有必要许可。用于研究的骨髓标本是在局麻下进行初次诊断性骨髓穿刺时获得的。以斯里兰卡使用的所有三种国家语言编写了一份载有研究目的、持续时间、程序、保密、潜在风险、危害、不适等细节的资料表和一份同意表格。在进行骨髓取样前，将信息表发给患者，并向患者及其亲属解释信息表的内容。 It was also explained that their participation is voluntary, that they will not be identified in the reporting of the findings, and that they may withdraw at any point before the results of the study are published with no penalty or effect on medical care or loss of benefits. The participants were invited to ask questions before getting the written consent. Written informed consent for the study was obtained prior to BM sample collection.

２.２.间充质干细胞的分离和扩增

骨髓标本(5 ~ 10ml)在骨髓标本采集时放入肝素化管中，用于MDS的初步诊断。利用Colter等人开发的粘附协议分离骨髓间充质干细胞[31]．采用Ficoll梯度从骨髓中分离单核细胞(MNCs)。分离的细胞在T-25瓶(Corning)中培养，密度为106在添加10%胎牛血清(Gibco)、2 mM谷氨酰胺(Gibco)和1%抗生素(青霉素-链霉素，Gibco) (MSC完全培养基)的dmemo - ko(敲除)(Gibco)中培养细胞/mL，并在37°C、5% CO的湿化气氛中培养2过夜。4天后，将用废细胞培养液培养的无贴壁细胞从培养瓶中丢弃，用PBS洗涤，并对培养液进行总变化，直到出现80%汇合的贴壁细胞层。每天在倒置显微镜下观察骨髓间充质干细胞的形态。用0.05%胰酶-0.53 mM EDTA与烧瓶底部分离细胞，倒置显微镜下每30秒观察一次。当90%的细胞分离后，加入完全培养基中和胰蛋白酶，离心细胞，将颗粒重悬于预热的完全培养基中。取总活细胞数，在T75中以2 × 10的密度进行传代6 细胞/厘米2．分离的间充质细胞由在体外将培养物低温保存以备将来分析。从对照组中分离间充质干细胞遵循同样的程序。

２.３.形态学和分化分析

每隔3天在相差显微镜下观察培养的间充质干细胞的形态。与从骨髓中分离的间充质干细胞进行形态学比较。

对2-4代间充质干细胞进行分化研究。细胞在间充质完全培养基中培养，直到达到100%融合。成骨分化培养基(DMEM-HG, 10%胎牛血清，100 nM地塞米松，10 mM)诱导成骨分化β-甘油磷酸和0.2 mM抗坏血酸)，孵育21天。媒体每3天更换一次。钙沉积茜素S染色检测成骨分化。细胞用10%福尔马林(Sigma-Aldrich)固定15分钟，用蒸馏水洗涤，茜素红S染色45分钟。

用成脂培养基(DMED-HG、1 mM地塞米松、0.5 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、10μg/mL重组人胰岛素，100 用10%福尔马林固定细胞，并用油红O（Sigma-Aldrich）染色15分钟。

２.４.MSCs扩增后的免疫表型分析

第2代从MDS患者和对照组获得的MSC用胰蛋白酶消化，并使用CD34藻红蛋白（PE）、CD73异硫氰酸荧光素（FITC）、CD90-PE、CD105-FITC和CD45-FITC（BD，美国）通过流式细胞术进行分析。使用FACScalibur流式细胞仪（BD，美国）获取10000个标记细胞并进行分析使用的抗体组合如下：CD34-PE和CD73-FITC、CD90-PE和CD45-FITC以及CD105-FITC。根据MDS亚型RCUD分析阳性CD标记物的表达( ), RCMD ( ), RAEB ( )及控制( )．

