原发性上皮性卵巢癌患者sPRR的预测和预后价值

摘要

目的．本研究的目的是分析可溶性(前)肾素受体(sPRR)作为原发性上皮性卵巢癌(EOC)患者临床病理结局的生物标志物的预测和预后作用。作为肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)的一部分，已知其活性在卵巢癌患者中增加，因此sPRR与卵巢癌的关系需要进一步研究。患者和方法. 在这项研究中，纳入了我们机构2000年至2011年间197例原发性EOC患者。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定术前血清sPRR。分析与临床病理结果的相关性，并将患者和健康标本的血清sPRR水平进行比较。Kaplan-Meier和logistic/Cox回归评估了标记物对无进展生存率（PFS）和总生存率（OS）的影响。结果．目前还没有证据证明sPRR水平与临床病理因素和预后数据之间的相关性。患者和对照组的sPRR分布正常。结论. sPRR在EOC中似乎没有预测、预后或诊断价值。由于RAS的几个因素可能表明了癌症事件，sPRR似乎并没有受到影响。

1.背景

上皮性卵巢癌（EOC）是妇科癌症的主要死亡原因。其不良预后取决于各种因素：（a）近70%的相关妇女在诊断时已进入FIGO晚期，并伴有盆腔外转移[1， (b)超过20%的患者对化疗耐药，(c)此外，EOC的分子复杂性使得靶向化疗和有效的诊断标志物难以建立，(d)超过60%的患者会复发[2]目前的标准治疗方法是先进行去瘤手术，然后进行铂类紫杉烷化疗。手术后，记录残余肿瘤的最大直径，并将FIGO分期作为诊断时最强的预后因素[3.].术前腹水[4]以及减积手术和化疗的时间范围[5]ROVAR（卵巢癌复发风险）评分通过确定术前CA-125、FIGO分期、组织学分级和治疗后是否存在残余疾病，将EOC患者分为三个风险组[2]对复发的敏感性和特异性分别为94%和61%。

随着EOC的肿瘤发生及其特定的组织病理学和分子分类的确定，针对不同类型的EOC的特定疗法的发展成为可能。与这些亚组的预测或预后相关性也可能发生。

因此，一方面需要强有力的早期诊断标志物，另一方面需要预测和预后标志物为患者提供合适的靶向治疗。它们可用于确定对这些妇女最有利的治疗管理。因此，随机肿瘤标记物和已发现在EOC环境中上调的标记物是研究的重点。在本研究中，我们测定了（前）肾素受体（PRR）的可溶性形式。

(pro)肾素受体（PRR）在人体内有四种主要功能。最初，Ludwig等人在1998年将该受体描述为V-ATP酶的一种成分，并称为ATP6M8-9[6]后来，Nguyen等人在2002年发现，将肾素或肾素原与该受体连接（a）启动组织肾素-血管紧张素系统（RAS）的级联反应，血管紧张素原转化为血管紧张素I，（b）还启动细胞内丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径[7]．在最近的研究中，PRR被揭示为V-ATPase和LRP6之间的一种接合蛋白，LRP6是Wnt受体复合体的一部分[8]．这种Wnt级联反应已知会影响肿瘤发生[9]心肾终末器官损害[10]．

由于有研究证明卵巢癌患者的RAS活性增加，我们决定也研究级联起始受体PRR。这种活性增加的特点是血管紧张素II 1型受体（AGTR1），它在EOC中具有预后作用[11]，或在癌症患者中上调的血管紧张素转换酶（ACE）[12]．可溶性形式(sPRR)的存在使受体更有可能成为一个容易量化的标记。研究证明，坎地沙坦在体外和小鼠体内阻断AGTR1可降低腹膜癌病，降低腹水VEGF浓度，防止血管生成[13]．因此，应该调查sPRR可能产生的类似影响。

2.材料和方法

2.1. 患者

本研究纳入了197例原发性卵巢癌患者。2000年至2011年间，在细胞减灭术前采集了血清样本。收集了这些样本，卵巢癌肿瘤库定期更新患者的数据(http://www.toc-network.de/).TOC是柏林大学Virchow诊所妇科部的一个多中心项目，始于2000年，至今仍在运行。该诊所强调卵巢癌的多模式治疗已超过15年。本研究中所有患者的随访时间截至2013年，平均44.8个月（范围3-114）只会以一个病人的死亡而告终。

诊断时患者的中位年龄为60岁，从28岁到92岁不等。181名患者（91.9%）在出现时已经患有晚期肿瘤疾病（FIGO III/IV）。所有患者均接受了去瘤手术治疗，170名患者（86.3%）平均接受了6.2个周期的化疗（范围为1-16）154名（78.2%）妇女接受了紫杉醇和卡铂治疗，11名（5.6%）妇女接受了其他含铂联合治疗，5名患者（2.5%）接受了免疫治疗。

