体外马司利尼酸苄酰胺衍生物对两种黑色素瘤细胞株的抗菌能力和细胞毒性评价

摘要

山楂酸是一种从橄榄中提取的五环三萜类化合物，已经有系统报道具有多种治疗作用，如抗肿瘤、抗糖尿病、抗氧化、抗炎、抗寄生虫和抗病毒特性。近年来，山楂酸的新衍生物不断涌现，拓宽了山楂酸的生物活性谱，改进了现有的山楂酸衍生物。本研究旨在进行在体外评估(i)山楂酸的苄胺衍生物(" EM2 ")(苄基(2α3β(2,3-二乙酰氧基-olean-12-en-28-amide)对B164A5鼠黑素瘤和A375人恶性黑素瘤细胞系的作用以及(ii)化合物对几种菌株的抗菌活性。我们获得了EM2的剂量依赖性细胞毒性效应，这与小鼠细胞系特别相关。对10株细菌进行了EM2抑菌试验蜡样芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌，化脓性链球菌，肺炎链球菌，粪肠球菌，大肠杆菌，鼠疫enterocolitica，肺炎克雷伯菌，奇异变形杆菌,铜绿假单胞菌和一个真菌白色念珠菌．记录了显著的抗菌作用酿脓链球菌和金黄色葡萄球菌．

1.介绍

山楂酸(MA)，一种天然的三萜(图1(一))，主要由橄榄(木犀油在过去的几十年中，已对其多种有益作用进行了系统研究，包括抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗糖尿病、心脏保护、抗寄生虫和抗病毒作用[1，2]．

这种化合物首先在Crataegus oxyacanthal . (1]，并进一步在其他几种植物、蔬菜(如菠菜和茄子)、芳香草本植物(如罗勒)和水果(如柑橘、苹果皮和石榴)中发现[1，3.].Gaforio小组报告小鼠口服给药后没有副作用，表明MA可被视为一种营养药物[4]．

衍生化用于获得活性提高，副作用减少的化合物，这将允许进一步扩大其适用性。一些山楂酸衍生物已经在不同的癌细胞系中进行了促凋亡特性的测试，包括人类甲状腺癌、卵巢癌、肺癌、结直肠腺癌、脂肪肉瘤、黑色素瘤和乳腺癌细胞[5]．一些衍生物对肿瘤细胞和非肿瘤细胞表现出更高的细胞毒性和选择性。一种含有苄胺结构的乙酰化山楂酸衍生物(“EM2”)已被报道对肿瘤细胞具有抑制活性和选择性，同时对成纤维细胞具有较低的细胞毒性;这些观察结果值得进一步研究[5]．

“EM2”（苄基（2α3β(图)2,3-diacetoxy-olean-12-en-28-amide)1 (b))是根据山楂酸乙酰化后形成苄胺的方法获得的，如前所述[5]．

同样，有报道称EM2对518A2人黑色素瘤细胞系具有细胞毒性作用₅₀值2 μM，因此比母体化合物MA [5]．Antonio Martinez小组测试了几种山楂酸衍生物对B16-F10小鼠黑色素瘤细胞系的作用，得出结论，其中一些衍生物在细胞凋亡方面表现出了强大的作用[6]．

恶性黑色素瘤是最具侵袭性的肿瘤之一[7]在过去的几十年里，据报道黑色素瘤的发病率以惊人的速度增加[8，9]．而原位局部侵入性黑素瘤可以通过手术治愈，而晚期黑素瘤则很难治疗，而且常常是致命的[8]．此外，恶性黑色素瘤是一种快速演变的肿瘤，转移风险增加[10]．因此，治疗黑色素瘤的辅助方法可能包括天然化合物，单独或联合使用。

除了恶性疾病患病率的上升，细菌对抗生素的耐药性是另一个世界性的挑战，因为细菌的不断进化和新型抗菌剂开发的减少[11]．经典抗生素的替代品是天然化合物，目前正在研究的五环三萜类[12]．

本研究旨在对EM2进行表征在体外黑色素瘤细胞的细胞毒性潜能和抗菌作用。

2.材料和方法

2．1．物质

山楂酸(MA)及其衍生物(EM2)的化学结构见图1．

EM2的制备与之前报道的一样。简而言之，将可食用的、去核的绿色橄榄(6公斤盐水溶液)压碎，干燥(110°C, 24 h)，用甲醇(5 × 2 L，每个4天)提取。经层析(硅胶，正己烷/乙酸乙酯，1:1)得到MA，再经重结晶(乙酸乙酯)(5.65 g，干质量的0.36%)[13，14]．