2．5．MDS-MSCs的增殖模式
2.5.1。增长曲线和人口翻倍

第3代MDS和对照MSCs在对数生长期接种于0.5 × 10的12孔板中4 细胞/厘米2在MSC完全培养基中培养14天。每隔2天在常规时间从每个样本和对照标本中收集重复培养物，连续14天，使用血球计采用台班蓝排除法测定活细胞计数。绘制对照MSCs生长曲线( )及mds - msc ( )对于每个亚型（RCUD； RCMD; ，RAEB； 和德尔(5问); )．每隔2天收集每个样本细胞，取平均值。曲线上的每个数据点代表每组的平均值。德尔(5 q) ( )每个数据点取两个独立井的平均单元数。

倍增时间计算如下[32]: 在哪里 是文化的开始时间， 是文化的终止时间， 是培养的初始细胞数，和 为培养的最终细胞数。

2.5.2。CFU-F化验

CFU-F测定如前所述[33]．第2代MDS患者和对照组的MSCs(100个/皿)被放置在35 mm组织培养处理的培养皿中，在带抗生素的完全MSC培养基中重复3次，培养14天。培养基每3天更换一次。14天结束时，用PBS清洗菌落，用甲醇固定，用赖特·吉姆萨染色。>50细胞的克隆标记为CFU-F。

2.6。核型分析和荧光原位杂交(鱼)化验

采用g显带技术对MSCs进行核型培养。第3代MSCs按1 × 10播种6 细胞/厘米2在添加10%胎牛血清和2 mM谷氨酰胺的RPMI培养基中培养，直到70-80%融合。设置了两种独立的文化。在每个烧瓶中加入Colcemid®(10 mg/mL)，最终稀释为0.05μg/mL，然后在37°C下培养过夜（12–14 使用秋水仙碱的培养时间针对我们的实验室条件进行了优化。为了优化条件，培养物培养2小时和5小时，隔夜（12-14小时） 加入秋水仙碱后，制备细胞遗传学分析用细胞。秋水仙碱过夜培养产生的可分析中期数量最多，在我们的实验室条件下被认为是MSC的最佳培养条件。细胞用0.05%胰蛋白酶EDTA收获，在37°C下用0.075%的浓度培养 我是KCl，30分钟 min，并用新制备的固定剂（甲醇）固定 : 乙酸3 : 1 v/v）。将细胞悬浮液滴在76–82%湿度的玻片上，制备染色体扩散图，并进行GTL显带。至少分析了20个中期。

核型是根据2013年国际人类细胞遗传学命名系统(ISCN)指南给出的[34]．通过观察两个以上具有相同数量或结构异常的中期展布，可以确定异常克隆的存在。染色体增长≥2，染色体失长≥3。

根据制造商的方案，使用探针XL 5q31.2/5q33 (D-5042-100-OG, Meta Systems, USA)对确诊del(5q)患者的BM-MSCs进行FISH。两个人独立计数至少200个细胞，临界值≥95%。