为了进行比较，在哥廷根大学医学中心收集了132份来自健康无症状妇女的标本。所有血清标本均采用相同的方案处理。他们的平均年龄为57.5岁（范围42-83岁）。

血清sPRR水平由CellTrend公司(http://www.celltrend.de/)用ELISA。

2．2.ELISA

为了确定sPRR CellTrend，使用直接夹心ELISA。将特异性抗体预涂在微孔板上。将样品和标准品移液到孔中并培养120分钟。随后，结合存在的任何sPRR。洗涤后，添加生物素标记的抗体并再次培养60分钟。然后再次洗涤随后加入酶连接的链霉亲和素。培养和洗涤60分钟后，用移液管将底物溶液移到孔中。培养30分钟后，形成彩色溶液。在450℃下测量吸收 nm带有ELISA阅读器，其行为与sPRR浓度成比例。sPRR水平以U/ml标记。

２．３．统计方法

用于统计评估IBM SPSS Statistics ver。使用了22 (SPSS Inc.， Chicago, IL, USA)。斯皮尔曼氏，克鲁斯卡尔-沃利斯试验，还有曼-惠特尼试验以确定sPRR水平与临床病理因素之间以及患者与健康对照组之间的关系。的α-level假设为<0.05。Kaplan-Meier分析提供了四分之一的估计。生存分布已与log-rank (Mantel-Cox)进行了比较。任何临床或组织学证实的癌症复发都被定义为计算无进展生存期(PFS)的事件。总生存期(OS)的定义是诊断日期与患者死亡之间的时间间隔。

原发性EOC的临床和病理因素为腹水肿块、FIGO分型、诊断年龄、术后肿瘤残留肿块、WHO组织学分级、组织学、对铂基治疗的反应、PFS和OS。

伦理批准获得了柏林Charité医科大学伦理委员会（编号207/2003）、哥廷根大学医学中心（编号EK 22/2/04）的批准。患者在登记和血清样本采集前提供书面知情同意书。

3.结果

在本研究中，我们调查了197例原发性EOC患者的血清样本。该组的中位年龄为60岁，从28岁到92岁不等。91.9%的患者为FIGO晚期III期或IV期。组织学分布、组织学分级、术前腹水体积、腹膜癌病是否存在见表1．

所有患者取血清后均行细胞还原手术，新辅助化疗2例(1.02%)，完成手术35例(17.8%)，间隔手术2例(1.02%)。103例(52.3%)女性术后无肿瘤残留肿块;22例(11.2%)不可切除肿瘤最大直径大于2cm。8例患者(4.1%)死于术后并发症，截至目前共128例患者(65%)死亡。

171例患者接受了化疗。116例(58.9%)患者对铂敏感，根据GCIG (Gyneacologic Cancer InterGroup)标准铂类化疗后6个月内无复发。

3.1. 卵巢癌患者与健康对照组的sPRR表达

EOC患者与对照组血清sPRR水平见表2.这些值与癌症的存在无显著相关性。图1说明了这种关系。

３．２．卵巢癌患者中sPRR表达与临床、预后和组织学因素的相关性研究

的与临床病理因素的相关性值见表3.。与sPRR水平没有显著相关性。

３．３．sPRR表达对生存的影响

全组无进展生存期中位数为14个月，范围为0 ~ 114个月。PFS的时间定义为手术至复发之间的时间。此外，整个组的中位OS为40个月，范围从0.5个月到114个月。os时间定义为诊断到死亡之间的时间。1年无进展生存率为61%，2年无进展生存率为30%，5年后有6%的患者无进展。其次，1年OS率为79%，2年OS率为60%，5年后为17%。8年后，3例患者(1.5%)没有进展，6例患者(3%)没有死亡。表格4显示了sPRR水平的分布、OS/PFS的平均值和中位数以及死亡/进展的数量。

对数秩检验显示OS或PFS与sPRR水平无显著关系（表1）5，数字2和3.）.同样，在当前四分位数的两两比较中也没有相关性。

4.讨论

本研究旨在分析EOC患者可能的生物标志物sPRR与多种临床和病理因素以及无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)的相关性。

目前尚无关于卵巢癌患者sPRR的临床意义及其与生存关系的研究报道。但可能存在相关性，因为在肾素-血管紧张素系统(RAS)、wnt级联和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的激活中，sPRR是一个重要的因素，这些都被证明在卵巢癌中上调。

