光声流式细胞术检测单镰状细胞在体外和在活的有机体内

摘要

镰状细胞病(SCD)的阶段控制和治疗效率仍需耗费大量时间，这使得SCD危机的及时预防十分困难。我们在这里展示在活的有机体内光声(PA)流式细胞术(PAFC)具有实时监测小鼠模型镰状细胞的潜力。在活的有机体内数据经在体外对表达scd相关血红蛋白(HbS)的镰状红细胞(sRBCs)与正常红细胞(nRBCs)进行PAFC、光热(PT)和PA光谱成像。我们发现srbc的PT和PA信号幅值在线性模式下比nrbc低2 - 4倍。PT和PA成像显示，srbc比nrbc的血红蛋白空间异质性更深刻，这可能与HbS团簇的存在与高局部吸收有关。通过在过热HbS簇周围形成纳米气泡并伴有空间选择性信号放大的非线性模式证实了这一假设。srbc的吸收比nrbc的差异更大，导致作为SCD指标的PA信号波动(波动PAFC模式)显著增加。所获得的数据表明，无创无标记波动PAFC具有实时计数srbc的潜力在体外和在活的有机体内．

1.介绍

镰状细胞病(SCD)是一种遗传性血液疾病，由DNA中的单个基因突变引起，导致异常血红蛋白(HbS)而不是正常血红蛋白(HbA)的产生[1- - - - - -6］．这一过程伴随着正常红细胞(nrbc)从典型的中心平坦的双凹形转化为异常畸形的镰状，这里称为镰状或镰状红细胞(srbc)。这些细长的刚性细胞可阻塞微血管，导致梗死。脱氧HbS可在红细胞内沉淀聚合，从而增强红细胞的镰状化[7］．SCD的表现包括无症状或危及生命的情况[2，3.］．干细胞移植和基因治疗有望治愈SCD [3.，4］．SCD诊断包括高效液相色谱法、电泳法、质谱法和临床定量检测等已建立良好的基础[8- - - - - -11］．然而，这些方法大多数都是耗时的，不能用于实时监测治疗效率，也不能用于下床预测伴有急性衰弱性疼痛的血管闭锁发作(危象)或某些中风病例(尤其是儿童)[10，11］．SCD危机的大多数时期都是不可预测的。因此，寻找控制SCD分期和治疗效率的诊断方法仍在继续。

我们提出了一种识别和枚举srbc的可能的解决方案在体外和在活的有机体内是利用光热(PT)和光声(PA)流式细胞术(PTFC/PAFC)和显微镜(PTM/PAM)原理。这些技术是基于探测吸收的能量分别通过非辐射弛豫转化为热量和伴随声波[12- - - - - -16］．特别是巨大的潜力和安全性在活的有机体内PAFC已经在许多应用中得到证明，包括检测和计数循环的nrbc、肿瘤细胞(CTCs)、细菌、纳米颗粒和最近的疟疾寄生虫，其敏感性比现有方法高出1000倍[17- - - - - -23］．一个临床在活的有机体内基于pafc的设备已经证明了在黑色素瘤患者血液中直接检测CTC的无标记检测，300毫升血液中检测一个CTC的限度比CTC检测法高出约100倍体外［22］．PTM和PAM在非荧光细胞、染料和纳米颗粒的高分辨率和超分辨率成像方面也显示出巨大的潜力[17- - - - - -21］．然而，在探索PT和PA技术用于基础和临床scd相关研究的潜力方面进展甚微。我们在这里证明，这些技术可以利用PT和PA信号参数对srbc的光学和形态学特征的依赖来检测和识别srbc。

2.材料和方法

2．1．PT和PA技术的原理

HbS集群的srbc与使用HbA的nrbc的区别在活的有机体内PAFC是基于激光脉冲对选定血管的照射(图)1)，然后检测线性(图1 (b))，尤其是非线性的(图1 (c))将超声波换能器置于皮肤靠近激光束处的声波[22］．镰状细胞可能形成密度足够大的HbS团簇，导致局部过热并形成纳米级气泡。来自这些细胞的PA信号的非线性增强，表现为瞬态高振幅PA信号，即使存在其他细胞内HbS分布均匀的srbc，也可以检测到细胞镰状化。采用PT显微技术对细胞内Hb分布进行高分辨率成像，并使用双激光器(泵浦探针)探测单个细胞。探测光束感知泵浦光束引起的介质折射率变化(热透镜模式)[12，17，18］．