2.7。统计分析

采用标准统计软件进行统计分析。的t-检验或非参数Mann-WhitneyU试验用于数值比较。

3.结果

３．１．人口统计数据和诊断

MDS患者年龄31 ~ 75岁，中位年龄64.5岁。MDS患者中女性占多数(65%)，男女比例为7:13。研究组包括11例(55%)难治性细胞减少伴单系发育不良(RCUD)患者，3例(15%)难治性贫血伴多母细胞(RAEB)患者，5例(25%)难治性细胞减少伴多系发育不良(RCMD)患者，1例(5%)MDS伴分离del(5q)患者(表)1)．
患者ID MDS亚型 年龄 性 骨髓细胞遗传学 骨髓间充质干细胞的细胞遗传学
14 - 020 RCMD 68 F 46, XX 46, XX, der (3)8］
14 - 058 RCUD 73 F 46, XX 46, XX
14 - 066 RCUD 31 F 染色体随机丢失 ND
14 - 069 RCUD 73 F 46, XX 46, XX
14 - 072 RAEB二世 55 米 失败的 46, XY,德尔(6)(q23q26) [5］
14 - 079 RAEB二世 75 米 失败的 46, XY
14 - 080 RCMD 74 米 46, XY 38 ~ 43, XY,德尔(7)(p21p22) [3.］
14 - 081 德尔(5问) 67 F 46, XX,德尔(5)(q12q34) [5]，46，XX.ish del（5）（q31.2q33）（CDC25C-，EGR1-，RPS14-） 46, XX
del(5) FISH阴性(q31.2q33)
14 - 083 RCUD 54 F 46, XX 46, XX
14 - 086 RCMD 49 F 46, XX,德尔(12)(p12) [3.］ 46, XX
14 - 089 RCUD 70 米 失败的 31~46，XY
14 - 090 RCUD 59 F 46, XX,德尔(11)(q22q24) [7］ 46, XX
15 - 001 RCMD 65 F 46, XX 46, XX
15 - 015 RAEB我 66 米 46, XY 46, XY
15 - 017 RCMD 50 米 46, XY, + 19 33 ~ 46, XY
15 - 018 RCUD 62 米 46, XY 46, XY
RCUD:单系发育不良的难治性细胞减少症，RAEB:母细胞过多的难治性贫血，RCMD:难治性细胞减少症伴多系发育不良，ND:未获得可分析的中期。
表1
MDS患者骨髓和间充质干细胞的细胞遗传学表现。
３．２．MDS-MSCs的形态和分化潜能

所有MDS亚型和对照组的MDS- mscs扩增后显示成纤维细胞样，细长的纺锤形细胞形态(图)1(一))．对照和MDS-MSCs均在15天后形成油红O染色的脂空泡，证实了脂质分化。在添加成脂培养基后第5天，观察到脂空泡的形成。通过茜素S对钙沉积的染色证实，所有MSCs在21天后均显示成骨分化(图)1 (b))．从MDS各亚型中分离得到的MSCs均能分化为成脂分化和成骨分化细胞系。

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(一)
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(b)
图1
正常人和MDS患者间充质干细胞的形态和分化能力。(a)对照组和MDS-MSCs的形态。(1)对照组，(2)RCUD， (3) RCMD， (4) RAEB和(v) MDS del(5q)培养第4天(20x)的P3细胞。(b) (i)未分化的P3间充质干细胞。(ii)和(iv)是对照组和MDS患者茜素红染色的成骨细胞(14-080)(4x)。(iii)和(v)分别为经油红O染色向成脂细胞分化的对照MSCs和MDS-MSCs (40x)。
３．３．扩增后的MSC免疫表型

所有患者和对照组的MSCs CD90(≥95%)、CD73(≥80%)和CD105(≥75%)阳性，CD34和CD45(<2%)阴性(补充图) 和 (可在网上获得的补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/8012716)为具有代表性的FACs图)。根据MDS的亚型分析阳性标记物的表达情况，将每个亚型的表达谱分为:阴性:0-2%，低:3-20%，中21-50%，中高:51-80%，高:>80%(图)2).从对照组和MDS亚型分离的所有MSC显示CD90的高阳性率，阳性细胞的平均百分比>95%（对照组： %, RCUD: %, RCMD: %, RAEB: %)和高荧光强度(第四个对数十年)(补充图 )．对于CD73，平均表达频率为对照 %, RCMD %, RCUD %, RAEB %在RCMD中，与其他亚型相比，阳性细胞的百分比较低，并且CD73的表达水平在强度方面存在差异（101-10年4强度单位)。RCMD中CD105的表达(>92.6±1.2%)明显高于对照组( %)，RCUD( %)和RAEB ( %)(图2)．


图2
流式细胞术分析P2 MSCs扩增后阳性CD标记物的表达情况。结果按亚型进行分析:RCUD ( ), RCMD ( ), RAEB ( )及控制( )．柱状图表示阳性细胞的平均百分比±标准误差。表达谱分为阴性:0-2%，低:3-20%，中21-50%，中高:51-80%，高:>80%。所有从对照和MDS亚型分离的MSCs均显示CD90高阳性。控制: %, RCUD: %, RCMD: %, RAEB: %．RCMD中CD73表达较低( %)与对照组、RCUD和RAEB患者( %， %，及 %,职责)。RCMD中CD105的表达(>92.6±1.2%)明显高于对照组( %)和RCUD ( %)及RAEB ( %)．
3．4．MDS-MSCs的增殖模式