MA (1.2 g, 2.54 mmol)在干二氯甲烷(50 mL)中与乙酸酐(0.96 mL, 10.16 mmol)和净乙酰化_3.(0.96 mL, 10.16 mmol)经常规检查和重结晶(2α3β) 2、3-diacetoxy-olean-12-en-28-acid(化合物1) [15]；232-234摄氏度[16]．复合1(200 mg, 0.36 mmol)溶于干DCM和THF(1:1)中;0℃下加入亚硫酰氯和TEA(3滴)。20分钟后，将溶液加热至室温。减压去除溶剂，将残渣溶解在DCM中，加入2ml苄胺(18.4 mmol)和TEA(3滴)。反应(TLC)完成后，将混合物倒入冰水中;沉淀物被过滤掉，用水清洗，然后进行色谱(硅胶，正己烷/乙酸乙酯)。苄(2α3β) 2,3-二乙酰氧基齐墩-12-烯-28-酰胺(EM2);

DMSO(二甲基亚砜，溶剂)购自Sigma-Aldrich公司。

2．2．MTT细胞毒性试验

B164A5小鼠黑色素瘤细胞和A375人类恶性黑色素瘤细胞（Sigma-Aldrich（ECACC和Sigma-Aldrich，原产日本，英国））在杜尔贝科改良的Eagle培养基（DMEM；Gibco BRL，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）中生长，并添加10%热灭活胎牛血清（FCS；PromoCell，德国海德堡）和1%青霉素/链霉素混合物（Pen/Strep，10000 IU/mL；德国海德堡PromoCell），在含5%CO的增湿大气中₂, 37°C。细胞以6000个/孔的密度接种在96孔微孔板上，过夜后贴于孔底。EM2的添加浓度如下:12.5μ25米,μ50米,μ米,100μM，孵育72 h。井内MTT浓度为:10μ每孔中加入L的5 mg/mL MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑)溶液(Sigma-Aldrich)(井中最终体积为100)μL).完整的线粒体还原酶在接触4小时内转化和沉淀MTT为蓝色晶体。沉淀的晶体溶于100毫升μL裂解液由制造商(Sigma-Aldrich)提供。最后，在570 nm处用微版阅读器(Bio-Rad Mark微版分光光度计)对还原的MTT进行分光光度分析。所有在体外实验在三个至少有五个平行孔的微板上进行。采用DMSO溶剂制备待测物质的原液，最高DMSO浓度(0.3%)的培养基对细胞无明显的细胞毒作用。

２．３．抗菌和抗真菌性能的评估

检测了EM2对10株细菌的抑菌活性蜡样芽孢杆菌（ATCC 14579）、金黄色葡萄球菌(写明ATCC 25923),酿脓链球菌(写明ATCC 19615)、肺炎链球菌（ATCC 49619）粪肠球菌(写明ATCC 29212),大肠杆菌(写明ATCC 25922),鼠疫enterocolitica（ATCC 23715），肺炎克雷伯菌(写明ATCC 700603),奇异变形杆菌(写明ATCC 25933)铜绿假单胞菌(ATCC 27853)和一株真菌，白色念珠菌(写明ATCC 10231)。

采用琼脂盘扩散法，按照国家临床实验室标准委员会(ncls, 1997)的指南对该化合物的抗菌活性进行评估。细菌悬液调整至0.5麦克法兰(最终细菌浓度为1-2 × 10)⁸CFU /毫升),除了白色念珠菌在那里测试的悬挂是2.2麦克法兰。用无菌棉签接种Mueller-Hinton和Sabouraud琼脂平板。在DMSO中制备了评价化合物的原液。无菌Whatman 1号滤纸盘(直径6 mm)浸渍了试验化合物的DMSO溶液，分布在接种了细菌悬液的平板表面。37℃孵育24 h。抑制带直径以毫米表示。作为对照，我们使用庆大霉素(10μG)杆菌和葡萄球菌，庆大霉素(120μG)链球菌、肠球菌和氟康唑(25μg） 为了假丝酵母．抗菌药物和抑菌剂的抑菌范围为16 ~ 19 mm。

２.４.统计数据

对所有细菌菌株和真菌进行了重复试验。结果以平均值±SD表示。关于细胞毒性活性的试验以一式三份进行。结果以平均值±SEM表示。使用单向方差分析试验，然后使用Bonferroni和Dunnett's进行组间比较事后测试。一个≤0.05为有统计学意义。

3.结果

3.1.细胞毒性研究

如图所示2在美国，应用EM2对两种细胞株B164A5均产生了显著的剂量依赖性抑制作用(图)2 (b))和A375电池（图2(一个)）.MTT细胞毒性实验表明，EM2对A375和B164A5细胞的生长有抑制作用。在这两种细胞系中，化合物诱导了浓度依赖性的细胞毒性效应。在50和100时，该效应与B164A5细胞系有统计学相关性μ米(和，和Ctrl)，而A375细胞系仅在100μ米(与Ctrl）.