2．2．集成PTM和PAM平台

光谱PTM和PAM在Olympus IX81倒置显微镜平台(Olympus America, Center Valley, PA)上进行集成。PT和PA光谱由可调谐光学参量振荡器(OPO, Opolette HR 355 LD, OPOTEK, Inc.， Carlsbad, CA)获得[17］．成像系统是基于一对XY转向galvo镜(6215H, Cambridge Technologies, Lexington, MA)从脉冲激光(波长，532 nm;脉冲宽度，5纳秒;脉冲重复频率，1-10 kHz;LUCE, Bright Solutions，意大利)。采用波长为660 nm的连续波(CW)激光二极管(Power Technology, Alexander, AR)作为PT模式的探测光束，以控制泵浦光引起的折射率变化(图)2(一个)）.使用60倍物镜(DPlan 60, Olympus, Inc.)将两束激光聚焦到样品中。样品后用第二个浸入式100倍物镜(LUMPlanFl 100, NA 1.00, Olympus, Inc.)采集探针束。使用快速光电二极管(PDA10A, Thorlabs Inc.)检测探针光束的散焦。测量探针光束强度变化，获得透射图像。利用ImageJ软件，将采集到的PT图像叠加在一起，进行吸收剖面的三维重建-轴通过移动聚焦物镜0.1μ米的步骤。在PA光谱和成像模式中，激光束通过10倍物镜(Plan Achromat, 0.25 NA, Olympus, Inc)聚焦，声波通过聚焦超声换能器(V316-SM, 20 MHz;焦距:12mm, Olympus NDT, Waltham, MA)放置在显微镜载玻片上在体外或鼠标耳朵在活的有机体内(图2 (b)）.PA信号预放大(放大器模型，AG-2010, ONDA Corp.， Sunnyvale, CA)并记录。将PA信号归一化为OPO脉冲能量，计算出样本的PA图像和光谱。采用高速模数转换板(PCI-5124，美国国家仪器公司)和定制软件(LabVIEW，美国国家仪器公司)来获取PA和PT模式下的信号。

2．3.在体外和在活的有机体内流式细胞术(PAFC)

PAFC在其他地方有详细描述[22］．PAFC系统采用波长分别为532 nm和820 nm的高脉冲重复频率激光器(LUCE 532和LUCE 820, Bright Solutions)。使用3.5 MHz超声换能器(Imasonic Inc.， Besancon, France)检测声波。然后将电信号放大，并如上所述记录下来。

在体外用532 nm激光在PBS稀释至1:10的柠檬酸钠稳定血样中检测单个RBC⁴保证检测体积中单个细胞的存在，避免时间信号重叠。样品被泵入50个孔μ以1 mm/s的流速对石英毛细管进行检测，然后通过毛细管壁进行声波检测。在活的有机体内40-60例患者直接行PAFCμ820nm激光照射麻醉小鼠耳静脉。

２.４.动物模型

在活的有机体内实验涉及裸鼠(nu/nu)、黑色C57BL/6小鼠和表达人镰状血红蛋白的转基因小鼠(STOCK Hbatm1Paz Hbbtm1Tow Tg[HBA-HBBs]41Paz/J小鼠[Berkeley小鼠])，又称SCD小鼠。所有的研究都是按照阿肯色医科大学动物护理和使用委员会批准的协议进行的。动物用异氟醚(1.5%纯氧)麻醉，并置于温度控制阶段(37°C)。我们为每个动物选择合适的血管(50-70μm-in-diameter耳静脉)。将激光束置于血管上方，记录PA信号轨迹至少10分钟。通过逐级增加激光能量，从血管中获取非线性PA信号。在每一级激光能量下记录1分钟的信号轨迹。为了证明PA检测HbS的可行性，~100μ裸鼠静脉注射L型SCD小鼠全血，记录PA信号迹线变化达20 min。为了通过HbS在SCD小鼠缺氧红细胞中的聚合来增强srbc的存在，我们通过异氟醚浓度从1.5%逐渐增加到4-5%水平来触发选定小鼠的缺氧。高麻醉浓度可降低血压[24］．在5%异氟醚浓度下2-3分钟后，血流速度通常下降到完全停止。通过观察小鼠的非线性PA信号，异氟烷浓度恢复到正常水平，恢复血流。