MDS-MSCs与对照MSCs的生长曲线在培养1-2天出现滞后期，在2-10天达到指数级增长，在10-14天出现平稳期(图)3(一个))．种群倍增次数(PDT)为 控制时间(h) h为MDS-MSCs ( )．每个亚型的pdt为RCUD h, RCMD h, RAEB h和德尔(5问) h(图3 (b))．MDS亚型获得的PDT与对照组获得的PDT无显著差异( )．MDS-MSCs的CFU-F平均频率为 /100个细胞（范围：7-41； )，而对照组则为 /100单元(范围:8-35; )(补充图 )．MDS-MSCs的CFU-F频率与对照MSCs无显著差异( )．

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(一)
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(b)
图3
MDS-MSCs的增殖模式。（a）从MDS患者和对照MSCs分离的间充质干细胞的生长曲线。（i）对照MSCs之间的比较( )及mds - msc ( )（ii）RCUD之间的增长比较( ), RCMD ( ), RAEB ( )、德尔(5 q) ( )和对照组间充质干细胞。对于每个样本，每2天定期收集双孔细胞并取平均值。每个数据点表示各组平均值±SEM。德尔(5 q) ( )，每个数据点表示两独立井的细胞数平均值±SE。(b)平均种群倍增时间。(i)对照组和MDS-MSCs的PDT±SE平均值。(ii)对照组、RCUD、RCMD、RAEB和del的PDT±SE平均值(5q)。PDT平均值在对照组和MDS-MSCs之间以及患者亚组之间均无显著性差异( )．
3．5．培养的MDS-MSCs的细胞遗传学分析

63%(11/16)的患者间充质干细胞存在正常核型。31%(5/16)的MSCs显示异常核型(表1)，包括染色体的随机丢失。3 / 5的RCMD患者(60%)，1/6的RCUD患者(16.7%)，1/3的RAEB患者(33.3%)的MSCs中存在这些异常。在16个样本中，有一个RCUD患者的MSCs培养未能产生任何可分析的中期扩散。

在第3、6和7号染色体上可以看到畸变(图)4(一))．2例RCMD和1例RAEB患者出现结构异常。1例诊断为RCMD的患者被发现有3号染色体的衍生物，核型为46,XX,der(3)。另1例RCMD患者的MSCs在7号染色体短臂(38~43,XY,del(7)(p21p22))缺失，且大部分中期扩散区染色体随机缺失。核型异常的RAEB患者有46,XY,del(6)(q23q26)。这些患者在BM核型中未表现出染色体畸变。4例骨髓间充质干细胞核型异常的MDS患者，除1例患者染色体随机丢失外，未表现出相同或任何结构异常(15-017)。del 5q患者(其BM核型和FISH均为5q缺失阳性)的MSCs的核型正常(46,XX)，这一发现通过对MSCs的FISH分析得到了证实，并伴有两个红色和两个绿色信号(图)4 (b))在大多数MSC扩散中观察到染色体物质的丢失。对照组培养扩增的MSC显示正常核型。

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图4
MDS衍生间充质干细胞的细胞遗传学结果。(a) MDS-MSCs染色体异常。3例患者出现明显的染色体异常:14-020 46例，XX、der(3); 14-072 46例，XY、del(6)(q23q26); 14-080 38~43例，XY、del(7)(p21p22)。(b) del(5q)患者(14-081)骨髓(i)和MSCs (ii)的FISH分析。骨髓含有两个无性系;正常细胞显示两个红色和两个绿色信号，异常克隆细胞显示一个红色和一个绿色信号。该患者的间充质干细胞显示两个红色和两个绿色信号，表明del(5)(q31.2q33)的缺失。