4.1. 肾素-血管紧张素系统与肿瘤发生

将前肾上腺素与PRR连接导致血管紧张素原转化为血管紧张素I这可以启动RAS [14]．众所周知，RAS可能在人类子宫内膜、卵巢和胎盘中被激活，无论是在生理情况下还是在恶性肿瘤中[15- - - - - -17]．Deshayes和Nahmias的综述表明RAS可能是血管生成、细胞增殖和凋亡的一部分[18]．在卵巢癌患者中，已知血管紧张素I受体(AT1R)上调随着肿瘤侵袭性的增加而增加[13]．Pupilli等人发现AT1R的激活刺激血管内皮生长因子(VEGF)，可能导致恶性疾病中的血管新生[19]．血管紧张素I似乎会上调细胞凋亡并阻止血管生成和增殖，而血管紧张素II则会拮抗这些作用[20]．RAS平衡中的一种破坏因子可能通过新生血管、生长和转移增加肿瘤发生[21]．Lever等人发现ACE抑制剂可以预防癌症，因为在3年的随访中，与接受其他高血压药物的患者相比，女性癌症的相对风险为0.37 (0.12-0.87)[22]．

Ino等人对67例卵巢癌组织进行了AT1R免疫组化研究，85%的病例表达AT1R。AT1R阳性组织的患者预后明显较差()比染色阴性的要多。AT1R表达也与VEGF增加相关[11]．Suganuma等人的一项研究。对99例卵巢癌组织进行AT1R免疫组化分析。在本研究中，当AT1R表达时，VEGF也显著升高，导致侵袭性增强。在移植小鼠中使用坎地沙坦可减少腹膜扩散，降低腹水VEGF浓度，并抑制肿瘤血管生成[13]．

关于血管紧张素转换酶（ACE），Beyazit等人测量了41名患者和19名对照组的血清ACE水平。卵巢癌患者的ACE水平显著上调。FIGO分期或病理亚型之间没有可识别的相关性[12]．

4.2.Wnt/β-Catenin级联与卵巢癌无进展生存

除了将血管紧张素原转化为血管紧张素I外，PRR还能够启动细胞内的级联反应，从激活早幼粒细胞白血病锌指(PLZF)蛋白开始，到产生Wnt靶基因结束。wnt级联是细胞-细胞通信的关键中介，众所周知，它能促进细胞增殖、分化、迁移和组织稳态[23]．

Dai等人通过对120例卵巢癌肿瘤进行差异甲基化杂交，发现了卵巢癌患者wnt级联基因上调的证据。他们确定了两组基因座推迟他们的无进展生存(HR = 2.09;95% CI(1.39, 3.15))，且与卵巢癌患者病理因素显著相关[24]．

4.3.耐药卵巢癌中丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）增加

prorenin受体的结合也通过激活MAPK启动细胞外信号调节激酶1/2 (Erk1/2)。众所周知，Erk1/2通过转化生长因子-增加细胞增殖并上调促纤维化因子β1 (TGF -β1) (25，26]．

Xie等人的一项研究调查了MAPK在20个卵巢癌组织中对顺铂敏感性的影响。对这些组织的免疫组化研究显示，在耐药肿瘤中MAPK水平显著升高[27]．

4.4。限制

由于sPRR是RAS的一部分，高血压可能是一个混杂因素。Nguyen等人表明，高血压患者的肾素原受体水平没有偏离健康对照组的水平[28]．但ACE抑制剂似乎对sPRR水平有影响。用RAS阻断药物治疗的患者的sPRR水平比用其他药物治疗的患者高约12%。由于血管紧张素转换酶抑制剂是心脏病或肾病患者的首选药物，而这些疾病也与增加的sPRR水平相关，混杂因素尚不明确。

众所周知，高数量的PRR位于组织取决于其灌注。这可能意味着血清水平不能像组织分析那样良好地显示水平的增加。

4.5。进一步的调查

目前还没有研究分析PRR对卵巢癌中RAS、Wnt信号或MAPK激活的影响。当我们分析患者血清中的可溶性形式时，进一步的研究可能是，例如，免疫组化方法或Western Blot，以证明PRR直接存在于卵巢癌组织中。前瞻性的卵巢癌需要一种可以在手术后分析的预测或预后指标来评估最佳的个体化治疗。

5.结论

本研究未显示卵巢癌患者血清中sPRR的预测、预后或诊断价值。生存分析中无预后价值。需要进一步研究分析卵巢癌组织中的受体，以确定PRR在卵巢癌发生中的作用。

信息披露

实验和临床研究中心是由Max-Delbruck分子医学中心、Charité大学肾脏病系和HELIOS-Kliniken Berlin Buch, Berlin, Germany联合成立的。

竞争利益

Harald Heidecke是CellTrend GmbH的董事，该公司是一家合同研究机构，销售sPRR ELISA。

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