2．5．血液样本的制备在体外

从SCD小鼠尾静脉采集全血，用3.2%柠檬酸钠稳定。在直径35 mm的玻璃底皿中，用甲醇固定血液涂片。对于紫外-可见光谱分析，通过溶解Hb粉(H0392和H0267，分别用于镰状和正常Hb, Sigma-Aldrich, Co.， St. Louis, MO)制备具有生理相关总Hb浓度(110-160 g/L)的Hb溶液。为了进行光谱分析，所有血液样本通过样管的平缓倒置进行氧合10分钟。使用光学吸收光谱和现有参考光谱对血液氧化进行了验证[25］．为了证明光谱变化的显著性或不显著性，将每个样品的测试光谱的差异与这些条件下的误差之和进行比较。

在俄罗斯莫斯科国立大学(MSU)基础医学系的健康志愿者血样中稳定了3.2%的柠檬酸钠。所有实验均获得密歇根州立大学IRB委员会批准。

3.结果

3．1.血红蛋白亚型的PA光谱分析

我们对表达人类HbS的健康对照和转基因SCD小鼠的Hb溶液和血液进行了常规光学光度/吸收测量。与含氧Hb (HbO)的参比光谱进行比较₂)显示，在所有示例中，HbO的内容₂增长了90%。实验数据(图3(一个))表明，裸鼠血、含HbS血和人血的光谱具有很好的一致性，与作为参考的人血光谱的平均偏差小于2%。样本总光吸收率的差异与健康和SCD血液的不同红细胞压积水平有关[26];因此，将吸收光谱归一化以作进一步比较。此外，我们在相对较低的能量注量(20 mJ/cm)下，在线性PAM模式下获得了PA谱²)，以避免在更大的样本中平均HbA和HbS，并尽量减少光散射对细胞的影响。正常血红蛋白和SCD血红蛋白的PA谱与测量的HbO吸收谱吻合良好₂与氧合血红蛋白谱(图3 (b))，根据先前公布的HbA和HbS光谱[25］．因此，HbA、HbS和PA单细胞的常规吸收光谱除了部分测量光谱范围在590-660 nm有细微差异外，没有显著差异。然而，这一特征在现阶段还不足以用于srbc的光谱识别，需要在未来进行进一步的验证。

3．2．正常和镰状细胞的高分辨率PT成像

共焦PTM成像[17是唯一适用于定位活红细胞胞内血红蛋白分布的方法。正如我们之前演示的，传统透射显微镜可能会受到光散射伪影和低吸收灵敏度的阻碍[12，17由于单细胞的光路较短。PT图像没有光散射效应(图)4(一)和4 (b)）.高分辨率共聚焦PTM显示了高分辨率(0.3-0.5)的能力μm)在玻璃表面成像活srbc在体外不使用任何诱捕或细胞固定技术。PT数据显示，存在伸长的HbS簇，主要沿着细胞主轴方向(图)4 (b)）.nrbc和srbc PT信号三维重建(图4 (c))证实HbS在srbc中紧密凝聚，出现HbS簇，局部吸收高于细胞内背景。由于PT信号振幅与细胞吸收成正比，因此所示3D图像(图4 (c))反映细胞吸收分布。因此，细胞内吸收分布的PT映射揭示了srbc中更深刻的非均质吸收谱，尤其是镰状细胞。然而，在低激光能量通量下，全细胞线性模式下平均PT信号显示，srbc的波幅明显低于nRBC(2 - 4倍)(图)4 (d))表明srbc中Hb含量较低。圆形和镰状srbc的PT信号幅值差异不显著;然而，在某些情况下，镰刀状srbc的信号幅度略低。