4.讨论

骨髓间充质干细胞是骨髓微环境中的关键成分，通过直接细胞相互作用和分泌调节因子来调节造血干细胞的功能生态位[2- - - - - -4]一些研究表明，来源于MDS骨髓的基质细胞层是正常的，而其他的则表明它们无法维持正常的造血[10- - - - - -16，35- - - - - -38]．此外，已有报道称，不同种族之间的疾病生物学和基因概况存在差异[24- - - - - -28]．因此，进一步研究MDS骨髓间充质干细胞是否正常具有重要意义。研究来自不同人群的MDS- mscs的生物学特性，肯定会扩大我们目前对复杂骨髓基质及其在MDS病理生理中的作用的认识。因此，为了阐明MDS衍生的骨髓间充质干细胞的表型和细胞遗传学特征，并比较不同MDS亚型间充质干细胞的这些特征，我们对一组新诊断的骨髓间充质干细胞进行了这项研究新创MDS患者。本研究的对象为南亚MDS组，斯里兰卡原发性MDS患者，既往文献中未见报道。因此，该研究通过提供尚未报道的人群数据，有助于全球对间充质干细胞的了解。

根据斯里兰卡卫生部发表的《国家癌症登记》最新出版物，斯里兰卡2007年报告了69例MDS患者[39]．研究以具有代表性的样本( 斯里兰卡语新创2013-2015年期间，MDS患者向科伦坡地区四家主要医院报告。

根据国际细胞治疗学会(ISCT)的定义，评估分离的MDS-MSCs和对照MSCs的特征[1]．培养扩增的MDS-MSCs表现出可塑性粘附和纺锤体样成纤维细胞形态。与已发表的文献一致，MDS-MSCs的细胞形态与对照MSCs和文献中报道的形态相似[1，2，31]．此外，来自MDS亚型和对照组的间充质干细胞能够分化成成骨和成脂系。结果表明，MDS-MSCs在细胞形态和分化能力方面与对照组具有可比性，并与之前在其他人群中进行的研究一致[9，12，14，15]．是不可能维持的两个主要文化(病人数字13 - 014和14 - 054)被污染后4 - 5天,其他两个文化(病人数字13 - 001和14 - 050,其形态学评估和分化研究)将污染通道2和排除在进一步的实验。

关于MDS衍生的间充质干细胞功能特性的现有数据是矛盾的。有研究表明，来自MDS患者的MSC层在培养中能支持单核细胞或造血祖细胞生长至少数周[10，12，15]．Flores-Figueroa等人在2008年的研究表明，MDS来源的MSCs能够像正常MSCs一样有效地维持造血细胞的生长和发育，这可以从骨髓细胞在整个培养期间的产生中看出[15]．相反，其他一些研究表明MDS的MSCs与健康的MSCs相比，表现出了缺陷的造血支持能力[13，37，40]．许多研究表明，与健康细胞相比，MDS来源的MSCs具有缺陷的生长特性[14，37，40- - - - - -42]．从MDS患者分离的间充质干细胞以前显示出随着群体倍增时间的增加而生长和增殖能力下降，随着细胞凋亡的增加而增殖率降低[35- - - - - -38]．相反，在我们的研究中，MDS-MSCs的生长特性在生长速率和pdt方面与对照MSCs相似。MDS-MSCs与对照MSCs之间无显著差异( )．此外，所有亚型的MSCs在P3细胞播种后15 - 48小时内粘附在烧瓶上，从第2天到第10天呈指数增长。我们没有观察到显著的变化在体外来源于MDS亚型（RCUD、RCMD、RAEB和del（5q））的骨髓间充质干细胞在PDT中的生长特征( )．此外，P2 MSCs的CFU-F频率与对照组MSCs无显著差异( )．