以1 -吸光度样品计算抑制指数/吸光度样品空白。

３．２．关于抗菌和抗真菌作用的研究

EM2（10 mM）显示出显著的抗细菌活性酿脓链球菌(图3.）.抗菌药物和抗真菌药物的抑制区在16 ~ 19 mm之间。在EM2存在时，抑制区为酿脓链球菌是 因此，与抗生素相比，该植物化学化合物具有更好的效果金黄色葡萄球菌抑制区为13±0.19 EM2对图中所示的其他菌株均未显示抗菌效果3.或抗真菌活性白色念珠菌．使用的浓度(10mm)是根据我们以前的剂量滴定实验(未发表的数据)的结果选择的。

4.讨论

本文的主要发现是山楂酸衍生物对B164A5小鼠黑色素瘤细胞和A375人类恶性黑色素瘤细胞分别具有细胞毒性。这一观察结果与René Csuk组的研究结果一致，因为MA和EM2在518A2人黑色素瘤细胞系中的细胞毒活性此前已有报道[5]．对于518A2细胞，MA有IC₅₀数值为13.7±0.9 μM，而该衍生物毒性很强，具有IC₅₀值为1.5±0.2μ在非恶性小鼠成纤维细胞(NiH 3T3细胞系)上测试时，IC₅₀显著增加，即33.8±3.0 μM.作者假设EM2被证明是一种有前途的化学预防和化学治疗药物，以对抗人类黑色素瘤[5]．此外，这些作者还表明，EM2对其他多种恶性细胞株，即A2780、8505C、A549、HT29、MCF7、DLD1、SW1736和Lipo(人脂肪肉瘤)均有效[5]．

的在体外MA的细胞毒性活性已经在几种类型的癌症中进行了系统的探索，包括人类结直肠癌(Ht-29和Caco-2细胞系)[17，18]、胰腺癌(Panc-28细胞)[19，人唾液腺腺样囊性癌(ACC-2和ACC-M细胞系)[20]、软组织肉瘤(SW982和SK-UT-1) [21，人肝细胞癌(HepG2细胞)[22和人乳腺腺癌(MCF-7细胞系)[23(在[1])。Parra等人获得的几种山楂酸衍生物可诱导B16F10小鼠黑色素瘤细胞系凋亡。这些作者认为，与MA相比，衍生物的活性增加是由于C-28位置的结构变化[6]．此外，有报道称MA对SK-MEL-2人黑色素瘤细胞系增殖有抑制作用[24]．

我们承认单剂量使用EM2是本研究的一个主要局限性。因此，即使在较低的浓度下，也不能排除可能在人类细胞系中具有细胞毒性的刺激行为，并需要进一步的研究。

关于抗菌效果，我们发现了对酿脓链球菌和温和的效果对抗金黄色葡萄球菌,而没有观察到活动粪大肠杆菌，大肠杆菌，和绿脓杆菌。植物化学物质，如齐墩果酸和熊果酸，属于同一组五环三萜类，已被报道具有抗菌、抗病毒和抗原生动物作用[25]．Chouaïb等人评价了山楂酸和齐墩果酸酯的抗菌活性，并指出含有额外的硫和氯取代基的化合物具有抗菌活性金黄色葡萄球菌、粪大肠杆菌、大肠杆菌，和铜绿假单胞菌［12]．Kreander等人测试了天然化合物及其合成衍生物对红霉素耐药的菌株酿脓链球菌和葡萄球菌simulans并假设熊果酸对这些细菌菌株有活性[26]．我们的数据与后一组的结果一致，因为EM2对酿脓链球菌．

在过去的几十年里，由于难以预测的细菌突变，许多菌株产生了耐药性;据估计，越来越多的细菌会对普通抗生素产生耐药性(无论其作用机制如何)[11，27]．然而，联合大谱抗生素治疗，克服细菌耐药性的选择方案[28，具有累积副作用的风险，特别是耳毒性(链霉素)[29]、克罗恩病(四环素)、心血管心律失常和听力丧失(阿奇霉素)发病率增加[30等等。

21世纪的研究揭示了大量的纯天然化合物或总提取物的治疗活动。在这方面，五环三萜类化合物具有几种有价值的作用，包括抗菌活性[12]．

5.结论

综上所述，马斯林酸衍生物EM2是一种很有前途的抗菌化合物，主要用于对抗球菌感染。此外，该化合物还对B164A5小鼠黑色素瘤和A375人黑色素瘤细胞株产生剂量依赖性细胞毒作用。EM2的细胞毒作用及其潜在机制将进一步研究在体内小鼠皮肤癌实验模型。

相互竞争的利益

作者声明，本论文的发表不存在利益冲突。

致谢

这项工作得到了PII-C4-TC-2016大学青年研究基金(Ioana Zinuca Pavel)和ScienceCampus Halle (W13004216 to René Csuk)的支持。

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