3．3.正常和镰状细胞的非线性PA成像在体外

在srbc中发现了具有高局部吸收的HbS团簇，这使得我们假设HbS团簇的空间选择性激光过热可以产生纳米气泡作为PA信号放大器[27仅围绕HbS集群。因此，尽管srbc的平均吸收较低，但纳米气泡可以显著提高PA信号的振幅高于nrbc背景，从而使在非线性模式下选择性PA检测srbc成为可能。为了验证这一假设，我们获得了nrbc和srbc的初始线性PA图像(图)5(一个)和5 (b))，与线性PT图像非常相似(图4(一)和4 (b)）.他们发现许多细胞呈不正常的镰状。为了估计激光能量在非线性模式下的影响，我们测量了单个细胞的PA信号振幅作为nrbc、圆形和镰状srbc的激光能量通量的函数(图)5 (c)）.所有nrbc和部分圆形镰状srbc均能提供600 ~ 800 mJ/cm能量通量的线性PA信号²在532 nm波长处，srbc的PA信号振幅低于nrbc，这与PT数据一致(图)4 (d)）.然而，当能量通量超过200 mJ/cm时，一些具有不对称镰刀状形状的srbc的PA信号振幅出现了显著的非线性增加²(图5 (c)）.平均而言，镰刀状的srbc表现出3 - 5倍的信号增强，这使得它们可以在附近的圆形srbc和nrbc中被检测到(图)5 (d)）.重要的是，在检测后，细胞在视觉上保持完整。非线性PA效应在实验期间和实验后30分钟均未对细胞膜造成损伤。

3．4．在体外正常和镰状细胞的PAFC

为了证实上述结果，我们使用正常小鼠和SCD小鼠的血液样本进行分析在体外PAFC以1 mm/s的流速在50μ米直径。由于正常血浓度下单个红细胞的PA信号存在时间上的重叠，血液样本被依次稀释，检测体积中细胞数量减少，导致PA信号的平均背景降低，背景波动增大(图)6(a))。在高度稀释的血液样本中，我们观察到瞬时PA信号高于噪声，对应于单个细胞通过检测区。稀释样品超过10⁴降低了PA背景和峰值数量，但峰值振幅没有降低，证实了单个细胞的检测。在这些条件下，健康小鼠单个nRBC的PA信号幅值(图)6(b)和6(c))比SCD小鼠高2-3倍(图6(d)和6(c))确认了之前的PT(图4 (d))和PA(图5 (c))图像数据。这一发现表明健康小鼠每个细胞的总Hb含量较高，至少有可能鉴定出srbc在体外基于信号幅值的分析。

3．5．在活的有机体内循环镰状细胞的PAFC监测

比较PAFC数据在体外和在活的有机体内，监测耳静脉PA信号(50-70μ在健康和SCD小鼠中。在激光能量增加和血管参数相似的情况下，我们观察到三种现象:(1)SCD小鼠的血管PA背景信号降低，(2)SCD小鼠PA背景信号波动更强，(3)相对较高激光能量下SCD小鼠PA信号出现瞬态峰值(图)7(一)）.这些发现与我们的PT和PA数据一致在体外分别显示单个srbc的PA信号幅值更低，PA信号幅值分布更异质，镰状rbc的PA信号放大非线性(图)4 (d)，5 (c)，5 (d)，6(b),6(d)6(c))。使用820 nm波长的高脉冲重复率(10 kHz)激光来评估近红外(NIR)激光与532 nm激光相比的临床透视深度。此外，在820 nm的近红外范围内，血氧作用对PA信号没有影响，如Hb和HbO₂有相似的吸收水平虽然SCD小鼠与裸鼠相比，皮肤色素可能导致PA背景升高，但类似血管的PA信号高于皮肤，可以观察到血管相关现象，而不受皮肤色素沉着的强烈影响。我们强调，在相对较高的能量通量300-400 mJ/cm²，我们在SCD小鼠中观察到PA背景波动增强和PA瞬态峰(图7(一)在健康小鼠中没有观察到(图中)7(一)(左)。这些信号可能与先前在HbS簇中发现的PA信号的非线性放大有关。观察30 ~ 40 min后未见组织或血管损伤。

为了验证这些发现，在与之前研究相同的条件下，100μ将取自SCD小鼠的L血直接注射到健康小鼠的血液循环中。我们观察到瞬时PA峰值高于先前PA信号轨迹中没有的噪声(图)7 (b)）.这些PA峰值仅在注射后持续3-10分钟，表明它们在健康小鼠中快速清除。我们还对对照组C57BL/6小鼠进行了PA检测，这些小鼠的皮肤也有色素，基因构成与SCD小鼠相似，但不表达HbS。对C57BL/6小鼠进行PA检测(图7 (c))与从对照裸鼠获得的相似(图7(一))，并无瞬态PA信号。