乳糜泻标记物在血液病中起重要作用[19]研究报告了在疾病状态下骨髓间充质干细胞表面CD标记物的不同表达[19，20.]．研究发现CD73可能参与了通过A2AR ( 腺苷受体)信号[43]．CD105是一种糖蛋白在血管生成中有作用并且与tgf - β信号有很强的相互作用因此在癌症发展中有作用[44]．这些标志物在疾病条件下的表达模式值得关注，因为它们在癌症发展中的调节作用和在癌症治疗中的可能应用[45]．而一些研究表明MDS-MSCs表达正常水平的CD73、CD90和CD105 [14，15一些研究人员观察到MDS-MSCs中CD90和CD105表达水平下降[19，20.]．Campioni等人在2006年报道，与正常骨髓间充质干细胞相比，培养的血液恶性肿瘤患者骨髓间充质干细胞表达CD90和CD105的频率较低[19在另一项研究中，他们提出骨髓间充质干细胞低CD90表达可能与骨髓间充质干细胞对T细胞增殖的免疫调节特性不足有关[20.]．然而，在我们的研究中，P2 MDS-MSCs表达CD90的细胞比例非常高(>95%)，与对照细胞相当。此外，MDS-MSCs表达的CD90的平均荧光强度也非常高(第4个对数十年)。RCMD-MSCs CD73表达频率低，CD105表达频率高，表达水平有差异(101-10年4强度单位)，与对照组MSCs和其他MDS亚型MSCs进行比较。阳性标志物表达模式的变化可能在MDS的发病机制中具有临床意义。然而，这些发现需要在更多的患者中得到验证。文献报道的MSC免疫表型不一致可能是由于不同实验室使用的培养基等培养条件的不同，也可能是MDS患者的异质性造成的。

MDS中MSCs的细胞遗传学特征对确定MDS中骨髓间质功能差异的原因非常重要。本文分析了培养扩增的MDS-MSCs的核型。为了优化间充质干细胞的核型分析方案，我们测试了不同的秋水仙素暴露时间:2小时、5小时和过夜(12-14小时)。一夜(12-14小时)与秋密酸的培养产生了最多的可分析中期扩散，被认为是我们实验室条件下MSCs的最佳培养条件。这一结果也支持Muntión等人的发现，他们发现15小时秋cemid暴露时间是MSC核型的最佳时间[46]．

在没有BM核型异常的MDS-MSCs中检测染色体异常是本研究的重要发现。这些异常在RCMD患者中尤其明显(60%，3/5)。在研究的MSCs中，31%(5/16)的细胞遗传学异常，包括染色体丢失的结构和数量异常。一些研究发现MDS衍生的间充质干细胞中存在结构性染色体畸变的百分比很低[21，22]，但也有其他报道声称MDS中异常间充质干细胞的比例更高[12，23]．Blau等人在2011年对MDS/AML患者的研究中发现，存在遗传异常的患者比例低至16% [21]．Kim等研究发现，MDS患者中骨髓基质细胞中染色体畸变检测率仅为5% (1/21)[22]．相比之下，Song等人在2012年观察到MDS衍生的MSCs中较高的细胞遗传畸变率(68% (15/22))[23]．Flores-Figueroa的一项研究报告，55.5%(5/9)的MDS-MSCs具有细胞遗传学异常[12]．在我们的患者组中，细胞遗传畸变的检测为中度(31%)，高于之前的一些研究[21，22，但低于其他一些报告[12，23]．

观察到的结构异常包括2例RCMD患者的46,XX,der(3)和46,XY,del(7)(p21p22)和1例RAEB II患者的46,XY,del(6)(q23q26)。很少有研究表明MSCs的结构遗传畸变与MDS有关。Blau等在2007年进行的一项描述MSCs染色体异常的研究报告了MSCs的结构异常，包括一个衍生物7和del(3)(p21) [9]在另一项研究中，同一组在MDS/AML MSC人群中发现del（7q）[21]．MDS中发现HSC室3号和7号染色体畸变[47]．最近的研究表明，3号染色体发生互换或倒置的MDS患者发展为AML的风险更高[47]．6q缺失导致肿瘤抑制基因缺失，常见于淋巴细胞恶性肿瘤[47]．在这里，我们报道了MDS- mscs中存在异常的3号染色体和6号和7号染色体的缺失，这可能对这些细胞在造血和MDS发病机制中的功能有影响[9]．

以前的研究报道，细胞遗传学异常主要存在于造血对等体染色体异常的MSCs中[9，12]．也有报道称正常核型患者间充质干细胞的畸变率较低(33%)[22]．有趣的是，在本研究中，我们观察到了正常BM核型MDS患者间充质干细胞的染色体畸变。同样，这三名在BM核型中出现染色体异常的患者在MSC核型中没有显示细胞遗传学改变。这包括del(5q)患者，其MSCs显示正常核型，FISH为5q31.2/5q33缺失阴性。因此，我们认为MSCs中存在染色体畸变可以被视为一个独立事件，我们的研究结果可能不支持MDS中MSCs来自相同的“肿瘤克隆”的观点，尽管这种可能性不能排除。

我们还观察到，大多数扩散显示随机丢失染色体和染色体物质的损失。这在三个样本(RCUD、RCMD和RAEB)中特别明显，其中超过90%的扩散被捕获的染色体缺失。Flores-Figueroa等和Blau等在他们的研究中报道了MDS衍生间质干细胞中存在染色体畸变，包括染色体物质的丢失[9，12]．染色体物质的丢失可能是MDS衍生间充质干细胞遗传不稳定性的证据，并可能提示其可能参与MDS的发病机制。

据报道，从正常骨髓培养的MSCs经过多次传代后显示正常的核型[48]．然而，我们不排除在不同培养条件下发生基因组变化的可能性。因此，为了避免这种可能性，从含有更均匀细胞群的第3代细胞中设置两个独立的培养物。

5.结论

本研究结果显示，间充质干细胞形态、间充质CD标记物阳性及分化能力均未发生改变新创MDS。MDS-MSCs表现出与BM核型无关的核型异常。与对照组和其他亚型间充质干细胞相比，RCMD患者在低CD73和高CD105表达频率的间充质干细胞中表现出更高程度的异常。此外，与之前的一些报道相比，我们发现所有亚型的骨髓间充质干细胞上的CD90表达都非常高，与对照的骨髓间充质干细胞相当。MDS间质细胞中存在明显的遗传异常，与相应的造血异常相比，这支持了MDS间质间室遗传异常的发生可能是造血异常的自发事件的观点。虽然本研究支持并证实了先前发表的MDS- mscs形态学、免疫表型和分化能力的数据，但本研究也强调了单独研究MDS亚型的重要性，因为在CD标记物表达水平和细胞遗传学谱中观察到MDS亚型依赖的变异。尽管可变性的方法隔离和扩张或文化条件不能排除矛盾的原因来自不同MDS-MSC研究小组的数据的一个主要原因是我们认为的异质性是MDS疾病生物学和MDS亚型的不同病理生理学。因此，需要越来越多的MDS衍生间充质干细胞不同人群的数据和MDS亚型的数据，以澄清现有的争议。综上所述，本研究对扩大我们对MDS间充质干细胞形态和临床异质性的认识具有重要意义。

相互竞争的利益

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

这项研究得到了斯里兰卡大学资助委员会的资助。作者要感谢科伦坡大学医学院人类遗传学部门的工作人员、斯里兰卡国立医院、科伦坡北方教学医院、拉加马、科伦坡南方教学医院、卡鲁博维拉、国家癌症研究所Maharagama以及血液专家顾问。

补充材料

补充图1和图2显示了来自代表性MDS患者的骨髓间充质干细胞的CD标记物表达图。前向散射与侧向散射点图显示了MSC群体的门（R1）。MDS-MSC对CD73、CD90和CD105呈阳性，对CD34和CD45表面标记物呈阴性。

MDS-MSCs和对照mscs的CFU-F检测结果见补充图3。MDS-MSCs的CFU-F平均频率为19.63±4.91(范围:7-41;N = 16)，对照组为17.93±4.25(范围:8-35;n = 5)。MDS-MSCs的CFU-F频率与对照MSCs无显著性差异(p > 0.05)。

  1. 补充材料

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