为了证明PA监测SCD疾病早期表现的可行性，我们通过使用更高浓度的麻醉药物(异氟醚)降低小鼠血液氧合以增强HbS聚合，从而导致更多的镰状srbc和HbS聚类。异氟醚的浓度从典型的1.5%增加到4-5%(图)7 (c)和7 (d))，足以显著降低呼吸频率和血流压。避免使用5%异氟醚超过5分钟，因为它会使呼吸缓慢到足以通过缺氧导致死亡。在~4%的麻醉浓度下，SCD小鼠只观察到短暂的PA信号，而健康小鼠即使在5%的麻醉浓度下也没有观察到峰值(直到静脉血流完全终止)。在异氟烷浓度降至正常水平(1.1-1.5%)后，SCD小鼠可检测到非线性瞬时PA信号，这证实了即使在恢复氧气供应后，某些细胞的HbS解聚也是缓慢的。对于健康和SCD小鼠，麻醉浓度增加超过3.5%会导致血流速度下降和血管直径减小。在高异氟烷浓度下，血管直径的减小和血液缺氧导致血管PA信号的减少。在许多情况下，与正常小鼠相比，SCD小鼠中PA信号痕迹的波动更高，从而证实了“波动”PAFC区分SCD疾病的能力。

4.讨论

在这项工作中，我们首次证明了PT和PA技术的光谱、成像和细胞图谱和模式可以在线性和非线性模式下在nrbc中识别圆形和镰状srbc。我们还显示了直接在血流中监测红细胞中HbS聚合的无创PA监测的可能性。本研究选择小鼠耳静脉作为最佳动物模型μ米)的皮肤层。如预期，正常细胞和镰状细胞(nrbc和srbc)的大小和形状不同(图)4和5）.其中，nrbc平均呈对称的双凹形，平均直径约为6.8μ与多细胞的nrbc相比，srbc的对称性较差，由对称双凹向不对称镰状转变，平均直径为7.8μm.在许多样品中，我们还观察到srbc之间的介质中存在背景PA信号，这在nrbc样品中没有观察到，这可能是由于srbc释放HbS(例如，由于特定的膜特性或局部膜损伤)。

SCD小鼠模型中许多浓度为10%的镰刀状srbc的信号增强可达5 - 10倍(图)5 (c)）.这种PA信号放大为在圆形srbc甚至nrbc中选择性检测镰状srbc提供了机会在活的有机体内通过监测增强的PA信号背景波动和PA信号瞬态峰值的出现(图)7(一)- - - - - -7 (d)）.例如，非线性PAFC对激光能量的要求较高，可能略高于激光安全标准水平。这可能会导致含有Hb簇的红细胞受损。然而，镰状srbc的空化增强PA信号通常是非常局部的(在几百纳米以内)，不一定会损害细胞。降低激光注量的一个潜在解决方案是使用皮秒或亚纳秒(200-600 ps)激光脉冲更有效地从聚集的HbS产生非线性PA信号[27］．在当前纳秒(10 - 30 ns)范围内，我们使用临床应用的820 nm波长的高脉冲重复率(10 kHz)激光，没有观察到任何组织或血管损伤。高脉冲重复率通过对PA信号的平均提高了PAFC的灵敏度。

在活的有机体内srbc的检测为SCD疾病的诊断和监测开辟了新的前景，特别是在刚性srbc阻塞小血管期间预测和潜在预防SCD危机发作(图)1(一)由well-therapy)。具体来说，PAFC技术可以为用药或输血提供早期预警和/或指示，并可以控制这些程序的效率。在临床环境中，PA技术可以在人耳、手和甲床中容易接近的毛细血管上进行[28］．微血管床的镰状细胞比静脉血具有更高的预测价值。在这种情况下，PA成像系统可以提供一个大视野，同时检测多个毛细血管床的细胞。需要进一步的研究来确保PAFC系统能够区分单个sRBC与sRBC簇或nRBC聚集物。

利用吸收特征对HbS和HbA的光谱识别仍在争论中[29，30.］．在目前的研究中，单细胞的PA光谱证实了nrbc的吸光度与srbc的吸光度非常接近。从血液样本和血红蛋白溶液中获得的大多数光谱非常接近，至少在可见光谱范围内，用PA光谱数据区分血红蛋白的形式有一点可能性在活的有机体内．

然而，srbc内Hb的聚合为通过监测细胞形状和/或分析单个细胞内Hb分布来识别srbc打开了一个前景。通过简单的细胞形状分析，无需样品制备，可简化床边测试。我们证实了之前的发现[18，22]，红细胞PA信号的高度空间异质性可以作为Hb聚类的指标。与传统的光学显微镜相比，PT和PA成像具有更高的灵敏度，允许快速筛选，以可视化的形状和大小的红细胞在快速流动。之前，我们使用单脉冲PT显微镜演示了细胞的高速PT成像[20.能显示细胞在流动中的血红蛋白含量在活的有机体内和在体外速度可达每秒2米。

PT和PA显微镜绘制血红蛋白在单个红细胞中的吸收分布的能力可以用来研究血红蛋白的聚合在活的有机体内在亚细胞水平上。使用我们的超越衍射极限的新型PT寿命成像(尺寸依赖的PT信号形状反映了样品中的冷却时间和传热)，我们之前演示了在活体红细胞中50 - 300 nm大小的局部Hb簇的PT成像和分辨率[12］．在这里，我们表明，PT数据确实可以用来建立一个模型的Hb团簇在srbc研究Hb聚合。高分辨率共聚焦PT显微镜显示，在活srbc内部，HbS形成密集的聚集。因此，这种和类似的技术可以被认为是新的研究工具，为SCD疾病进展以及单个细胞属性(如机械和化学)与细胞内Hb组装的相关性提供见解。此外，使用不同激光波长的多色PT和PA成像可以提供关于Hb的氧合和组成(例如，间位、羧基和亚硝基)的额外数据。如前所述，我们发现HbS的聚合会增加srbc中的非线性PA信号，而不会增加nrbc中的非线性PA信号。这与之前在黑色素瘤细胞中发现的与纳米泡相关的非线性PA信号放大相似[27]以及最近在疟原虫感染的红细胞中发现的疟原虫素群集[23］．我们目前的发现表明，当nrbc只产生线性PA信号时，srbc中的PA信号发生非线性放大。

PAFC技术的进一步改进可以通过细胞在血流中直接聚焦实现[31排除高srbc浓度下的PA信号重叠或PAFC与皮肤光学清除程序结合，以减少因光散射现象在组织中的激光能量损失数倍[28］．最近，我们测试了一种便携式手戴PAFC原型，该原型带有小型高脉冲率激光器，可用于无创、无标记的SCD疾病控制阶段(见[28])。

我们不得不提到选定的动物模型的一些缺点。首先，我们使用SCD纯合子模型进行了概念验证实验。在纯合子模型中，发现具有高非线性PA对比的Hb簇的几率显著高于半合子模型，但这种模型不能很好地代表人类特征。因此，在使用本文选择的小鼠模型优化PA检测后，更加关注临床相关的半合子模型将是必要的。其次，大多数对照实验都是在裸鼠身上进行的，这与SCD模型不同。更广泛地使用与SCD小鼠基因组成相似的小鼠，可能提供更多的信息，以了解PA检测的敏感性和假阳性结果的存在。最后，在模型系统中获得的生物学数据可能会受到总血红蛋白和红细胞压积水平的影响。在这种情况下，srbc镰状化和PA检测的条件都将改变。

综上所述，我们认为可以设计一种简单、低成本的基于微芯片的系统来进行这种筛选，使用紧凑的激光源和类似手机的相机来检测srbc的PT和PA信号。这可能会简化发展中国家的SCD诊断，因为在这些国家还没有检测HbS的临床基础，而且基因检测的高成本阻碍了它们的应用。

相互竞争的利益

作者声明，本手稿的出版没有任何利益冲突。

致谢

这项工作得到了美国国家卫生研究所(拨款R01CA131164和R01EB009230)、美国国家科学基金会(拨款DB-155606085和OIA-1457888)以及俄罗斯基础研究基金会(拨款14-04-01361a和16-03-01089a)的部分支持。阿肯色州医学科学大学，小石城，美国)。

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